CN101271113A - 检测人b淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测人B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的酶联免疫试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括包被纯化的人BAFF的单克隆抗体的固相载体，生物素标记的人BAFF多克隆抗体、HRP标记的链酶亲和素。其制备方法包括抗原、抗体的制备，抗体的纯化，纯化抗体的标记，试剂盒的制备等步骤；本发明的试剂盒，检测灵敏度可达1ng/ml，为BAFF的研究提供了有效的检测手段。

Description

检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说是涉及检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒及其制备方法。

相关领域描述

B淋巴细胞刺激因子(B cell activating factor belonging to the TNF family，BAFF)又名为BLyS(B lymphocyte stimulator)、THANK(TNF homology thatactivates apoptosis，nuclear factor-κB and c-Jun NH2-terminal kinase)、及TALL-1(TNF-and apoptosis ligand-related leukocyte-expressed ligand 1)，是肿瘤坏死因子超家族(TNF)的第17位成员，它能与B淋巴细胞特异结合并诱导其增殖、分化并分泌IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白，在体液免疫反应中发挥着重要作用。现已确定，BAFF与多种身免疫性疾病的发病机理有关，包括自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合症等。

人BAFF(GenBank序列号：AF116456)全长为285个氨基酸，其中47-73氨基酸为跨膜区，74-285氨基酸为胞外区，通常在某些特定的蛋白酶(如弗林蛋白酶)的作用下发生水解，形成可溶性功能片段sBAFF(C端A134-L285)。BAFF的空间结构具有如下特点：单体呈锲形(wedge-like)样的β“三明治”结构，由两个平行的β折叠片层组成，分别含有5条β折叠股；BAFF以同源三聚体的形式发挥生物学作用。BAFF与肿瘤坏死因子家族的另一个成员：增值诱导配体(aproliferation inducing ligand，APRIL)具有高度的同源性。

文献广泛报道，自身免疫性疾病如红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性干燥症等病人体内B淋巴细胞刺激因子(BAFF)含量升高；最新的研究发现，淋巴瘤、自身免疫性肝炎、HIV病人体内BAFF含量也升高。因此研制高灵敏度的人BAFF检测试剂盒，对于愈后指标检测等是极为必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人B淋巴细胞刺激因子(BAFF)的酶联免疫试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。

本发明的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，包括包被纯化的人BAFF的单克隆抗体的固相载体，生物素标记的人BAFF多克隆抗体、HRP标记的链酶亲和素。

上述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，其中固相载体是常规的，优选96孔聚苯乙烯酶标板。所说的人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体为鼠源，多克隆抗体为兔源。人B淋巴细胞刺激因子标准品为大肠杆菌重组表达后纯化的产物。

为了方便使用，所说的试剂盒还包括人B淋巴细胞刺激因子标准品蛋白、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液。

所述浓缩洗涤液为含1％Tween 20的磷酸缓冲液，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A为过氧化氢，显色B液为邻苯二胺(OPD)，反应终止液为H₂SO₄；样品稀释液是0.5％BSA，0.05％Tween 20，5mM EDTA，0.35MNaCl，pH 7.2的PBS。

本发明的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗原的制备：将克隆的人B淋巴细胞刺激因子基因在大肠杆菌中表达，得到的融合蛋白，经纯化后作为抗原；

(2)抗体的制备：将(1)中的的抗原免疫兔制备特异性的人B淋巴细胞刺激因子多克隆抗体；复苏分泌人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体的杂交瘤细胞并注射入小鼠腹腔，收集腹水，制备人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体；

(3)抗体的纯化：(2)中所得的人B淋巴细胞刺激因子多克隆抗体和单克隆抗体分别经离心、沉淀、亲和层析，得到纯化抗体；

(4)抗体的标记：用生物素标记(3)中所得到的纯化多克隆抗体；

(5)试剂盒的制备：用(3)中所得的纯化单克隆抗体包被固相载体。

本发明的试剂盒的使用方法，包括以下操作步骤：

(1)将检测样本与固定于固相支持物的捕捉试剂接触和保温。其中捕捉试剂是抗人BAFF的单克隆抗体。

(2)将检测抗体与结合于捕捉抗体上的检测样本接触和保温。检测抗体为生物素标记的抗人BAFF的多克隆抗体。

(3)用HRP标记的链酶亲和素特异性地捕捉结合于检测抗体上的生物素，并用显色剂显色，从而测定结合于捕捉抗体的BAFF水平。

本发明建立了双抗体夹心法测定样品中B淋巴细胞刺激因子水平，测定灵敏度可达1ng/ml，为B淋巴细胞刺激因子检测提供了有效的检测手段。

附图描述

图1是人BAFF可溶性区段基因的表达结果。BL21(DE3)/pET30a-hsBAFF菌经诱导后超声破碎细胞，用包涵体洗涤液洗涤包涵体，取样进行12％SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色，结果如图所示，大部分杂蛋白被洗去。割胶回收目的条带可用作抗原。1Marker；2诱导前全菌；3诱导后全菌；4包涵体。

图2是人BAFF多克隆抗体的纯化结果。12％SDS-PAGE结果显示，纯化后的多克隆抗体有明显的两条带，分别为相对分子量为25000KDa左右的轻链和相对分子量为50000KDa左右的重链。1 Marker；2 多抗血清；3-4纯化后抗体

图3是人BAFF单克隆抗体的纯化结果。小鼠腹水纯化后，12％SDS-PAGE结果如图所示，纯化后的多克隆抗体有明显的两条带，分别为相对分子量为25000KDa左右的轻链和相对分子量为50000KDa左右的重链。M Marker；1纯化前腹水；2-3纯化后单克隆抗体

图4是人BAFF双抗体夹心法检测的标准曲线。实验数据运用SPSS软件分析进行拟合分析，结果如图所示，在1-100ng/ml之间，曲线性较好R²＝0.995。回归曲线方程为：Y＝0.534+0.433lnX

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

大肠杆菌BL21/pET 30a-hsBAFF由申请人保存，可向公众提供，其构建参见(P.Cao et al./Protein Expression and Purification 41(2005)199-206)。

实施例1、抗体的制备

1多克隆抗体的制备

(1)抗原制备

在大肠杆菌BL21/pET 30a-hsBAFF中诱导表达hsBAFF基因，超声破碎细胞后收集包涵体。用包涵体溶解液(8M尿素，20mM Tris-Cl，pH 8.3，1mM EDTA，5mM β-巯基乙醇)4℃过夜溶解包涵体，离心取上清，加入不含β-巯基乙醇的上样缓冲液(注意：样品不用煮沸)，进行12％SDS-PAGE。电泳结束后，去离子水清洗凝胶，用冰冻的0.25mol/l KCl显色，目的条带相应位置呈现乳白色。切割目的条带并充分碾磨，装入2ml注射器，准备免疫。结果如图1所示。

(2)免疫方案

免疫方法为腹部皮下多点注射抗原，每次免疫量为1mg。每隔15天免疫一次，第三次免疫结束10天后，耳静脉采血检测抗血清效价，若效价大于30,000，准备收集血清；若效价小于30,000，加强免疫一次。

(3)分离抗血清

心脏采血，将血液在37℃放置2小时后，转移到4℃冰箱过夜，收集析出液，离心，上清即为多抗血清。分装血清，-70℃保存。

2单克隆抗体的制备

采用体内诱生法制备单克隆抗体。复苏分泌人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体的杂交瘤细胞，并用RPMI 1640培养液大量培养。取6-8周龄的Bal b/c小鼠每只腹腔注射0.5ml石蜡油，1周后每只小鼠注射1×10⁶杂交瘤细胞。待小鼠腹部明显膨大到一定成都时，抽取腹水，反复收集数次。腹水经12,000g离心20min后，分装-70℃保存。

实施例2、抗体的纯化及标记

1多克隆抗体的纯化

(1)50％饱和硫酸铵沉淀样品：多抗血清中加入1/10体积1mol/L Tris-HCl，pH 8.0，然后一边搅拌一边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃，搅拌4小时。12,000rpm离心20分钟，弃上清，用最小体积的磷酸盐缓冲液，pH 7.4(PBS)溶解沉淀。

(2)33％饱和硫酸铵沉淀样品：把上述溶液中加入1/10体积1mol/LTris-HCl，pH 8.0，然后一边搅拌一边加入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，4℃，搅拌4小时。12,000rpm离心20分钟，弃上清，用最小体积的PBS溶解沉淀。重复一次。

(3)脱盐：用PBS透析上述溶液，中间换三次液。

(4)利用Biologic LP层析系统，样品液以0.5ml/min流速上样至结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.4，150mM NaCl)预平衡的rProtein A Sepharose FastFlow亲和层析柱；

(5)用结合缓冲液以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(6)用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-HCl，pH 3.0)以0.5ml/min流速洗脱抗体，至流出液OD280值到达基线，用含1/10柱体积的1mol/l Tris-HCl(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性；

(7)取所收集的溶液10μl，进行12％SDS-PAGE分析。

多克隆抗体的纯化结果如图2所示。

2单克隆抗体的纯化

(1)50％饱和硫酸铵沉淀样品：小鼠腹水中加入1/10体积1mol/L Tris-HCl，pH 8.0，然后一边搅拌一边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃，搅拌4小时。12,000rpm离心20分钟，弃上清，用最小体积的PBS溶解沉淀。

(2)脱盐：用PBS透析上述溶液，中间换三次液。

(3)利用Biologic LP层析系统，样品液以0.5ml/min流速上样至结合缓冲液(20mM磷酸钠，pH 7.4，150mM NaCl)预平衡的rProtein A Sepharose FastFlow亲和层析柱；

(4)用结合缓冲液以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

(5)用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-HCl，pH 3.0)以0.5ml/min流速洗脱抗体，至流出液OD280值到达基线，用含1/10柱体积的1mol/l Tris-HCl(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性；

(6)取所收集的溶液10μl，进行12％SDS-PAGE分析。

单克隆抗体的纯化结果如图3所示。

3间接ELISA测定纯化后抗体效价

用10μg/ml hsBAFF包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min；5％脱脂奶粉37℃封闭2h；取纯化后单抗或者多抗梯度稀释，每孔加入100μl，以骨髓瘤细胞培养液或者免疫前血清为阴性对照，以抗体的稀释液为空白对照，每个样设3个重复，置37℃孵育1h，然后洗涤；加入1∶1000稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体或者羊抗兔IgG抗体，置37℃孵育1h，然后洗涤；各反应孔中加入临时配制的显色剂溶液100μl，室温反应20min；各反应孔中加入2M硫酸50μl；在ELISA检测仪上490nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值。

抗体效价以稀释度表示，检测结果以(A_样品-A_空白)/(A_阴性对照-A_空白)≥2.1为阳性，以阳性孔对应的最高稀释倍数为效价。间接ELISA测定，纯化后单克隆抗体的效价为10⁶；多克隆抗体的效价为8×10⁴。

4纯化多克隆抗体的标记

(1)用无水DMSO配置5mg/ml生物素-N-羟基琥珀酸亚胺酯(Biotin-NHS)(sigma)溶液。

(2)用0.1mol/L，pH 9.5碳酸盐缓冲液透析纯化后多克隆抗体，并浓缩抗体浓度至1-3mg/ml。

(3)按照100μg/ml的比率将生物素酯加入抗体溶液中，混合均匀并在室温下孵育4小时。

(4)每250μg生物素酯内加入20μl 1mol/L氯化铵，室温孵育10分钟。

(5)用0.15mol/L PBS(pH 7.4)充分透析上述溶液

实施例3、检测人BAFF的酶联免疫试剂盒

1所用试剂的配置

a.BAFF标准品溶液：1mg/ml人BAFF标准蛋白0.5ml。

b.浓缩洗涤液：1％Tween 20的磷酸盐缓冲液(0.15M，pH 7.4)，为正常使用浓度的10-15倍。

c.样品稀释液：0.5％BSA，0.05％Tween 20，5mM EDTA，0.35M NaCl，pH 7.2的PBS。

d.检测抗体：1mg/ml生物素标记的人BAFF多克隆抗体0.2ml。

e.HRP标记的链酶亲和素1mg/ml 0.1ml。

f.底物显色液A液：过氧化氢10ml。

g.底物显色液B液：邻苯二胺(OPD)10ml。

h.终止液：2M硫酸，10ml。

2抗体最佳工作浓度的选择

应用棋盘滴定法。用包被缓冲液把BAFF单克隆抗体稀释至2.5、5.0、10和20μg/mL，分别在酶标板上进行包被，每一个浓度包被3个横行，洗涤；在第一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液(200ng/ml BAFF蛋白溶液)，在第二个横行中加入弱阳性抗原液(1ng/ml BAFF蛋白溶液)，第三横行加入阴性对照液(样品稀释液)，温育，洗涤；用样品稀释液将生物素标记BAFF多克隆抗体稀释成4个浓度2、4、8、16μg/mL。每个浓度加入两个纵行，温育，洗涤；加入1∶12000稀释的HRP标记的链酶亲和素，温育，洗涤；加入显色剂显色，加终止液终止反应，读取A490值。以强阳性抗原的A490值在2左右，阴性参考的A490值小于0.1的条件作为最适条件，据此选择包被抗体和生物素标记抗体的工作浓度。BAFF单克隆抗体的最适包被浓度是10μg/mL，生物素标记多克隆抗体的最适工作浓度是8μg/mL。

3抗BAFF单克隆抗体包被板的制备

用包被缓冲液(pH 9.60.05M碳酸钠)将hBAFF单抗稀释至10μg/mL，酶标板每孔中加100μl，4℃12小时。弃去包被液，用洗涤液(PBS，pH 7.4-Tween20，0.05％)洗涤各孔四次，每次两分钟，随之拍干。每孔加入封闭液(2％BSA，0.01％硫柳汞，PBS)200μl，4℃封闭4小时，随后弃去封闭液，洗涤三次，拍干，室温干燥24小时。干燥后的酶标板迅速真空封口包装，保存于2-8℃。

4试剂盒检测操作程序

(1)加样用样品稀释液将hsBAFF稀释至200ng/ml-0.05ng/ml，每孔加100μL；阴性对照孔，每孔加100μL样品稀释液。每个样设三个重复。37℃温育1小时。用洗涤液洗涤四次。

(2)生物素标记多克隆抗体用样品稀释液将生物素标记抗体稀释至8μg/mL，加入样孔中，每孔100μL。37℃温育1小时。洗涤六次。

(3)HRP-链酶亲和素用0.1％BSA将HRP-链酶亲和素储液按1∶12000稀释，分别加入设计好的样孔中，每孔100μL。37℃温育1小时。洗涤六次。

(4)检测每个样孔中加入新鲜配置的显色液50μL，室温(18-25℃)静置25分钟。每个样孔中加入反应终止液(2M H₂SO₄)50μL。在酶标仪490nm下读数。

5检测范围测定

将hsBAFF稀释至200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.3ng/ml，3.2ng/ml，1.6ng/ml，0.8ng/ml，0.4ng/ml，0.2ng/ml，0.1ng/ml，0.05ng/ml，加入到ELISA系统中进行检测。以hsBAFF浓度为横坐标，A490为纵坐标，运用CurveExper 1.38ELISA标准曲线拟合软件分析并绘制标准曲线。结果如图4所示，在1-100ng/ml之间，曲线性较好R²＝0.995。回归曲线方程为：Y＝0.534+0.433lnX。

6特异性检测

稀释hsAPRIL至50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.3ng/ml，3.2ng/ml，1.6ng/ml，0.8ng/ml，分别加入ELISA系统中进行检测。结果表明，即使hsAPRIL浓度达到50ng/ml，也没有观察到明显的交叉反应或者干扰。

7精确度检测

批内精确度分析：取三份已知浓度的BAFF样品，在同一块酶标板上检测20次，计算变异系数(CV)。批间精确度分析：取已知浓度的BAFF样品，在多块酶标板上分别检测，计算变异系数(CV)。实验结果表明，不论是批内还是批间，变异系数(CV)都在10％以内。

Claims (4)

1、一种检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，包括包括包被纯化的人BAFF的单克隆抗体的固相载体，生物素标记的人BAFF多克隆抗体、HRP标记的链酶亲和素。

2、如权利要求1所述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，其特征在于，还包括还包括人B淋巴细胞刺激因子标准品蛋白、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液。

3、如权利要求2所述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所说的人B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体为鼠源，多克隆抗体为兔源；所述浓缩洗涤液为含1％Tween 20的磷酸缓冲液，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A为过氧化氢，显色B液为邻苯二胺，反应终止液为H₂SO₄；样品稀释液是0.5％ BSA，0.05％ Tween 20，5mM EDTA，0.35M NaCl，pH 7.2的PBS。

4、一种制备权利要求1所述的检测人B淋巴细胞刺激因子的酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)抗体的制备：用hsBAFF分别免疫小鼠和兔子，制备人B淋巴细胞刺激因子的单克隆抗体和多克隆抗体；

(2)抗体的纯化：(1)中所得的抗体经离心、沉淀、亲和纯化，得到纯化抗体；

(3)抗体的标记：用生物素标记(2)中所得到的纯化多抗；

(4)试剂盒的制备：用(2)中所得的纯化单克隆抗体包被固相载体。

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