CN104535771A - 一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒、制备及其检测方法，所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒包括：鼠抗人HNP单克隆抗体包被酶标板、HNP蛋白冻干标准品、兔抗人HNP多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体、标准品稀释液、样品稀释液、25倍浓洗涤缓冲液、抗体稀释液、TMB显色液和酶反应终止液；将α防御素与载体蛋白偶联，采取最佳偶联结合比的偶联复合物(HNP∶SPDP∶小鼠血清白蛋白的摩尔比为1∶5∶1，HNP∶SPDP∶兔血清白蛋白的摩尔比为1∶5∶1)，用此完全抗原制备得到较高灵敏度的抗体，并用得到的抗体组装出试剂盒；本发明所述试剂盒具有检测灵敏度高、结果准确、检测范围宽、操作简单便捷、保存时间久等优点。

Description

一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒
技术领域
本发明涉及涉及生物技术领域，特别涉及一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒、制备与检测方法。
背景技术
防御素蛋白肽(Defensins)属于抗菌肽家族，广泛存在于包括植物、无脊椎动物和脊椎动物在内的多种生物体。防御素蛋白肽均为分子量2-6kDa的阳离子小分子短肽，含保守的6个半胱氨酸残基，形成3个典型的分子内二硫键，分为α-防御素和13-防御素两大类。α-防御素主要存在于人类嗜中性粒细胞的嗜天青颗粒中，亦被称为人类嗜中性粒细胞肽(Human neutropholpeptides，HNP)。人类嗜中性粒细胞防御素主要有3种，即HNP1、HNP2和HNP3，具有促进中性粒细胞趋化、增强巨噬细胞吞噬功能、调节补体活性、刺激炎性因子的表达与释放，以及趋化树突状细胞和T细胞等生物学作用，在机体的天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥非常重要的作用。大量研究表明，α防御素蛋白表达异常或功能受损与各种感染免疫性疾病(如重症脓毒症和炎症性肠病等)的发生发展密切相关，并且在败血症、肺炎、慢性阻塞性肺病等多种疾病的发病和调节中起了关键性的作用。临床研究证明，α防御素(HNP)的水平与上述疾病的病情进展、严重程度及预后密切相关，可以发展为新的临床诊断与病情监测指标。
现在检测HNP的方法主要有免疫组化法、免疫印迹(Western blot)及酶联免疫吸附测定方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。各种方法相互验证，同时又存在灵敏度、专业性、设施设备条件及成本的影响。目前，以血清学反应原理为基础的ELISA方法是被广泛接受和推广的方法。与其他检测方法相比，ELISA检测方法具有成本低、检测设备简单、快速高效等优点，并在不断改进过程中，形成了竞争ELISA，非竞争ELISA，单抗体ELISA、微波ELISA以及双抗体夹心ELISA方法。目前，市售的检测HNP的双抗夹心试剂盒，普遍存在检测范围窄、灵敏度低、价格昂贵等缺点。而制备该种试剂盒的关键，是得到良好的包被抗体和检测抗体。包被抗体以及检测抗体的灵敏度决定了双抗夹心试剂盒的检测范围及灵敏度。
因此，研制高灵敏度的人类嗜中性粒细胞α防御素单克隆以及多克隆抗体，对于组装一款灵敏度高、范围宽、操作简单便捷的人类嗜中性粒细胞α防御素多肽检测试剂盒具有重要意义。
本发明使用天然防御素偶联白蛋白来免疫，可得到比较优异的兔多抗和鼠单抗，并组装成试剂盒，灵敏度和精确度都有显著提高。
发明内容
鉴于现有技术所存在的检测成本高、检测范围窄，灵敏度低等问题，本发明提供一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，所述检测试剂盒使用了优质的多克隆抗体和单克隆抗体，具有检测灵敏度高、检测范围宽、操作简单便捷等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒(全称为″人类嗜中性粒细胞α防御素多肽(HNP)酶联免疫吸附试剂盒”)，包括：酶标板、HNP蛋白冻干标准品、兔多克隆抗体、酶标二抗、标准品稀释液、25倍浓洗涤缓冲液、抗体稀释液、TMB显色液、终止液；
所述酶标板为鼠抗人HNP单克隆抗体包被的酶标板，所述鼠抗人HNP单克隆抗体的包被浓度1μg/mL；
所述HNP蛋白冻干标准品从病人痰液中提取并纯化冻干后获得，使用前稀释成不同浓度，10000pg/mL、4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256、102、41pg/mL；所述稀释时间为使用前15min；
所述兔多克隆抗体为兔抗人HNP多克隆抗体(初始浓度为0.2mg/mL，使用浓度为0.2μg/mL)；
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体；
所述标准品稀释液为20g/L BSA、0.2g/L KH2PO4、0.2g/L KCl、2.9g/L Na2HPO4·12H2O、8g/L NaCl水溶液；
所述样品稀释液为0.2g/L KH2PO4、0.2g/L KCl、2.9g/LNa2HPO4·12H2O、8g/L NaCl水溶液；
所述25倍浓洗涤缓冲液为5g/L KH2PO4、5g/L KCl、72.5g/LNa2HPO4·12H2O、200g/L NaCl、体积分数1.25％Tween-20的水溶液，临用前用纯净水稀释25倍，得到洗涤缓冲液，现配现用；
所述抗体稀释液含有20g/L BSA、1g/L Tris、0.2mL质量分数为1％硫柳汞、8g/L NaCl水溶液；
所述质量分数1％的硫柳汞溶液含有10g/L硫柳汞，并且所述质量分数1％的硫柳汞溶液中丙酮的体积分数10％、乙醇的体积分数为50％；
所述酶反应终止液为2mol/L H2SO4水溶液。
本发明所述的人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的检测范围为41～10000pg/mL。
一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)样本的采集及保存：收集标本如血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等，置于2～8℃保存，若超过48h或更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存；血清、血浆至少作1∶5稀释(例如，取50μL样品，加样本稀释液200μL，即为稀释5倍)；
2)准备不同浓度HNP蛋白标准液：将10ng HNP蛋白标准品冻干粉用1mL标准品稀释液稀释成10000pg/mL，进一步依次以2.5倍倍比稀释成不同浓度：4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256pg/mL、102pg/mL、41pg/mL；
3)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的HNP蛋白标准液，空白孔加100μL标准品稀释液；佘孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，室温反应60min；
4)弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300μL/孔；
5)每孔加100μL兔抗人HNP多克隆抗体，室温反应60min；
6)弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300μL/孔；
7)每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体100μL，室温反应60min，用洗涤缓冲液洗板6次；
8)依次每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色15-30min；
9)依次每孔加终止液50μL，终止反应；
10)用酶标仪读取450nm波长处吸光度(OD值)；
11)计算样品中HNP浓度：以各标准品的OD值减去空白对照OD值后的净OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制出标准曲线(7点图)并以此计算出标准曲线的直线回归方程。将样品的OD值代入方程式，计算出样品中HNP浓度，再乘以稀释倍数即为样品中HNP的实际浓度。
一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒制备方法，包括以下步骤：
1)从病人痰液中提取HNP蛋白，冷冻干燥，最大限度的保留HNP蛋白的天然结构及活性，得到HNP蛋白标准品冻干粉；
2)制备HNP完全抗原：
a)将步骤1)获得的HNP蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、小鼠血清白蛋白(MSA)分别与SPDP(即3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的无水乙醇溶液)偶联：取4mg步骤1获得的HNP蛋白分别溶于2.5mL PB缓冲体系中(0.5mmol/L，pH 7.5，含0.1mol/LNaCl)，迅速向内滴入1.256mg SPDP(用0.4mL无水乙醇溶解)，室温下搅拌0.5h(在磁力搅拌器上进行)，缓慢加入终浓度为25mmol/L DTT(将HNP上的DTP基还原成巯基)，室温下搅拌0.5h，得到HNP-SPDP偶联产物。另取5mg RSA(或39mg MSA)与SPDP按以上方法交联，此法分别得到RSA-SPDP偶联产物和MSA-SPDP偶联产物；
b)制备HNP-RSA溶液和HNP-MSA溶液：
制备兔HNP完全抗原：将HNP-SPDP偶联产物与SPDP-RSA偶联产物按照1∶1体积比混合；将上述混合溶液置于4℃条件下反应20h，用pH为7.5的0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，得到HNP-SDPD-RSA溶液，-20℃保存备用；所述HNP∶SPDP∶RSA的摩尔比为1∶5∶1；
利用同样的方法制备小鼠HNP完全抗原：将HNP-SPDP偶联产物与HNP-MSA偶联产物按照1∶1体积比混合；将上述混合溶液分别置于4℃条件下反应20h，用pH为7.5的0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，得到HNP-SDPD-MSA溶液，-20℃保存备用；所述HNP∶SPDP∶MSA的摩尔比为1∶5∶1；
3)制备抗人HNP兔多克隆抗体：
取步骤2)所制备的2mg/mL HNP-SDPD-RSA溶液0.2mL，加生理盐水稀释至至2mL，接着加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化混匀，获得HNP-SDPD-RSA复合溶液；将所述复合溶液分别在健康雌性新西兰大白兔的后足垫及背部多点皮下注射免疫；两周后，改用不完全佐剂，以减半剂量0.2mg HNP-SDPD-RSA进行第二次免疫；以后每隔两周免疫一次，方法同第二次免疫；5周后，耳缘静脉采血并分离血清，进行间接ELISA检测，测定抗体效价，效价定义为：用酶标仪测出OD值，以空白孔调零，若待测孔OD值超过0.1且大于阴性对照孔的2.1倍.判定为阳性，以判为阳性孔所对应的血清稀释倍数为血清，即抗体的效价；当抗体效价大于10万时，可以用于下一步反应；针对效价合格的兔继续进行加强免疫(免疫剂量为0.2mg，耳缘静脉注射)，此次加强免疫一周后颈动脉采全血，分离血清，采用硫酸铵沉淀法纯化，得到兔抗人HNP多克隆抗体；
所述不完全佐剂为：液体石蜡与羊毛脂混合而成，体积组分比为2∶1；所述弗氏完全佐剂为弗氏不完全佐剂与卡介苗混合而成，其中卡介苗终浓度为10mg/mL。
4)制备辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体：
a)将羊抗兔多克隆抗体采用硫酸铵沉淀法纯化：在0.1mol/L PBS(pH 7.2)中透析18h，中间换液5次，真空干燥保存备用；
b)称取5.5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶解于纯水中，加入0.2mL新配的0.1M NaIO4，室温下避光搅拌20min，将上述溶液装入透析袋中透析过夜(4℃条件)，加20μL 0.2mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液，使所述HRP溶液的pH升高到9.0-9.5，立即加入10mg步骤a)中纯化好的羊抗兔多克隆抗体，在1mL 0.01mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2h，加0.1mL新配的4mg/mL NaBH4液，混匀，再于4℃放置2h，将上述液装入透析袋中，对0.15mol/L pH 7.4PBS透析，4℃过夜，收集，制得辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体；
5)鼠抗人HNP单克隆抗体的制备与酶标板的包被：
a)小鼠免疫：选择3只健康雌性Balb/c小鼠，以步骤1)中制备的HNP-SDPD-MSA溶液作为免疫抗原；取360μg HNP-SDPD-MSA溶液与等量完全弗氏佐剂充分混匀，多点注射小鼠背部皮下，120μg/只作首次免疫；两周后取300μg稀释后的HNP-MSA溶液，与等量不完全弗氏佐剂充分混匀，多点注射小鼠背部皮下，100μg/只作第二次免疫；两周后，进行第三次免疫(免疫剂量同第二次免疫)；第三次免疫7天后尾部采血，分离血清并进行ELISA检测，如果检测的效价在40万以上则进行加强免疫，如果检测效价在40万以下则进行第四次免疫(免疫剂量同第二次免疫)，7天后重新进行ELISA检测，直至效价达到40万以上为止；
b)细胞融合：取效价合格的老鼠，提前3天加强免疫，将小鼠SP2/O细胞在PEG的条件下做融合，7天后筛选，挑选3次阳性的单克隆细胞做建株，所述ELISA阳性指在450nm测OD值且(OD检测孔-OD空白对照孔)/(OD阴性孔-OD空白对照孔)≥2.1的结果，测亚型，打腹水，检测，利用辛酸硫酸铵加抗原亲和层析纯化腹水，获得鼠抗人HNP单克隆抗体，该单克隆抗体灵敏度为80pg/mL；
c)将步骤b)中制备的鼠抗人HNP单克隆抗体纯化后，用抗体稀释液稀释至1μg/mL，以稀释后的鼠抗人HNP单克隆抗体100μL/孔过夜包被酶标板，4℃保存，备用。
6)其他试剂的配制
所述标准品稀释液配制方法为：20g BSA、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、8g NaCl，用纯水定容至1000mL；
所述的样品稀释液配制方法为：0.2g KH2PO4、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、8g NaCl，用纯水定容至1000mL；
所述的25倍洗涤缓冲液配制方法为：5g KH2PO4、5g KCl、72.5gNa2HPO4·12H2O、200q NaCl、12.5mL Tween-20，用纯水定容到1000mL，临用前用纯净水稀释25倍，现配现用；
所述的抗体稀释液配制方法为：20g BSA、1g Tris、0.2mL 1％硫柳汞、8g NaCl，用纯水定容至1000mL，pH 7.4；
所述质量分数1％的硫柳汞的配制方法为：1g硫柳汞、10mL丙酮、50mL乙醇，溶解后，加蒸馏水至100mL；
TMB显色液：单一组份，为即用型，商业购买(Sigma，T8665)；
所述终止液的配制方法为：88.9mL蒸馏水，逐滴加入11.1mL的质量分数98％浓硫酸中，配置成100mL 2mol/L H2SO4溶液。
本发明的有益效果是：
1)检测特异性高：抗体作为试剂盒中的关键成分，直接影响着试剂盒的特异性与灵敏度；本发明自主制备的高特异性、高亲和力的俘获与检测抗体，克服了现有技术中HNP是小分子多肽物质、免疫原性较弱、通过传统的免疫方法不易产生特异性的抗体等的缺点，利用偶联载体来增加其免疫原性，从而获得高特异性与高灵敏度的抗体；进而应用杂交瘤技术制备出特异性高亲和力强的单克隆抗体作为抗原俘获抗体，为试剂盒的制备提供高品质原材料，从而保证了本发明所述的试剂盒的高特异性；
2)灵敏度高、无背景干扰：本发明所述的试剂盒使用自主制备的高效价多克隆抗体为检测抗体，可以识别多个抗原表位，从而保证了检测试剂盒的高灵敏度；
3)检测成本低：与现有市售的国外A进口公司生产的试剂盒(每个样品的检测费用在90元)相比，本发明所述的试剂盒每个样本的检测成本在40元，成本还不到国外A进口公司试剂盒的一半，价格低廉，更有利于广泛的应用；
4)应用范围广：本发明所述的试剂盒可以用于细胞培养液、组织提取液、血浆、血清等不同样品检测；试剂盒的高灵敏度(41pg/mL)为科学研究提供了强有力的检测工具，而其特异、稳定、宽大的检测范围(41-10000pg/mL)则使其可能成为临床诊断与监测工具；
5)选择了合适的偶联比例：本发明所述HNP∶SPDP∶MSA的摩尔比为1∶5∶1、所述HNP∶SPDP∶RSA的摩尔比为1∶5∶1为最佳的偶联比例，是发明人偶然获得的，如果选择的偶联比例不合适，当载体蛋白过剩，则会增加后续偶联物纯化的负担，当HNP过剩，则会浪费HNP的使用量，增加成本，因此只有选择恰当的欧联比例时，才能够达到既能节省HNP的使用量，又能减轻纯化偶联物的负担的目的；
6)检测范围广：本发明制备的试剂盒检测范围可以达到41-10000pg/mL，目前市售的检测人类α防御素多肽的试剂盒均达不到如此宽的范围；本发明制作标准曲线时，采用2.5倍梯度稀释，不同于常规的稀释梯度，现有技术中，一般标准品稀释都是2倍倍比稀释，而本发明采用的稀释倍数是2.5倍，如此，在预定的6次稀释以后，可以使得稀释倍数达到244倍，而2倍的稀释倍数却只有64倍，2.5倍稀释使得本发明所述的标准品浓度扩宽，检测范围扩大；
7)操作简单、便捷：本发明所述的试剂盒以工作液的形式提供，操作简单、便捷、缩短了检测时间，并可于常温下检测，且减少因步骤复杂而出现的失误。
附图说明
图1为利用本发明所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒进行检测的标准曲线图。
具体实施方式
本发明所述的人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒检测原理：以高吸附性的多孔板为固相载体，用纯化的鼠抗人HNP单克隆抗体包被多孔板，向孔中分别加入标准品或者样本，其中的HNP与连接于固相载体上的特异性抗体结合，然后加入兔抗人HNP多克隆抗体，将未结合的兔抗人HNP多克隆抗体洗净后，加入HRP标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体，接着洗净未结合的HRP标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体，再次彻底洗净后加入TMB底物显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化为最终的黄色；颜色的深浅和样品中的HNP呈正相关，用酶标仪于450nm波长下测定吸光度(OD值)，并计算样品浓度。
本发明所述的人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)样本的采集及保存：收集标本如血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养液、组织匀浆等，置于2-8℃保存，若超过48h或更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存；血清、血浆、细胞培养上清至少作1∶5稀释(例如，取50μL样品，加标本稀释液200μL，即为稀释5倍)；
2)准备不同浓度HNP蛋白标准液：将10ng HNP蛋白标准品冻干粉用1mL标准品稀释液稀释成10000pg/mL，进一步依次以2.5倍倍比稀释成不同浓度，例如：4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256pg/mL、102pg/mL、41pg/mL；
3)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的HNP蛋白标准液，空白孔加100μL标准品稀释液；佘孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，室温反应60min；
4)弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300μL/孔；
5)每孔加100μL兔抗人HNP多克隆抗体，室温反应60min；
6)弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300μL/孔；
7)每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体100μL，室温，反应60min，用洗涤缓冲液洗板6次；
8)依次每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色15-30min；
9)依次每孔加终止液50μL，终止反应；用酶标仪在450nm波长处读数(OD值)；
10)计算：各标准品及OD值扣除空白孔后作图(7点图)；如设置复孔，应取平均值计算；以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线计算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的指标检测
本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中HNP的水平，制备过程如下：使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2h，使PS板活化；在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗人鼠单克隆抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板；检测时，依次加入待测标本或者不同浓度的HNP蛋白标准液、抗人HNP兔多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体，形成待测标本或者HNP标准品-兔多抗-酶标羊抗兔-TMB结合酶标板上包被的抗体的，再通过辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人α防御素肽的酶联吸附测定试剂盒的制备。
经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果如下：
1)制作利用本发明所述试剂盒进行检测的标准曲线
将10ng HNP蛋白标准品冻干粉用1mL标准品稀释液稀释成10000pg/mL，进一步依次以2.5倍倍比稀释成不同浓度，分别为：4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256pg/mL、102pg/mL、41pg/mL；分别设空白孔、标准孔；将标准孔中依次加入100μL不同浓度的HNP蛋白标准液，空白孔加100μL标准品稀释液酶标板加上覆膜室温反应60min；弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300μL/孔；每孔加100μL抗人HNP兔多克隆抗体，室温反应60min；弃去液体，拍干，用洗涤缓冲液洗涤6次，300μL/孔；每孔加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体100μL，室温，反应60min，用洗涤缓冲液洗板6次；依次每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色30min；依次每孔加终止液50μL，终止反应；用酶标仪在450nm波长处读数(OD值)；根据表1中的数据，以标准品的浓度为横坐标、OD值为纵坐标绘制标准曲线图(见图1)，从图中可以看出，标准曲线检测范围广，为41～10000pg/mL。
表1测定不同浓度的标准品的OD值
2)空白孔
根据表2所示，通过检测试剂盒的背景显色及空白对照设置及检测可以看出本发明所述试剂盒无背景干扰，检测结果更加准确，有效避免了现有试剂盒存在空白对照以及阴性对照背景深等问题。
表2检测试剂盒的背景显色及空白对照的设置
对照项 包被抗体 HNP 检抗 酶标抗体 TMB
空白① - - - - 100μL/well
包被对照② 2μg/mL - - - 100μL/well
酶标对照③ 2μg/mL - - + 100μL/well
HNP阴性对照④ 2μg/mL - + + 100μL/well
HNP阳性对照⑤ 2μg/mL 0.5μg/mL + + 100μL/well
HNP阳性对照⑥ 1μg/mL 0.5μg/mL - - 100μL/well
HNP阳性对照⑦ 0.5μg/mL 0.5μg/mL - - 100μL/well
检测结果如表3所示，从表中的数据可以看出，整个反应体系显色正常，并且无非特异性显色。
表3检测试剂盒的背景显色及空白对照的结果
3)检测本发明所述试剂盒的灵敏度
根据1)中标准曲线数值，以标准品HNP蛋白浓度为自变量，以OD450值为因变量，绘制标准曲线。以检测孔与阴性对照孔OD450的比值作为该体系的灵敏度。标准曲线见附图1，由标准曲线计算得到，本发明所述试剂盒最低检测限为41pg/mL；
4)检测本发明所述试剂盒的回收率实验：
用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品，作回收试验(n＝5)。
具体实验方法如下：
a)选择一常规样本血清4mL，平均分成4份，即1mL/份；
b)向步骤a)中的3份血清中分别加入10μL浓度分别为8000pg/mL、1500pg/mL以及41pg/mL标准品溶液，制成3种不同浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度；
c)向第4份血清中加入10μL无被测物的溶剂，制成基础样本；
d)用待测评方法对回收样本和基础样本进行测定，同时对样本进行5次重复分析，取平均值进行计算；
e)通过公式进行回收率计算，回收率＝(加入标品后含量-样品含量)/加入标品量×100％。
通过5次平行检测得到3个平均回收率，分别对应3个不同加标样品，如表4所示根据表4数据可知本发明所述试剂盒的平均回收率为95.85％。
表4应用本发明所述试剂盒测定HNP的回收试验
定值标准品(pg/mL) 回收率(％)
8000 96.34
1500 94.17
41 97.04
平均回收率 95.85
实施例2本发明所述试剂盒与国外某A进口公司试剂盒对比实验
发明人通过以下实验对比了本发明所述的人类嗜中性粒细胞α防御素多肽检测试剂盒与该进口试剂盒定量检测在精密度、回收率等方面的差异。
1)精密度实验：
分别采用本发明所述的人类嗜中性粒细胞α防御素多肽检测试剂盒与国外某A进口公司试剂盒对高、中、低值质控品进行检测。分别用这两种试剂盒测定三个定值样本8564.1pg/mL、1504.6pg/mL、42.4pg/mL，每个样本重复测定20次，具体步骤同实施例1，具体数据见表5，从表5中数据可见本发明所述人类嗜中性粒细胞α防御素多肽检测试剂盒的精密度要好于该进口试剂盒。
表5本发明所述的人类嗜中性粒细胞α防御素多肽检测试剂盒与国外A进口公司试剂盒精密度测试
2)回收实验：
取不同浓度的HNP标准品溶液(浓度为41pg/mL、1500pg/mL、8000pg/mL)，分别加入定值血清(23.7pg/mL)，分别用本发明所述的试剂盒和国外A进口公司试剂盒检测，检测方法同实施例1，并比较测定值和预期值，计算回收率(见表6)。
表6本发明所述的试剂盒和国外A进口公司试剂盒回收率测试数据
本发明所述试剂盒 国外A进口公司试剂盒
8000pg/ml 96.34 86.44％
1500pg/ml 94.17 81.31％
41pg/ml 97.04 87.75％
本发明通过高效的偶联方法的得到稳定性好的HNP-MSA溶液和HNP-RSA溶液，并通过公司免疫动物得到特异性高及亲和力强的抗体，用来制备防御素酶联免疫吸附测定试剂盒。通过与国外A进口公司试剂盒的比较，其精密度、回收率、准确性和批量检测样本等方面均优于国外A进口公司试剂盒。本发明所述的试剂盒比国外A进口公司试剂盒特异性更好，灵敏度更高，检测限范围更广。而且，本发明所述的试剂盒投资小，成本低，更适于广泛应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，包括：酶标板、HNP蛋白冻干标准品、兔多克隆抗体、酶标二抗、标准品稀释液；
所述酶标板为鼠抗人HNP单克隆抗体包被的酶标板；
所述HNP蛋白冻干标准品为从病人痰液中提取并纯化后所获得的冻干标准品；
所述标准品稀释液用于溶解HNP蛋白冻干标准品，得到HNP蛋白标准液；
所述兔多克隆抗体为兔抗人HNP多克隆抗体；
所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，所述兔多克隆抗体的浓度为0.2mg/mL，使用浓度为0.2μg/mL。
3.根据权利要求1所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，所述酶标板中，鼠抗人HNP单克隆抗体的包被浓度为1μg/mL。
4.根据权利要求1所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，所述HNP蛋白标准液的浓度分别为10000pg/mL、4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256pg/mL、102pg/mL、41pg/mL；所述HNP蛋白标准液，使用前15min内配制。
5.根据权利要求1所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，还包括：样品稀释液、25倍浓洗涤缓冲液、抗体稀释液、TMB显色液和酶反应终止液。
6.根据权利要求5所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于：
所述标准品稀释液为20g/L BSA、0.2g/L KH2PO4、0.2g/L KCl、2.9g/L Na2HPO4·12H2O、8g/L NaCl水溶液；
所述样品稀释液为0.2g/L KH2PO4、0.2g/L KCl、2.9g/LNa2HPO4·12H2O、8g/L NaCl水溶液；
所述25倍浓洗涤缓冲液为5g/L KH2PO4、5g/L KCI、72.5g/LNa2H PO4·12H2O、200g/L NaCl、体积分数1.25％Tween-20的水溶液，临用前用纯净水稀释25倍，得到洗涤缓冲液，现配现用；
所述抗体稀释液含有20g/L BSA、1g/L Tris、0.2mL质量分数为1％硫柳汞溶液、8g/L NaCl水溶液；
所述质量分数1％的硫柳汞溶液含有10g/L硫柳汞，并且所述质量分数1％的硫柳汞溶液中丙酮的体积分数10％、乙醇的体积分数为50％；
所述酶反应终止液为2mol/L H2SO4水溶液。
7.根据权利要求1～6所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的检测范围为41～10000pg/mL。
8.一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)收集样品，置于-20℃保存，检测前于室温下解冻；
2)准备不同浓度HNP蛋白标准液：将10ng HNP蛋白标准品冻干粉溶于1mL标准品稀释液中制成10000pg/mL HNP蛋白标准液，进一步依次以2.5倍倍比稀释成6个不同浓度的HNP蛋白标准液，即4000pg/mL、1600pg/mL、640pg/mL、256pg/mL、102pg/mL、41pg/mL；
3)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；设标准孔7孔，依次加入100μL HNP蛋白标准液，空白孔加100μL标准品稀释液；余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，室温反应60min；
4)弃去液体，拍干，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤6次；
5)每孔加100μL兔抗人HNP多克隆抗体，室温反应60min；
6)弃去液体，拍干，每孔加入300μL洗涤缓冲液洗涤6次；
7)每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体100μL，室温，反应60min，用洗涤缓冲液洗板6次；
8)依次每孔加入TMB显色液100μL，室温避光显色15～30min；
9)依次每孔加入终止液50μL，终止反应；用酶标仪在450nm波长处检测OD值；
10)计算：以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线计算出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。
9.根据权利要求8所述人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤1)中，所述样品为血清、血浆、细胞培养上清液、组织匀浆中的任一种。
10.一种人类α防御素多肽酶联免疫吸附试剂盒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从病人痰液中提取HNP蛋白，冻干，得到HNP蛋白冻干标准品；
2)制备HNP完全抗原：
制备兔HNP完全抗原：将兔血清白蛋白RSA、步骤1)中获取的HNP蛋白分别与SPDP偶联，得到RSA-SPDP偶联产物、HNP-SPDP偶联产物；将RSA-SPDP偶联产物与HNP-SPDP偶联产物按照1∶1体积比混合；将上述混合溶液置于4℃条件下反应20h，用pH为7.5的0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，得到HNP-SPDP-RSA溶液，-20℃保存备用；所述HNP∶SPDP∶RSA的摩尔比为1∶5∶1；
利用同样的方法制备小鼠HNP完全抗原：将小鼠血清白蛋白MSA、步骤1)中获取的HNP蛋白分别与SPDP偶联，得到MSA-SPDP偶联产物、HNP-SPDP偶联产物；将MSA-SPDP偶联产物与HNP-SPDP偶联产物按照1∶1体积比混合；将上述混合溶液置于4℃条件下反应20h，用pH为7.5的0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，得到HNP-SPDP-MSA溶液，-20℃保存备用；所述HNP∶SPDP∶MSA的摩尔比为1∶5∶1；
3)制备抗人HNP兔多克隆抗体：将步骤2)得到的HNP-SPDP-RSA溶液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化混匀，接种于新西兰大白兔，以后均改用不完全佐剂，每隔两周，按照前一次剂量的1/2进行次免疫，同时免疫一周后，耳静脉采血，并分离血清，利用ELISA检测抗体效价，当抗体效价大于10万时，杀兔取全血，分离，纯化、得到兔抗人HNP多克隆抗体；
4)鼠抗人HNP单克隆抗体包被的酶标板的制备：将步骤2)获得的HNP-SPDP-MSA溶液与等量完全弗氏佐剂充分混匀，每隔两周免疫一次，免疫一周后小鼠尾部采血，并分离血清，进行ELISA检测，选择效价为40万以上的小鼠的SP2/0细胞在PEG的条件下进行细胞融合，挑选单克隆细胞建株，测亚型，打腹水，检测，纯化获得鼠抗人HNP单克隆抗体；将所述获得鼠抗人HNP单克隆抗体包被酶标板，4℃保存备用；
5)制备辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体：将羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体采用硫酸铵沉淀法纯化在pH为7.2的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中透析，接着采用过碘酸钠法连接辣根过氧化物酶，得到辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白多克隆抗体；
6)配制标准品稀释液、样品稀释液、洗涤缓冲液、抗体稀释液、和酶反应终止液，TMB显色液为市场购买。
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