KR20060027404A - 사료 효소 검출 시약, 방법 및 키트 - Google Patents

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릴리안 제이토니
미쉘 수잔 야넬
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신젠타 파티서페이션즈 아게
릴리안 제이토니
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Abstract

본 발명은 면역학 분야에 관한 것이며, 보다 특히, 단백질 및 효소, 특히 사료 효소의 검출을 위한 면역검정 방법, 키트 및 시약에 관한 것이다.
사료 효소, 파이타제, 항체, 면역검정법, ELISA, 면역띠

Description

사료 효소 검출 시약, 방법 및 키트{Reagents, methods and kits for detecting feed enzymes}
본 출원은 전문이 본원에 참조로서 인용된, 2003년 7월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/485,602호의 출원일의 이익을 주장한다.
본 발명은 면역학 분야 및 보다 특히, 단백질 및 효소, 특히, 사료 효소의 검출을 위한, ELISA 및 면역띠 검정을 포함한 면역검정 방법, 키트 및 시약에 관한 것이다.
동물 사료 중의 효소의 존재를 검출하기 위한 편리하고, 상대적으로 용이한 검정에 대한 중대한 요구가 있어 왔다. 현재까지, 이러한 검출을 위한 표준 면역학적 검정은 없었다.
식물이 유전적으로 변형되었는지 또는 곡물 또는 가공 식품이 GMO 형질을 가졌는지의 여부의 측정에 대한 요구 또한 매우 크다. 이러한 요구는 신규한 DNA 또는 단백질을 검출 및 정량할 수 있는 시험 방법을 필요로 한다. 본 발명은 사료 효소의 검출 및 정량용 면역학적 방법, 시약 및 키트를 제공함으로써 이러한 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
효소 또는 샘플 중 효소의 검출 및 측정 방법, 키트 및 시약을 제공한다. 바람직하게는, 검출할 단백질은 하나 이상의 파이타제, 자일라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 글루코아밀라제 및 프로테아제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 당해 단백질은 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 각종 미생물, 또는 옥수수, 밀, 쌀, 캐놀라 및 자주개자리를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 식물 내에서 생산될 수 있다. 특히, 당해 단백질은 사료 또는 당해 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 식물 내에서 검출된다. 당해 사료는 동물 사료이다. 동물 사료는 단위동물 또는 반추동물의 사료일 수 있다. 당해 사료는 분말사료 및/또는 펠렛사료일 수 있다.
당해 시약은 정제된 단백질 및 단백질에 특이적인 항체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 단백질은 파이타제이다. 파이타제 단백질을 이.콜라이 봉입체로부터 분리할 수 있으며 동물에 투여하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 대안적으로, 당해 단백질을 이.콜라이 세포 추출물과 같은 가용성 세포 추출물로부터 분리할 수 있다.
항체는 단백질에 대한 고도의 민감성 및 특이성을 가지며, 동물 또는 유전적으로 변형된 개체에서 효소적으로 활성인 단백질의 검출을 위한 면역검정법에 유용하다.
당해 방법은 본원에 기술된 항체를 사용하는 면역검정이며 저농도의 단백질을 검출할 수 있다. 당해 항체는 정제되어 있으며, 따라서 샘플 내에 존재할 수 있는 기타 단백질과 최소한으로 반응한다.
당해 항체 및/또는 단백질은 당해 단백질의 검출을 위한 통상의 면역검정 시약을 갖는 키트에서 어셈블리된다.
샘플 중의 단백질의 검출 및 측정 방법, 키트 및 시약을 제공한다. 검출할 단백질은 하나 이상의 사료 효소(예를 들면, 피아타제, 자일라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 글루코아밀라제 및 프로테아제)를 포함한다. 당해 단백질을 각종 종(이.콜라이, 에스.팜브 및 피.파스토리스를 포함하지만, 이에 제한되지는 않음)으로부터 생산할 수 있다. 특히, 파이타제 단백질이 동물 사료 및 파이타제 유전자와 같은 목적하는 사료 효소 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 식물 내에서 검출된다.
당해 시약은 항원성 펩타이드/단백질 및 항체를 포함할 수 있다. 항원성 펩타이드/단백질은 항체와 면역-반응성이다. 항원성 펩타이드/단백질은 상이한 종에서 생산된 단백질에 의해 공유되는 통상의 에피토프를 갖는다. 펩타이드/단백질을 분리 또는 합성하고 동물에 투여하여 항체를 생산한다.
파이타제에 대하여, 당해 항체는 각종 종에서 생산된 파이타제 단백질에 대 한 고도의 민감성 및 교차-반응성을 가지며, 따라서 파이타제 유전자를 발현하도록 조작한, 유전적으로 변형된 개체, 특히 식물의 검출을 위한 면역검정 방법에 유용하다.
당해 방법은 본원에 기술된 항체를 사용하는 면역검정법이며 동물 사료 및 유전적으로 증강된 곡물 샘플 내의 저농도의 파이타제 단백질을 검출할 수 있다. 당해 항체는 에피토프 또는 파이타제 유전자에 의해 발현된 파이타제 상의 통상의 에피토프와 면역반응성이며 샘플 내에 존재할 수 있는 기타 단백질과 최소한으로 반응하고, 따라서 곡물 샘플과 같은 샘플 내의 유전적으로 변형된 개체의 존재의 정확한 측정을 제공한다.
에피토프, 항체 또는 둘 다를 단백질 검출용 통상의 면역검정 시약을 갖는 키트 내로 총체적으로 어셈블리한다. 당해 키트는 임의로 모노클로날 및 폴리클로날 항체 둘 다 및 샘플 중의 단백질 또는 사료 효소의 존재의 검출용 기준을 포함할 수 있다.
상기한 관점에서, 샘플 중의 특정한 단백질 또는 사료 효소를 확인할 수 있게 할 기술의 발전에 대한 진정한 요구가 있어 왔다.
본 발명의 기타 목적, 특성 및 이점은 하기한 상세한 설명에 의해 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 영역 내의 다양한 변화 및 변형이 본 상세한 설명에 의해 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이기 때문에, 본 발명의 바람직한 양태를 지시하는, 상세한 설명 및 특정한 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공한 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 파이타제 활성에 대한 표준 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 2는 ELISA 및 효소-활성 검정 둘 다에서의 파이타제 효소의 99℃에서의 항온처리 시간 대 상대 활성 %를 나타내는 그래프이다. ELISA 내에서의 파이타제 효소의 검출은 효소-활성 검정 내에서 검출된 활성량에 대응한다.
도 3은 99℃에서 1시간 이하로 항온처리한 후의 파이타제의 검출(화살표)을 나타낸 면역띠 시험의 스캔한 사본이다. 99℃에서 약 20분 후, 파이타제 검출의 감소가 관찰되었다.
도 4는 예시적 면역검정 시험 키트 및 이를 사용하는 방법의 묘사이다.
샘플 중의 단백질의 검출 방법, 키트 및 시약을 본원에 기술하였다. 바람직하게는, 단백질은 사료 효소이며, 보다 바람직하게는, 사료 효소에는 파이타제, 자일라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 글루코아밀라제 및 프로테아제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법론은 동물 사료와 같은 샘플 중의 임의의 효소를 검출하는 데 사용될 수 있다. 많은 사료 효소는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 다수의 파이타제가 공지되어 있으며, 이의 검출은 본 발명을 사용하여 수행할 수 있다. 공지된 파이타제에는 국제공개공보 제01/90333호, 명칭 "재조합 세균 파이타제 및 이의 용도"; 국제공개공보 제99/08539호, 명칭 "신규한 파이타제"; 미국 특허 제10/334,672호, 명칭 "동물 사료에 대한 미생물에 의해 발현된 내열성 파이타제"; 및 미국 특허 제10/334,671호, 명칭 "동물 사료에 대한 내열성 파이타제"에 기술된 파이타제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않으며, 각각 모두 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되어 있다.
형질전환 식물 내의 단백질 및 이들로부터 생산된 생성물(식품 분획을 포함하여)의 검출용 면역검정법을 제작한 경우, 시험이 각종 유전자로부터의 단백질의 검출 능력을 갖는 것이 중요하다. 따라서, 교차-반응 항체가 성공적인 상업적 생성물의 개발에 매우 중요하다.
당해 시약은 상이한 유전자로부터 발현된 단백질과 교차-반응성인 통상의 에피토프 및 항-단백질 항체를 공유하는 항원성 단백질 또는 펩타이드이다. 당해 방법은 단백질의 민감하고, 특이적인 검출, 특히, 동물 사료 내 및 농작물과 같은 유전적으로 조작된 식물 내의 단백질의 검출을 위한 면역검정이다. 당해 키트는 아래에 보다 상세히 기술한 면역검정법에 사용하기 위한, 본원에 기술한 항-단백질 항체 및 기타 시약, 특히 띠 시험 형태에 사용되는 것들을 함유한다.
항원성 단백질
파이타제와 같은 재조합 단백질의 제조를 위해, 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 숙주 균주의 적합한 세포 밀도로의 성장(예를 들면, 세균, 곤충 또는 효모 숙주), 선별된 프로모터를 적합한 방법(예를 들면, 온도 변화 또는 화학적 유도)으로 유도할 수 있고, 세포를 추가의 기간 동안 배양하여, 재조합 효소를 산출한다. 이어서 통상 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 물리적 또는 화학적 방법으로 파쇄시키고, 수득한 조 추출물을 추가의 정제를 위해 보유한다.
단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포를 동결-해동 주기, 초음파, 기계적 파쇄, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 통상의 방법(이들 방법은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다)에 의해 파쇄할 수 있다.
당해 효소를 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 성숙한 단백질의 외형을 완성시키는 중, 필수적으로 단백질 재폴딩 단계를 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.
항원성 펩타이드
항원성 펩타이드는 각종 종 발현 단백질, 바람직하게는 각종 미생물로부터 발현된 단백질과 에피토프를 공유하는 단백질 표면 펩타이드일 수 있다.
당해 펩타이드는 단백질의 검출 및 정량용 진단 표지로서 매우 유용하다. 또한 당해 펩타이드는 성공적인 상업적 생성물에 요구되는 우수한 민감성을 갖는 항체, 시험기 및 키트를 제조하는 데 유용하다.
한 양태에서, 당해 펩타이드는 단백질-암호화 유전자를 친화 칼럼 정제와 같은, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상의 기법을 사용하여 발현시킨 세포 배양물로부터 분리하거나, 당해 펩타이드의 아미노산 서열을 생성하고 당해 분야에 공지된 방법에 따라 당해 펩타이드를 합성한다.
상기 제시된 특성을 갖는 항원성 펩타이드는 파이타제 단백질과 반응성인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 제조에 유용하다.
항체
본 발명에 유용한 항체는 포유동물, 특히, 토끼, 닭, 마우스 또는 염소를 사용하여 제조할 수 있다. 접종 프로그램은 결정적인 것은 아니며 당해 분야에서 이러한 목적을 위해 일반적으로 사용되는 임의의 것일 수 있다. 이러한 과정이 예를 들면, 문헌[참조: Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, 92-115쪽]에 기술되어 있다.
파이타제의 검출을 위한 바람직한 항체는 이.콜라이 봉입체에서 생산된 재조합 파이타제에 대해 면역친화적으로 정제된 토끼 항체, 닭 항체 및 염소 항체이다. 파이타제를 검출 및 정량하기 위해, 당해 항체를 바람직하게는, 효소, 방사선 동위원소 및 라텍스 비드 또는 콜로이드성 금과 같은 착색된 입자를 포함하는 라벨을 직접 사용하여, 라벨링한다. 다른 양태에서, 당해 항체를 예를 들면, 제2 항체와 같은 항체, 단백질 A 또는 단백질 G에 결합하는 라벨링된 물질과 반응시켜 간접적으로 라벨링한다.
폴리클로날 항체
한 양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체의 제조방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체를 예를 들면, 면역화제 및 필요에 따라, 아쥬반트를 1회 이상 주사하여, 동물에서 성숙시킬 수 있다. 통상, 면역화제 및/또는 아쥬반트를 다회의 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에 주사할 것이다. 면역화제는 사료 효소 또는 이의 융합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 당해 제제는 파이타제 폴리펩타이드 또는 이의 융합 단백질이다. 다른 방법에서, 면역화제를 면역화된 포유동물 내의 면역원성인 것으로 공지된 단백질과 접합시킨다. 이러한 면역원성 단백질의 예로는 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 타이로글로불린 및 대두 트립신 억제제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 아쥬반트의 예로는 프로인트(Freund) 완전 아쥬반트 및 MPL-TDM 아쥬반트(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)가 포함된다. 당해 분야의 숙련가는 불필요한 실험 없이 면역화 프로토콜을 선택할 수 있다. 바람직한 항체는 분배 채널에서 상품 곡물의 대량 샘플 중의 적당한 농도에서의 파이타제 단백질, 예를 들면, 형질전환 파이타제 단백질(이에 제한되지는 않음)과 같은 사료 효소의 검출에 고도로 민감하다. 바람직하게는, 당해 항체는 약 0.059ng/㎖의 고도의 민감성으로, 파이타제 단백질과 같은 사료 효소를 검출한다. 고도의 민감성 항체는 잎, 줄기, 씨, 대, 뿌리 등과 같은 유전적으로 조작된 곡물 조직 중 파이타제 단백질과 같은 저농도의 사료 효소 또는 식품 분획과 같은 이러한 곡물로부터 유래한 생성물의 검출에 유용하다.
모노클로날 항체
대안적으로, 항-파이타제 항체와 같은 항-사료 효소 항체는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체를 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)]에 기술된 바와 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조한다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 기타 적합한 숙주 동물을 통상적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산 능력을 갖는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 당해 림프구를 시험관 내에서 면역화시킬 수 있다.
면역화제는 통상 목적하는 폴리펩타이드 또는 이의 융합 단백질을 포함한다. 일반적으로, 사람 기원의 세포가 목적되는 경우, 말초 혈액 림프구("PBL")를 사용하거나, 사람이 아닌 포유동물 근원이 목적되는 경우, 비장 세포 또는 림프 결절 세포를 사용한다. 이어서, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 불멸화시킨 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다[참조: Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불멸화시킨 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 사람 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주를 사용한다. 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된, 불멸화시킨 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양한다. 예를 들면, 모세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT 또는 HPRT)가 결핍되어 있는 경우, 통상 하이브리도마용 배양 배지는 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘("HAT 배지")을 포함하며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 막는다.
바람직한 불멸화된 세포주는 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체와 효율적으로 융합되며, 이의 안정하고 높은 항체 발현 수준을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감하다. 보다 바람직한 불멸화된 세포주는 쥐 골수종 주이며, 이는 예를 들면, 기관[Salk Institute Cell Distribution Center, 캘리포니아주 샌디에고 소재] 및 기관[American Type Culture Collection, 버지니아주 마나싸스 소재]으로부터 입수할 수 있다. 사람 골수종 및 마우스-사람 헤테로골수종 세포주는 또한 사람 모노클로날 항체의 생성물용으로 기술되어 왔다[참조: Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987, pp.51-63].
이어서 하이브리도마 세포를 배양하는 배양 배지를 PRO로 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역-침전 또는 방사선-면역검정(RIA) 또는 효소-연결 면역흡수 검정(ELISA)과 같은 시험관 내 결합 검정법으로 측정한다. 이러한 기법 및 검정법은 당해 분야에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화력은 예를 들면, 문헌[참조: Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem, 107:220(1980)]으로 측정할 수 있다.
목적하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론을 희석 과정을 제한함으로써 계대복제하고 표준 방법(상기 Goding의 문헌 참조)으로 배양한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지에는 예를 들면, 둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지 및 RPMI-1640 배지가 포함된다. 대안적으로, 하이브리도마 세포를 포유동물에서 복수로서 생체 내에서 증식시킨다. 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체를 통상의 면역글로불린 정제 과정(예를 들면, 단백질 A-세파로스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피)에 의해 배양 배지 또는 복수 체액으로부터 분리 또는 정제한다.
모노클로날 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조된다. 본 발명의 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA를 통상의 과정을 사용하여(예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여) 용이하게 분리하고 서열화한다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 원료로 소용된다. 분리한 뒤, DNA를 발현 벡터 내로 위치시킨 후, 다른 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성한다. 또한 DNA를 예를 들면, 상동성 쥐 서열 대신 사람 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열로 치환시키거나(미국 특허 제4,816,567호; Morrison 등, 상기한 바와 같음), 면역글로불린 암호화 서열을 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열 모두 또는 일부에 공유 결합시켜 변형시킨다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드로 본 발명의 항체의 불변 도메인을 치환시키거나 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 치환시켜 키메라 이가 항체를 제조한다.
다른 양태에서, 당해 항체는 일가 항체이다. 일가 항체의 제조 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 개질된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 일반적으로 중쇄 교차를 예방하기 위해 중쇄를 Fc 영역 중 임의의 지점에서 절단한다. 대안적으로, 관련 시스테인 잔기를 기타 아미노산 잔기로 치환시키거나 결실시켜 교차를 예방한다. 시험관 내 방법 또한 일가 항체를 제조하는 데 적합하다. 이의 단편, 특히, Fab 단편을 제조하기 위한 항체의 분해는 당해 분야에 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수행할 수 있다.
당해 분야에 공지된 기타 방법에는 본원에 참조로서 인용되어 있는 문헌[참조: Keamey et al., J. Immunol. 123:1548-1558(1979)]의 방법이 포함된다. 간략히, 마우스 또는 토끼와 같은 동물을 아쥬반트 중 면역원으로 접종하고, 비장 세포를 수거하여 골수종 세포주와 혼합한다. 당해 세포를 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 융합되도록 유도한다. 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)을 함유하는 선별 배지에 세포를 도말하여 화학적으로 하이브리도마를 스크리닝한다. 항-파이타제 모노클로날 항체의 생산 능력에 대해 하이브리도마를 연속적으로 선별한다. 항체 생산 하이브리도마를 미래의 생산을 위해 복제, 팽창 및 동결 저장한다.
다른 양태에서, 항체를 사료 효소, 특히, 파이타제 단백질의 동정 및 정량을 위해 검출가능한 라벨로 직접 라벨링한다. 면역검정법에 사용되는 라벨은 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 효소, 방사선 동위원소 및 콜로이드성 금 및 라텍스 비드와 같은 착색 입자를 포함하는 형광, 발광 및 발색성 물질이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로, 항체를 단백질 A 또는 G와 같은 면역글로불린 또는 제2 항체에 대해 친화성을 갖는 라벨링된 물질과 반응시켜 간접적으로 라벨링한다. 항체를 제2의 물질과 접합시키고 항체에 접합된 제2의 물체에 대해 친화성을 갖는 제3의 라벨링된 물질을 사용하여 검출한다. 예를 들면, 항체를 비오틴에 접합시키고 항체-비오틴 접합체를 라벨링된 아비딘 또는 스트렙파비딘을 사용하여 검출한다.
다른 양태에서, 항체를 합텐에 접합시키고 항체-합텐 접합체를 라벨링된 항-합텐 항체를 사용하여 검출한다. 항체 및 검정 접합체를 라벨링하는 이들 및 기타 방법이 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다.
사료 효소 단백질에 대해 유사하거나 우수한 민감성을 갖는 항-사료 효소, 특히, 항-파이타제, 모노클로날 및 폴리클로날 항체는 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 방법에 따라, 사료 효소, 특히 상기한 파이타제 단백질로 동물을 면역화시키고, 당해 단백질과 반응하는 항체를 분리하고, 혈액과 같은 생물학적 체액으로부터 항체를 수집 및 정제하여 생산한다.
면역검정
당해 항체를 하기한 면역검정법을 사용하여 목적하는 사료 효소 또는 단백질 검출용의 통상의 면역검정 시약을 갖는 키트에 총체적으로 어셈블리한다. 당해 키트는 임의로 모노클로날 및 폴리클로날 항체 둘 다 및 샘플 내의 효소의 존재를 검출하기 위한 기준을 함유할 수 있다. 이들 시약을 함유하는 키트는 당해 단백질의 단순하고 빠른 현장 검출을 제공한다.
상기한 항체를 다수의 상이한 면역검정법의 기본 시약으로 사용하여 샘플 중 사료 효소의 존재를 검출한다. 당해 항체를 임의의 유형의 면역 검정법에 정성적 또는 정량적으로 사용한다.
통상의 정량적 샌드위치 검정에는 3가지의 기본 부분이 있다. 예를 들면, 파이타제와 같은 사료 효소의 검정에서, 유전적으로 변형시킨 식물 추출물 또는 닭 사료와 같은 사료 추출물 중 파이타제 단백질을 제1 항체를 사용하여 고체 상에 포획한다. 한 양태에서, 제1 항체는 토끼 항-사료 효소 항체이다. 이어서 "샌드위치"를 웰에 첨가시킨 제1 항체, 사료 효소 단백질 및 제2 항체 사이에 형성한다. 한 양태에서, 제2 항체는 염소 항-사료 효소 항체이다. 세척 단계 후, 결합되지 않은 제2 항체를 제거하고, 결합된 제2 항체를 라벨링된 항체를 사용하여 검출한다. 특정 양태에서, 검출 항체는 알칼리성 포스파타제-라벨링된 당나귀 항-염소 항체이다. 검출 효소에 대한 기질, 알칼리성 포스파타제를 첨가하고 각각의 웰의 흡광도를 판독하여 발색을 측정한다. 표준 곡선은 농도 대 흡광도를 플롯팅하기 위해 4-매개변수 곡선 적합도를 사용한다.
본 발명의 한 양태에서, 사료 효소의 검출을 위한 면역검정법은
a) 샘플의 추출물을 제조하는 단계;
b) 당해 추출물의 일부를 사료 효소에 결합하고 고체 담체에 결합된 제1 항-사료 효소 항체, 및 사료 효소에 결합하는 제2 항-사료 효소 항체와 항온처리하여 항체-중합체-항체 복합체를 형성하는 단계;
c) 항체-중합체-항체 복합체를 세척하여 결합되지 않은 제2 항체를 제거하는 단계;
d) 제2 항체와 면역학적으로 반응하는 검출 항체(검출 항체는 라벨링되어 있음)를 첨가하는 단계; 및
e) 결합되거나 결합되지 않은 라벨링된 항체의 양을 측정하여 유체 중 수분 처리 중합체의 농도를 산정하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 사료 효소는 파이타제, 자일라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 글루코아밀라제 및/또는 프로테아제 단백질이다. 보다 바람직한 양태에서, 파이타제는 열안정성 파이타제이다.
본 발명의 기타 양태에서, 검출가능한 라벨은 효소이다. 보다 바람직한 양태에서, 효소는 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제 또는 β-갈락토시다제이다.
기타 양태에서, 당해 효소는 불용성 반응 생성물을 생산한다.
본 발명은 또한
a) 샘플로부터 사료 효소를 추출하는 기구;
b) 고체 지지체에 결합된 제1 항-사료 효소 항체를 포함하는 고체 지지체;
c) 제2 항-사료 효소 항체; 및
d) 제2 항체에 면역학적으로 결합 가능한 검출 항체(검출 항체는 검출 기구로 라벨링한다)를 포함하는, 면역검정 방법에 의한 검출 및 정량용 키트를 제공한다.
특정 양태에서, 검출 방법은 효소이다. 보다 바람직한 양태에서, 검출 효소는 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제 또는 β-갈락토시다제이다.
다른 양태에서, 효소는 가용성 또는 불용성 반응 생성물을 생산한다.
다른 양태에서, 당해 키트는 추가로 효소에 대한 기질을 포함한다.
이러한 면역검정법은 또한 효소-결합 면역흡착 검정으로 지칭된다(ELISA).
상기한 항체를 또한 파이타제와 같은 사료 효소의 검출을 위한 정성적 면역검정에 사용한다. 이러한 검정법을 통상 면역띠로 지칭한다. 면역띠는 액체 샘플을 모세관 작용으로 배수시키는 막 및 필터를 사용하여 제조한다. 샘플 중 파이타제를 면역띠에 함유된 항체와 반응시키며, 이는 띠의 길이를 따라 이동한다. 닭 사료 중 파이타제 단백질을 검출하기 위해, 사료를 완충액으로 세척하고, 고체 물질로부터 분리하고 면역띠에 첨가한다. 액체 샘플이 면역띠의 반대 끝으로 이동하면서, 파이타제가 특이적 항체와 반응하고 가시화되는 선에 포획된다. 시험기 선 상의 신호의 검출은 파이타제가 샘플 내에 있음을 나타낸다.
한 양태에서, 본 발명은
a) 추출물 중 사료 효소를 면역학적으로 인식하는 제1 항체의 존재하에 샘플의 추출물을 제조하여 제1 항체-사료 효소 복합체를 형성하는 단계;
b) 3차원에서의 유의적 측정값을 갖는 고체 상 형태를 제조하여 이를 사료 효소를 면역학적으로 인식할 수 있는 목적하는 제2 항체에 결합시켜 다수의 세포 간 공간을 갖는 상당한 부피를 형성하는 단계(여기서, 제2 항체를 검출 기구와 접합시키고 제2 항체 또한 사료 효소를 면역학적으로 인식한다);
d) 단계 (a)의 추출물을 단계 (b)의 제조된 형태와 배합하여, 당해 추출물을 제1 항체-사료 효소 복합체를 포획하는 제조된 고체 상 형태의 세포 간 공간을 통해 배수시키는 단계;
e) 당해 포획된 제1 항체-사료 효소 복합체의 존재로 사료 효소를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 중 사료 효소의 검출을 위한 면역검정법을 제공한다.
다른 양태에서, 사료 효소는 파이타제, 자일라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 글루코아밀라제 및/또는 프로테아제 단백질이다. 바람직한 양태에서, 파이타제는 열안정성 파이타제이다.
다른 양태에서, 고체 상 형식은 셀룰라제 아세테이트, 셀룰로스, 니트로셀룰로스 또는 나일론이다. 다른 양태에서, 고체 상 형태는 다중의 연속 적층으로 구성되며, 여기서, 각각의 층은 상이한 사료 효소를 포획할 수 있다. 바람직한 양태에서, 고체 상은 추가로 고체 상 형태의 샘플 흡수 패드를 포함한다. 보다 바람직한 양태에서, 면역검정법은 라벨링된 항-사료 효소 항체를 포함하는 띠를 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 검출 기구는 콜로이드성 금이다.
상기한 항체를 사용하는 고도로 민감한 면역검정법을 제공한다. 당해 검정법은 파이타제 유전자와 같은 사료 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하도록 조작한 유전적으로 변형 개체의 검출에 유용하다. 면역검정법은 동물 사료와 같은 샘플 및 유전적으로 증강된 식물 샘플 중의 저농도의 단백질을 검출할 수 있다.
상기한 바와 같은, 면역검정법에 사용되는 항체는 에피토프 또는 사료 효소, 특히 파이타제 단백질 상의 통상의 에피토프와 면역-반응성이며, 각종 미생물에 의해 발현되며 샘플 중에 존재할 수 있는 기타 단백질과 최소한으로 반응하여 곡물 샘플과 같은 샘플 중의 유전적으로 변형된 개체의 존재를 정확하게 검출한다.
면역검정법은 동물 사료 및 식물 물질과 같은 농작물 샘플을 포함하는 각종 샘플 중 목적하는 사료 효소 단백질, 예를 들면, 파이타제의 존재 또는 양을 검출하는 데 유용하다. 당해 샘플을 목적하는 단백질이 항체에 접근할 수 있는 임의의 원료로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 당해 샘플은 뿌리, 줄기, 대, 잎 또는 씨를 포함하는 임의의 식물 조직 또는 추출물, 또는 식품 분획과 같은 당해 곡물로부터 유래한 생성물일 수 있다.
상기한 항체 중 하나 이상을 예를 들면, 사료 효소, 특히, 파이타제 단백질의 검출을 위한 이종 또는 동종, 샌드위치 또는 경쟁적 면역검정법에 사용한다. 항체를 검출가능한 라벨로 라벨링하거나 고체 상에 커플링시킨다. 고체 상에 항체를 커플링시키는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 면역검정 방법에 따라, 사료 효소를 함유하는 샘플을 항체와 샘플 중 파이타제 단백질에 대한 항체의 결합을 촉진시키는 조건 하에 충분한 시간 동안 반응시킨다. 당해 분야의 숙련가는 면역검정 시약 및 샘플을 상이한 배합 및 순서로 반응시킬 수 있음을 이해할 것이다. 결합되지 않은 시약으로부터 고체 상에 결합된 시약을 분리시키기 위해, 입자 여과, 피복된 튜브 또는 웰로부터의 반응 용액의 경사배출, 자기 분리, 모세관 작용 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기타 방법과 같은 물리적 방법을 사용한다. 또한 고체 상의 분리 세척이 당해 방법에 포함될 수 있음을 이해할 것이다.
샘플 중 파이타제와 같은 사료 효소 단백질의 농도를 샘플에 의해 제조된 색의 강도를 색 카드에 비교하거나 반사율측정기를 사용하여 측정한다.
수득된 반응 혼합물 또는 항체 및 샘플의 배합물은 항체-사료 효소 결합 동역학을 최적화시키는 용액 중에서 제조한다. 적합한 용액은 수용액 또는 완충액이다. 당해 용액은 바람직하게는 특이적 결합은 촉진시키고, 비특이적 결합은 최소화시키고, 사료 효소는 용해시키고, 시약 반응성은 안정화 및 보존시킬 조건 하에 제공되며, 완충액, 세정제, 용제, 염, 킬레이터, 단백질, 중합체, 탄수화물, 당 및 당해 분야에 공지된 기타 물질을 함유할 수 있다.
반응 혼합물 용액을 충분한 시간 동안 반응시켜 항체가 사료 효소와 반응 및 결합하게 하여 항체-사료 효소 복합체를 형성한다. 검정을 완료하는 데 필요한 시간을 최소화시키기 위해 결합을 초래하는 최단 반응 시간이 요구된다. 면역띠 시험을 위한 적합한 반응 시간은 10분 이하 또는 약 1분 내지 약 10분이다. 5분 미만의 반응 시간이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 반응 시간은 3분 미만이다. 시약을 최적화시킴에 따라, 시약이 배합되면서 결합이 실질적으로 완료될 수 있다.
반응을 시약이 분해되거나 불활성화되지 않는 임의의 온도에서 수행한다. 약 18℃ 내지 30℃ 사이의 온도가 바람직하며, 가장 바람직한 반응 온도는 주위 온도 또는 실온(대략 22℃)이다.
면역띠와 같은 고체 상 형태가 당해 면역검정에 이상적으로 적합하다. 시험 띠는 액체 샘플을 모세관 작용으로 배수시키는 다공성 성분, 막 및 필터로 구성된다. 샘플 중 사료 효소를 시험 띠의 길이를 따라 이동시키면서, 시험 띠 내에 함유된 시험 시약과 반응시킨다. 곡물 또는 씨 내의 단백질을 검출하기 위해, 당해 곡물을 분말로 연마하고 이어서 고체 물질로부터 분리한 액체를 사용하여 분말로부터 단백질을 추출하고 당해 시험기를 사용하여 검정한다. 액체를 면역띠에 적용시키고, 사료 효소를 당해 띠의 선단부를 향해 이동시킨다. 띠 아래로 이동함에 따라, 사료 효소는 적용된 시약과 반응하거나 띠 상에 고정되어 검출가능한 신호 생성물을 야기한다. 신호의 검출은 샘플 중의 사료 효소의 존재를 나타낸다.
한 양태에서, 고체 상 형태는 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스, 니트로셀룰로스 또는 나일론이다. 바람직한 양태에서, 고체 상 형태는 니트로셀룰로스이다.
다른 양태에서, 고체 상 형태는 샘플 흡수 패드, 니트로셀룰로스의 띠 및 라벨링된 항-사료 효소 항체를 포함하는 기저 패드를 포함한다.
다른 양태에서, 고체 상 형태는 다중 연속 적층으로 구성되며, 각각의 층은 상이한 사료 효소를 포획할 수 있다.
면역검정 키트
샘플 중 사료 효소 단백질의 검출용 면역검정 키트는 상기한 항체 중 하나 이상을 함유한다. 당해 키트는 부가적으로 샘플을 수득하기 위한 장비, 시약을 함유하는 용기, 계시 기구, 샘플 희석용 완충액 및 비색계, 반사율측정기 또는 색 변화를 측정할 수 있는 기준을 포함할 수 있다. 당해 키트는 상기한 바와 같은 면역띠 형태의 시약을 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 항체를 포함하는 시약은 무수물이다. 수성 샘플을 바이얼 또는 띠에 첨가하여 무수 시약을 가용화시키면, 반응이 유도된다.
상기한 시약, 면역검정법 및 키트를 다음의 비제한적 실시예를 참조하여 추가로 이해하게 될 것이다. 아래의 실시예는 사료 또는 기타 식물 물질과 같은 샘플 중 사료 효소, 특히, 파이타제의 검출에 사용될 수 있는 통상의 실험 프로토콜 및 시약을 보여준다. 이러한 실시예는 예시의 목적으로 제공되는 것이며 제한을 의도하지 않는다.
상기한 다수의 참조문헌은 이의 전문이 본원에 모두 인용되어 있다.
이들 방법 및 물질은 옥수수 샘플을 제조하는 일반적인 과정 및 하기한 실시예에 사용된 모노클로날 항체의 제조를 기술한다.
재료 및 방법
옥수수 샘플: 옥수수 추출물은 Hi II 씨 또는 A188 씨(비형질전환) 또는 유전적으로 변형된 파이타제 씨로부터 유래하였다. 5개의 낟알을 Kleco 조직 연마기를 사용하여 연마하였다. 수득한 옥수수 분말을 증류수 5㎖에 현탁시켜 당해 단백질을 가용화시켰다. 상층액을 ELISA 또는 면역띠로 시험하였다.
폴리클로날 항체의 제조
면역화를 위해: 초기 주사 후, 동물(토끼 또는 염소)를 28일 후에 추가접종시킨다. 그 후의 각각의 연속한 추가접종은 21일마다 한다. 당해 동물을 각각의 추가접종 후 10일 동안 사육한다.
닭에서, 제1 추가접종은 초기 주사 후 7일째에 하며, 그 후 28일 마다 추가접종한다. 닭을 각각의 추가접종 후 10일 동안 사육하고, 우수한 항체 역가가 검출된 경우, 추가접종 후 낳은 알을 수거한다.
면역화제는 이.콜라이 발현 시스템으로부터 정제한 전체 파이타제 단백질이 었다. 동물로의 1차 주사와 함께, 당해 단백질을 완전 프로인트 아쥬반트에 유화시킨다. 추가접종물은 불완전 프로인트 아쥬반트중에 있다. 폴리클로날 항체를 제조하기 위해 사용한 동물은 토기, 닭 및 염소였다.
파이타제(Nov9X) 정제:
10% 소르비톨 및 10% NaCl(pH 4.2)과 제형화시킨 파이타제(Nov9X)를 SnakeSkin 10K MWCO 투석 튜브(제조원[Pierce], 일리노이주 록포드 소재)를 사용하여 25mM 트리스-HCl, pH 8.0에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 다음의 투석 고체 (NH4)2SO4를 0℃에서 초기에는 25% 포화도, 이어서 50% 및 마지막으로 75% 포화도로 파이타제 혼합물에 첨가하였다. 25% 포화도로 (NH4)2SO4를 첨가하면서, 당해 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 20,000rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 경사배출된 상층액에 (NH4)2SO4를 50% 포화도로 첨가하는 반면, 펠렛은 25mM 트리스-HCl, pH 9.0에 재현탁시켰다. 당해 과정을 3회 수행하여 0-25%, 25-50% 및 50-75% 포화도의 Nov9X(NH4)2SO4 펠렛을 수득하였다. SDS-PAGE 분석은 50-75% 분획 중 Nov9X의 존재를 입증하였다. 당해 분획을 25mM 트리스-HCl, pH 9.0에 대하여 투석하고 칼럼 크로마토그래피 정제를 위해 제조하였다.
50-75% (NH4)2SO4 분획으로부터 조 Nov9X TAM을 5.0㎖/분의 유량을 사용하여 HiTrapQ 음이온 교환 칼럼(제조원[Amersham Biosciences], 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에 적재하였다. 30분에 걸쳐 전개시킨 25mM 트리스-HCl, pH 9.0 중 0-0.4M NaCl의 선형 구배를 사용하여 Nov9X를 용출시켰다. 280nm에서의 흡착 측정을 사용하여 크로마토그래피 실행 과정을 진행시켰다. SDS-PAGE 분석 후, 가장 순수한 Nov9X 함유 분획을 수집하였고, Centricon Plus-20 원심분리 농축기(제조원[Millipore], 매사추세츠주 베드포드 소재)를 사용하여 농축시키고 1㎖/분으로 전개시킨 26/60 세파크릴 S100 크기 배제 칼럼(제조원[Amersham Biosciences], 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에 적재하였다. 용출 완충액은 25mM 트리스-HCl, pH 9.0이었다. 순수한 Nov9X를 함유하는 분획을 수집, 농축하고 25mM 트리스-HCl, pH 8.0에 대하여 투석하였고, 하기한 연구를 위해 사용하였다.
실시예 1: 파이타제 ELISA
당해 실시예는 ELISA 면역학적 기법을 사용한 옥수수 샘플 중 파이타제 효소의 검출 및 정량 측정을 기술한다.
과정
다중 웰 플레이트(Nunc, Maxisorp)를 2㎍/㎖의 농도로 토끼 항-파이타제 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 피복시켰고, 붕산완충 염수 pH 8.5(50mM 붕산나트륨/붕산, 75mM NaCl)에서 희석시켰다. 당해 플레이트를 트리스 염기 완충액 pH 8.0(0.05% 트윈-20 및 0.03% 아지드화나트륨을 함유하는 10mm 트리스)(세척 완충액)으로 5회 세척하였다. 주의: 동일한 세척 단계를 각각의 항온처리 기간 후 수행하여 결합하지 않은 항체/샘플을 제거하였다. 이어서 당해 플레이트를 실온에서 PBS/트윈-20/BSA 완충액 pH 7.4{100mM 인산나트륨 중 1% 소 혈청 알부민, 0.05% 트윈-20, 0.03% 아지드화나트륨, 150mM NaCl, pH 7.4(희석액)}으로 45분 동안 차단하 였다. 각각의 샘플의 50㎕를 당해 플레이트에 첨가하고 실온에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. 이어서 염소 항-파이타제 항체(희석액 중 2㎍/㎖로 희석한)를 당해 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 검출 항체(알칼리성 포스파타제-라벨링된 당나귀 항-염소 항체를 희석액 중 1㎍/㎖에 희석시켰다)를 당해 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 기질, 파라니트로페닐포스페이트(pNPP)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 전개시켰다. 참조와 같이 492nm와 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
검정 특성
파이타제 표준 곡선은 4-매개변수 곡선 적합도였다(도 1 참조). 당해 곡선은 0.04 내지 16ng/㎖의 범위에서 선형 대 대수로 플롯팅되었다. 대수 X 축 상에 4-매개변수 표준 곡선을 플롯팅하기 위해, 0ng/㎖ 표준을 0ng/㎖ 대신 0.01ng/㎖에서 분석 프로그램에 대입해야만 한다. 사용된 분석 프로그램은 Tecan SunriseTM 미세플레이트 판독기에 대한 WinSelectTM 소프트웨어였지만, 임의의 4-매개변수 곡선-적합 프로그램이 작동할 것이다.
최소 검출가능한 용량(MDD)은 0 표준으로부터 통계적으로 구분되는 파이타제 단백질의 최저 수준이었다. 최소 검출가능한 용량은 1mg/㎖ 총 단백질에서 네거티브 대조군 옥수수 씨 추출물의 24개의 복제품을 분석하여 산정하였다. 0 표준 평균 O.D.(95% 신뢰 한계)의 2개의 표준 편차를 평균에 추가하였고, 당해 총 O.D. 값의 용량을 표준 곡선을 사용하여 산정하였다. 최소 검출가능한 용량은 0.044ng/㎖ 이었다.
실행 사이(between-run) 정밀도는 21회의 상이한 검정에서 4개의 상이한 대조군 샘플을 검정하여 산정하였다. 당해 샘플은 ELISA 희석액 중에 혼합된 정제된 파이타제였다. 결과가 아래의 표 1에 기술되어 있다. 정밀도는 양호하며, 표준 곡선의 선형부에서 측정된 샘플 농도에 대해 15% 미만이다.
실행 사이 정밀도 시험
샘플 평균 파이타제 ng/㎖ 표준 편차 변동 계수(%)
1 9.65 2.27 23.5%
2 2.99 0.38 12.8%
3 0.94 0.11 12.0%
4 0.39 0.10 25.6%
실행 중(within-run) 정밀도는 다음의 샘플의 20개 내지 24개의 복제품을 시험하여 산정하였다. 당해 샘플은 ELISA 희석액 중에 혼합된 파이타제였다. 결과가 아래의 표 2에 기술되어 있다. 모든 샘플에서 매우 우수한 정밀도를 얻었으며, 이는 1회의 검정 실행 중 우수한 재생성을 나타낸다.
실행 중 정밀도 시험
샘플 평균 파이타제 ng/㎖ 표준 편차 변동 계수(%)
1 0.463 0.030 6.44%
2 2.293 0.264 11.51%
3 5.224 0.787 15.07%
검정의 선형성을 시험하기 위해 4개의 옥수수 씨 추출물을 ELISA 희석액으로 희석시켰다. 옥수수 추출물은 Hi II 씨 또는 A188 씨(비-형질전환) 또는 유전적으로 변형된 파이타제 씨에서 유래하였다. 5개의 낟알을 Kleco 조직 연마기로 연마하였다. 수득한 옥수수 분말을 증류수 5㎖에 현탁시켜 단백질을 가용화시켰다. 상층액을 ELISA 또는 띠로 시험하였다. 희석된 샘플로부터의 파이타제의 회수 퍼센트는 허용가능하였다.
검정 시험의 선형성
샘플 희석 측정된 파이타제(ng/㎖) 측정된 값 X 희석 분획 회수율(%)
A 1/2500 12.76 31900 82%
1/5000 5.85 29250 75%
1/10,000 3.90 39000 100%
B 1/2500 6.87 17175 52%
1/5000 6.90 34500 104%
1/10,000 3.33 33300 100%
C 1/2500 3.58 8950 63%
1/5000 2.35 11750 83%
1/10,000 1.41 14100 100%
D 1/2500 6.11 15275 72%
1/5000 3.54 17700 83%
1/10,000 2.13 21300 100%
실시예 2: 파이타제 면역띠
당해 실시예는 샘플 중 파이타제의 존재를 시험하기 위한 면역띠 검정의 사용을 기술한다.
과정
닭 사료를 50㎖ 원심분리 튜브에 15㎖ 표시까지 첨가하여 메쉬 닭 사료의 추출물을 제조하였다. 당해 양의 사료를 추출 백 내의 그물 삽입물의 한 편에 첨가하였다. 추출 완충액(0.5% 트윈-20을 함유하는 0.1M 붕산염 25㎖, pH 7.5)을 첨가하였고 완충액을 사료 위로 부드럽게 압착하여 모든 사료가 침윤되도록 하였다. 당해 추출물을 10분 이상 실온에서 항온처리한 후, 시험용 면역띠에 3 내지 5방울을 적용하였다.
면역띠
간략히, 측류 면역띠는 플라스틱 지지체(제조원[AristaTM 상표의 플라스틱 카세트], 펜실베니아주 베들레헴 소재) 상에 지지된 니트로셀룰로스(2.5 x 18㎝)의 검출 막을 포함하며, 특이적 토끼(닭 항체 또한 사용할 수 있다) 항-파이타제 폴리클로날 항체의 1mm 선을 분사하였다. 당나귀 항-염소 항체의 시약 대조 선을 최초 항체 선 위로 평형하게 분사하였다. 니트로셀룰로스의 띠의 기저 말단부를 처리된 폴리에스테르 띠 조각으로 덧씌운다. 폴리에스테르 띠는 처음에 용액 B(0.5% BSA, 0.5% 폴리비닐알코올 및 0.1% 트리톤 X-100; 50mM 인산염 완충액, pH 7.4) 및 염소 항-파이타제 항체와 접합시킨 콜로이드성 금으로 처리한다. 폴리에스테르 띠를 건조시킨다. 이어서 폴리에스테르 띠를 면 샘플 적용 패드로 덧씌운다. 샘플 적용 패드를 또한 용액 C(0.1% 트리톤 X-100 및 0.1M 붕산염 완충액 pH 8.5)로 예비처리하고 건조시켰다. 샘플을 시험 항체 위로 통과시키고 니트로셀룰로스 상의 항체 영역을 제어한 후, 샘플로부터 용액을 흡수하기 위해 다른 면 패드를 니트로셀룰로스 띠의 다른 말단 또는 최첨단의 측면에 배치한다. 이어서 당해 완성된 카드를 4mm 시험 띠로 절단하여 샘플 패드 상에 위치하는 타원형 샘플 적용 웰 및 니트로셀룰로스 막의 검출 영역 상에 존재하는 장방형 검출 창을 갖는 플라스틱 카세트에 들어맞게 하였다.
당해 검정은 샘플 웰에 추출물 150㎕(3 내지 5방울)를 첨가하여 수행하였다. 약 5분 내지 10분을 기다린 후, 결과가 결과 창에 나타났다. 파이타제가 샘플 내에 존재한 경우, 이중 적색 선이 결과 창에 나타났다. 하부 선은 파이타제의 존재를 나타내며, 상부 선은 기구가 적합하게 작동함을 입증하는 대조 선이다. 파이타제가 없는 경우, 단 하나의 단일 적색 대조 선만이 결과 창에 나타난다. 샘플 면역띠에 대한 도 3 및 도 4를 참조한다. 도 3은 파이타제의 존재의 검출을 보여준다. 파이타제의 검출은 화살표에 의해 지시된 바와 같이 20분 후에 감소하며, 이는 파이타제가 개시 시에 활성을 잃기 때문이다.
면역띠의 상세한 제조
파이타제 제2 산출 띠-막의 피복
재료
1. AE100 막을 갖는 카드, 2.25 in x 180mm
2. PBS 중 1.0mg/㎖의 닭 항-파이타제 IAP
3. PBS 중 0.15mg/㎖의 잭슨(Jackson) 당나귀 항-염소 항체
4. Pierce RBS 세정제
과정
시험 선 피복:
1. CamagTM 분사기 용적을 vol, 18, enter, enter를 눌러 18(1㎕/cm)로 셋팅한다.
2. 트랙은 track, 1, enter, enter를 눌러 셋팅한다.
3. 가대에 카드를 둔다. 2개의 제지 조각과 카드의 일부를 기구의 전면에 최근접하여 둔다. 카드를 자석으로 고정시킨다.
4. 주사기에 닭 항-파이타제 IAP 1.0mg/㎖을 충전시킨다.
5. 분사 헤드를 30mm에 셋팅한다.
6. 가스 공급기를 열고 gas, calc, run을 눌러 분사를 시작한다. 분사 패턴을 지속성 및 정확성에 대해 면밀하게 관찰한다.
7. 각각의 추가의 카드에 대해 3번 내지 6번 단계를 반복한다.
8. 주사기를 제거하고 Pierce RBS 세정제(20㎕ 농도/㎖ dH2O)로 5회 세척한 후, dH2O로 10회 세척한다.
대조 선 피복:
9. vol, 18, enter, enter를 눌러 CamagTM 분사기 용적을 18(1㎕/cm)로 셋팅한다.
10. track, 1, enter, enter를 눌러 트랙을 셋팅한다.
11. 주사기에 당나귀 항-염소 0.15mg/㎖을 충전시킨다.
12. 분사 헤드를 36mm에 셋팅한다.
13. 가스 공급기를 열고 gas, calc, run을 눌러 분사를 시작한다. 분사 패턴을 지속성 및 정확성에 대해 면밀하게 관찰한다.
14. 각각의 추가의 카드에 대해 11번 내지 13번 단계를 반복한다.
15. 주사기를 제거하고 Pierce RBS 세정제(20㎕ 농도/㎖ dH2O)로 5회 세척한 후, dH2O로 10회 세척한다.
16. 카드를 33℃에서 밤새 건조시킨 후, 실온으로 옮긴다.
17. 실온에서 건조 보관한다.
파이타제 띠-폴리에스테르 상에서의 접합체 피복
재료
1. 금 접합 염소 항-NOV9X, OD=50
2. 용액 B로 처리한 폴리에스테르 시트, 2033 등급
3. 자당
4. 트레할로스
5. Pierce RBS 세정제
과정
18. 금 접합체를 금 희석제를 사용하여 OD = 50으로 희석시킨다.
19. 20% 자당 및 5% 트레할로스를 금 접합체에 첨가하여 안정화시킨다(금 접합체 1㎖ 당 자당 0.2g 및 트레할로스 50mg). 완전히 용해될 때까지 혼합한다.
20. vol, 27, enter, enter를 눌러 CamagTM 용적을 27(1.5㎕/cm)로 셋팅한다.
21. track, 1, enter, enter를 눌러 트랙을 셋팅한다.
22. 가대에 폴리에스테르 시트를 놓고 자석으로 고정시킨다.
23. 주사기에 안정화된 금 접합 염소 항-NOV9X(OD = 50)을 충전시킨다.
24. 분사 헤드를 15mm에 셋팅한다.
25. 가스 공급기를 열고 gas, calc, run을 눌러 분사를 시작한다. 분사 패턴을 지속성 및 정확성에 대해 면밀하게 관찰한다.
26. 분사 헤드를 9mm 이동시킨다(셋팅은 24mm가 될 것이다).
27. 가스 공급기를 열고 가스, 계산, 실행을 눌러 분사를 시작한다.
28. 각각의 실행 동안 9mm를 이동시켜, 전체 폴리에스테르 시트가 충전될 때까지 접합체 분사를 계속한다. 접합체의 8개의 라인이 시트를 충전시킬 것이다.
29. 시트를 37℃에서 1시간 동안 건조시킨다.
30. 금 접합체의 선이 각각의 띠의 정상부를 따라 전개되도록 ¼" 띠로 절단한다.
31. 실온에서 건조 보관한다.
기구의 세척
주사기를 제거하고 Pierce RBS 세정제(20㎕ 농도/㎖ dH2O)로 5회 세척한 후, dH2O로 10회 세척한다.
기구 가대를 dH2O로 세척한다.
파이타제 띠-어셈블리
재료
6. 닭 항-파이타제 IAP 항체로 1.0mg/㎖ 및 1㎕/㎝로 피복시킨 카드
7. 40번 흡수 제지의 5/8" x 180mm 띠(정상 패드)
8. pH 8.6의 용액 C로 처리한 903번 제지의 ¾" x 180mm 띠(기저 패드)
9. 분사된 금 접합체의 ¼" x 180mm 띠(염소 항-NOV9X, 1.5㎕/㎝에서 OD = 50)
10. 장갑
과정
주의: 40% 미만의 습도의 조건 하에서 띠를 어셈블리한다. 장갑을 착용하고 모든 성분을 적용한다.
1. 카드의 기저에서 아교 띠로부터 2개의 라이너를 제거한다.
2. 정상을 따라 금 접합체의 선을 갖는 금 띠를 위치시키고 1 내지 1.5mm로 막을 덧씌운다.
3. 카드의 기저 가장자리를 따라 기저 패드를 위치시키고, 노출된 금 띠가 유지되도록 관리한다.
4. 카드의 정상을 따라 아교 띠로부터 라이너를 제거한다. 막을 1 내지 1.5mm 덧씌운 카드의 정상을 따라 정상 패드를 위치시킨다.
5. 마감된 카드를 띠로 절단하기에 용이해질 때까지 실온에서 건조시켜 보관한다.
6. 띠를 4mm 길이로 절단한다. 1개의 카드는 40개 이하의 띠를 산출할 것이다. 띠를 실온에서 건조 보관한다.
실시예 3: 효소적으로 활성인 파이타제의 검출
과정
피키아(Pichia)가 생산한 정제된 파이타제를 99℃에서 60분 이하 동안 가열하여 불활성화시켰다. 이어서 파이타제를 효소 활성에 대해 시험하였고 파이타제 ELISA에서의 반응성(도 2)과 파이타제 면역띠를 사용한 반응성(도 3)을 비교하였다.
ELISA 비교: 도 2는 99℃에서 항온처리 후 Nov9X의 잔류 활성, 04-28-03, FPLC 정제 TAM Lot # PHY-PP9XR-PB200L, 활성 대 ELISA 데이타의 비교의 그래프를 나타낸다. 이는 ELISA 검정 및 면역띠가 오직 활성 파이타제만을 검출하였을 때 나타남을 입증한다. 가열에 의해 불활성화된 파이타제는 어느 검정법에서도 검출되지 않았다.
실시예 4: 파이타제 면역검정 키트
당해 진단 시험기(도 4를 참조)는 사료 중 파이타제의 신속한(10분) 검출을 위해 설계되었다. 당해 키트는 시험을 수행하는 데 필요한 모든 시약 및 장비를 포함한다. 당해 키트는 100℉(38℃)를 초과하지 않는 주위 온도에서 저장할 수 있다. 당해 시험기를 약간의 습기를 흡수할 수 있는 실리카 겔 건조제를 갖는 밀봉된 내습성 호일 백에 포장한다. 사용하기 전까지 이의 포장에 시험기를 보관한다. 습기찬 곳에 시험기를 두는 것을 피한다.
검정 과정
1. 대 튜브를 15 표시까지 사료로 충전한다. 추출 백 내의 그물 삽입물의 한 편에 당해 양의 사료를 첨가한다.
2. 키트로부터 추출 완충액(25㎖)의 플라스틱 용기 하나를 제거하고 추출 백에 붓는다.
3. 백을 닫고 사료 상의 완충액을 부드럽게 이동시켜 모든 사료가 침윤되게 한다. 10분 이상 기다린다.
4. 포일 백로부터 야외 시험기를 제거하고 편평하고 건조한 표면에 둔다. 건조제를 확인한다. 푸른색이어야 한다. 분홍색인 경우, 당해 시험기는 더 이상 유효하지 않으며 폐기되어야 한다.
5. 전달 피펫을 사용하여, 사료 추출물 3 내지 5방울을 전달하여 야외 시험기의 샘플 웰을 충전시킨다.
6. 샘플 웰 상의 창에 결과가 나타날 때까지 약 5분을 기다린다.
결과
파이타제가 샘플 내에 존재하는 경우, 이중 적색 선이 야외 시험기의 결과 창에 나타난다. 하부 선은 파이타제의 존재를 나타내는 반면, 상부 선은 기구가 적합하게 작동함을 알려주는 대조 선이다. 시험기 선은 대조 선만큼 강하지 않을 것이다. 시험 선에서 나타난 임의의 반응을 포지티브로 간주한다.
파이타제가 존재하지 않는 경우, 단 하나의 단일 적색 대조 선만이 결과 창에 나타난다.
실시예 5: 펠렛화된 사료 중 파이타제의 검출
당해 실시예는 면역띠 검정을 사용하여 펠렛화된 동물 사료 내의 파이타제를 검출함을 증명한다.
방법 및 시약은, 펠렛화된 동물 사료를 임의의 기계 장비를 사용하여 알갱이 또는 분말 정도의 경도로 분쇄하고, 추출 완충액이 붕산염 완충액 대신 수중 0.5% 트윈-20과 5% 메탄올이었던 것을 제외하고, 실시예 4에서 상기한 바와 같다. 또한, 항-파이타제 항체는 토끼 대신 닭으로부터 유래하였다. 결과는 아래의 표 4에 기술되어 있다. 표 4는 Quantum
Figure 112006001074620-PCT00001
파이타제를 ELISA 및 면역띠 검정 둘 다를 사용하여, 메쉬(펠렛화시키기 전) 규정식 및 펠렛 규정식 둘 다에서 검출가능하였음을 보여준다. 표 5는 Quantum 파이타제를 면역띠 및 ELISA 둘 다를 사용하여, 출발 규정식(펠렛화시키기 전) 및 분말 규정식(펠렛화시킨 규정식)에서 검출가능하였음을 보여준다. 활성 또한 효소 검정으로 확인하였다.
Figure 112006001074620-PCT00002
Figure 112006001074620-PCT00003
사료 효소 단백질, 특히 파이타제의 검출을 위한 본 발명의 시약, 방법 및 키트의 변형은 상기한 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이다.
본 발명은 이의 특이적 양태에 대한 참조와 함께 기술되었지만, 수많은 변동, 변형 및 추가의 양태가 가능하며, 따라서, 이러한 변동, 변형 및 양태 모두 본 발명의 영역 내에 속하는 것으로 간주되는 것으로 판단되어야 할 것이다.
수많은 특허, 출원 및 참조문헌이 개시되어 있거나 본 명세서 내에 인용되어 있으며, 모두 이의 전문이 참조로서 인용되어 있다.

Claims (25)

  1. a) 추출물 중 사료 효소를 면역학적으로 인식하는 제1 항체의 존재하에 샘플의 추출물을 제조하여 제1 항체-사료 효소 복합체를 형성하는 단계;
    b) 3차원에서의 유의적 측정값을 갖는 고체 상 형태를 제조하여 이를 사료 효소를 면역학적으로 또한 인식할 수 있고 검출 기구와 접합시킨 목적하는 제2 항체에 결합시켜 다수의 세포 간 공간을 갖는 상당한 부피를 형성하는 단계;
    d) 단계 (a)의 추출물을 단계 (b)의 제조된 형태와 배합하여, 추출물을 제1 항체-사료 효소 복합체를 포획하는 제조된 고체 상 형태의 세포 간 공간을 통해 배수시키는 단계;
    e) 포획된 제1 항체-사료 효소 복합체의 존재로 사료 효소를 검출하는 단계를 포함하여 샘플 중 사료 효소를 검출하는 면역검정법.
  2. 제1항에 있어서, 사료 효소가 파이타제, 자일라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 글루코아밀라제 및/또는 프로테아제 단백질인 면역검정법.
  3. 제2항에 있어서, 파이타제가 열안정성 파이타제인 면역검정법.
  4. 제1항에 있어서, 고체상 형태가 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스, 니트로셀룰로스 또는 나일론인 면역검정법.
  5. 제4항에 있어서, 고체 상 형태가, 각각의 층이 상이한 사료 효소를 포획할 수 있는 다중 연속 적층으로 구성되는 면역검정법.
  6. 제4항에 있어서, 고체 상 형태의 샘플 흡수 패드를 추가로 포함하는 면역검정법.
  7. 제6항에 있어서, 라벨링된 항-사료 효소 항체를 포함하는 띠를 추가로 포함하는 면역검정법.
  8. 제1항에 있어서, 검출 기구가 콜로이드성 금인 면역검정법.
  9. a) 샘플로부터 사료 효소를 추출하는 기구; 및
    b) 사료 효소를 면역학적으로 또한 인식할 수 있고 검출 기구와 접합시킨 목적하는 제2 항체에 결합시켜 다수의 세포 간 공간을 갖는 상당한 부피를 형성하는, 제1 항-사료 효소 항체를 포함하고 3차원에서의 유의적 측정값을 갖는 고체 상 형태를 포함하는, 제1항에 따르는 면역검정법에 의한 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 완충액 함유 용기를 추가로 포함하는 키트.
  11. 제10항에 있어서, 샘플을 고체 상 형태에 분산시키는 기구를 추가로 포함하는 키트.
  12. a) 샘플의 추출물을 제조하는 단계;
    b) 추출물의 일부를 사료 효소에 결합하고 고체 담체에 결합된 제1 항-사료 효소 항체, 및 사료 효소에 결합하는 제2 항-사료 효소 항체와 함께 항온처리하여 항체-중합체-항체 복합체를 형성하는 단계;
    c) 항체-중합체-항체 복합체를 세척하여 결합되지 않은 제2 항체를 제거하는 단계;
    d) 제2 항체와 면역학적으로 반응하고 라벨링되어 있는 검출 항체를 첨가하는 단계; 및
    e) 결합되거나 결합되지 않은 라벨링된 항체의 양을 측정하여 유체 중 수분 처리 중합체의 농도를 산정하는 단계를 포함하는, 사료 효소를 검출 및 정량하는 면역검정법.
  13. 제12항에 있어서, 사료 효소가 파이타제, 자일라나제, 셀룰라제, 글루카나제, 아밀라제, 글루코아밀라제 및/또는 프로테아제 단백질인 면역검정법.
  14. 제13항에 있어서, 파이타제가 열안정성 파이타제인 면역검정법.
  15. 제12항에 있어서, 검출가능한 라벨이 효소인 면역검정법.
  16. 제15항에 있어서, 효소가 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제 또는 β-갈락토시다제인 면역검정법.
  17. 제16항에 있어서, 효소가 불용성 반응 생성물을 생산하는 면역검정법.
  18. a) 샘플로부터 사료 효소를 추출하는 기구;
    b) 고체 지지체에 결합한 제1 항-사료 효소 항체를 포함하는 고체 지지체;
    c) 제2 항-사료 효소 항체; 및
    d) 제2 항체에 면역학적으로 결합할 수 있고 검출 기구로 라벨링한 검출 항체를 포함하는, 제12항에 따르는 면역검정법에 의한 검출 및 정량용 키트.
  19. 제18항에 있어서, 검출 기구가 효소인 키트.
  20. 제19항에 있어서, 검출 효소가 알칼리성 포스파타제, 퍼옥시다제 또는 β-갈락토시다제인 키트.
  21. 제20항에 있어서, 효소가 가용성 또는 불용성 반응 생성물을 생산하는 키트.
  22. 제21항에 있어서, 효소에 대한 기질을 추가로 포함하는 키트.
  23. 파이타제를 면역학적으로 인식하는 항체.
  24. 제23항에 있어서, 폴리클로날 항체인 항체.
  25. 제23항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
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