CN102033064B - 一种检测饲料中植酸酶活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测饲料中植酸酶活性的方法，属于饲料的化学成分分析技术领域。该方法通过一种新的提取液、稀释液以及检测流程，将饲料中的植酸酶完全浸提出来，同时消除了饲料中本身存在的无机磷对测定的干扰，检测结果的变异系数小，具有检测周期短、灵敏度高、重复性和准确性好的优点。

Description

一种检测饲料中植酸酶活性的方法

技术领域

本发明涉及一种检测饲料中植酸酶活性的方法，属于饲料的化学成分分析技术领域。

背景技术

植酸酶为生物大分子蛋白类物质，纯品状态下，由于植酸酶可在一定温度和pH条件下，将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色的复合物，于波长415nm下进行比色测定。目前已形成国标GB/T 18634-2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》。然而，饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题：饲料中的植酸酶不同于纯品植酸酶，其中存在大量物质可在酸性条件下与钒钼酸铵发生显色反应，干扰415nm波长下的比色反应。因此，背景干扰除杂是测定饲料中植酸酶活性的关键。GB/T 18634-2009中并未建立背景干扰除杂的步骤；同时，中国专利CN101493418A(添加在饲料中植酸酶的微量测定方法，公开日2009年07月29日)中虽选用透析的方式进行背景干扰除杂，但并未指出透析袋的截留分子量，并且该文献公开的检测方法涉及透析处理，检测步骤多，周期长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测饲料中植酸酶活性的方法，该方法可以将饲料中的植酸酶完全浸提出来，同时成功地解决了背景干扰除杂的问题，具有检测周期短、灵敏度高、相对误差小的优点。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量的试验摸索，最终获得了如下技术方案：

一种检测饲料中植酸酶活性的方法，包括如下步骤：

(1)绘制标准曲线：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用稀释液溶解并定容后形成磷标准溶液；将磷标准溶液用稀释液稀释成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L的溶液；各浓度溶液分别取2ml，37℃预热5min，加入6ml显色液，37℃保温30min，加入已预热至37℃的植酸钠溶液2ml，反应后在水浴中静置10min，4000r/min离心10min；取上清液，以空白为参比，在波长415nm处分别测定样品溶液的吸光值，绘制标准曲线；

(2)样品处理：将含有植酸酶的饲料粉碎，0.45mm过筛，取0.5g入150ml锥形瓶中，加入50ml提取液，在摇床上振荡30min，4000r/min离心10min；

(3)样品稀释液的制备：取步骤(1)所得的上清液0.5-1.0ml入50ml容量瓶中，用稀释液定容，摇匀；

(4)反应：取2ml样品稀释液，37℃预热5min，加入已预热至37℃的植酸钠溶液2ml，37℃保温30min，加入6ml显色液，反应后在水浴中静置10min，4000r/min离心10min；取上清液，以样品空白为参比，在波长415nm处测定样品溶液的吸光值；

(5)用直线回归方程计算磷的含量，根据磷含量按下式计算植酸酶活性：

$U/g=\frac{C}{m\×30}\×N$

其中：U-样品植酸酶活力，U/g；

C-样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应磷的浓度(mmol/L)；

N-样品溶液反应前的总稀释倍数；

m-样品质量(g)；

30-反应时间，min；

上述各步骤中：

所述的提取液的配置方法如下：称取46.06g一水草酸钾，9.8g醋酸钾，于1000ml容量瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50，加入0.25g牛血清白蛋白溶解，用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放1个月有效；

所述的稀释液的配置方法如下：称取8.2g无水乙酸钠，0.25g牛血清白蛋白于1000ml容量瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放1个月有效；

所述的植酸钠溶液的配置方法如下：称取0.9239g植酸钠、0.82g无水乙酸钠于100mL容量瓶中，加入90ml水溶解，用冰乙酸调pH值至5.50，并用蒸馏水定容。

所述显色液的配置方法如下：在搅拌下将钼酸铵溶液缓缓倒入钒酸铵溶液中，用水稀释至750ml；其中，钼酸铵溶液为20g四水钼酸铵溶入于200ml水中而成，钒酸铵溶液为0.75g钒酸铵溶于100ml水中，缓缓加入85ml硝酸溶液而成。

为了达到更有效去除背景干扰的效果，优选地，上述检测饲料中植酸酶活性的方法，其中步骤(2)所述饲料粉碎过筛后，对饲料进行50000道尔顿截留分子量的分子筛浸提预处理。

为了达到更有效去除背景干扰的效果，优选地，述上检测饲料中植酸酶活性的方法，其中所述的稀释液中含有氯化钙。

本发明检测饲料中植酸酶活性的方法，其中提取液和稀释液均用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，同时规定样品反应时，如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用冰乙酸调节pH至5.50±0.01。

现有技术测定方法测定结果的相对偏差比较大，变异系数大。由具体实施方式中的检测结果可知，本发明的检测方法消除了饲料中本身存在的无机磷对测定的干扰，变异系数小(小于0.2％)，有比较好的重复性和准确性。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

1试剂与溶液

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T 6682中规定的二级水。清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。

1.1提取液：称取46.06g一水草酸钾，9.8g醋酸钾，于1000ml容量瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，加入0.25g牛血清白蛋白溶解，用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放1个月有效。

1.2稀释液：称取8.2g无水乙酸钠，0.25g牛血清白蛋白于1000ml容量瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放1个月有效。

1.3植酸钠溶液[C(C6H6O24P6Na12)＝10.0mmol/L]：称取0.9239g植酸钠，0.82g无水乙酸钠于100mL容量瓶中，加入90ml水溶解，用冰乙酸调pH值至5.50±0.01，并用蒸馏水定容至刻度(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。

1.4钼酸铵溶液(100g/L)：称取20g钼酸铵[(NH4)6Mo7024·4H20]于200ml水中。

1.5钒酸铵溶液(7.5g/L)：称取0.75g钒酸铵(NH4VO3)于100ml水中，缓缓加入85ml硝酸溶液。

1.6颜色终止液：在搅拌下将钼酸铵溶液缓缓倒入钒酸铵溶液中，用水稀释至750ml，储于棕色瓶中。

1.7磷标准溶液：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用稀释液(1.2)溶解，并定容至100ml，浓度为50mmol/L。

2仪器设备

2.1恒温水浴锅

2.2可见分光光度计

2.3恒温摇床

2.4涡流式混合器

2.5酸度计：pH精确至0.01

2.6离心机：转速为4000r/min以上

3绘制标准曲线

将磷标准溶液(50mmol/L)用稀释液(1.2)稀释成0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L的溶液，按表1的操作步骤一起反应。以吸光值为横坐标，磷含量为纵坐标，绘制标准曲线。

4试样溶液的制备

4.1样品的采取与制备

除按GB/T14699.1的规定进行采样外，对于用喷涂方式添加植酸酶的颗粒配合饲料，应开包将颗粒及粉化的料混匀后，按四分法缩分至200g，并粉碎通过0.45mm标准筛，混匀后装入密封容器内备用。

4.2样品反应溶液的制备

称取0.5g预混料(5g配合饲料)入150ml锥形瓶中，加入50ml提取液(1.1)，在摇床上振荡30min。提取后的试样在离心机上以4000r/min离心10min，预混料样品取0.5-1.0ml上清液入50ml容量瓶中，用稀释液(1.2)定容，摇匀，取2ml样品稀释液待反应；配合饲料样品取10ml上清液入50ml容量瓶中，用稀释液(1.2)定容，摇匀，取2ml样品稀释液待反应。

如果稀释后酶液的pH偏离5.50，需要用冰乙酸调节pH至5.50±0.01。

5测定步骤

按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃保温30min.

反应步骤及试剂、溶液用量见表1。

表1

反应后的试样在水浴中静置10min，在离心机上以4000r/min离心10min，上清液以样品空白为参比，在分光光度计415nm波长处测定样品溶液的吸光值。用直线回归方程计算磷的含量，根据磷含量计算植酸酶活性。

6酶活力的计算

植酸酶活力按下式计算：

$U/g=\frac{C}{m\×30}\×N$

其中：U-样品植酸酶活力，U/g；

C-样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应磷的浓度(mmol/L)；

N-样品溶液反应前的总稀释倍数；

m-样品质量(g)；

30-反应时间，min。

酶活力的计算值保留三位有效数字。

7重复性

每个试样应取两份平行试样进行分析测定，相对误差不超过15％，二者的平均值为最终的酶活力测定值。

8检测结果

8.14％预混料中植酸酶的测定结果

8.2配合饲料中植酸酶的测定

现有技术测定方法测定结果的相对偏差比较大，变异系数大。由上述检测结果可知，本发明的检测方法消除了饲料中本身存在的无机磷对测定的干扰，变异系数小(小于0.2％)，有比较好的重复性和准确性。

Claims (3)

1.一种检测饲料中植酸酶活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)绘制标准曲线：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用稀释液溶解并定容后形成磷标准溶液；将磷标准溶液用稀释液稀释成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L的溶液；各浓度溶液分别取2ml，37℃预热5min，加入6ml显色液，37℃保温30min，加入已预热至37℃的植酸钠溶液2ml，反应后在水浴中静置10min，4000r/min离心10min；取上清液，以空白为参比，在波长415nm处分别测定样品溶液的吸光值，绘制标准曲线；

(2)样品处理：将含有植酸酶的饲料粉碎，0.45mm过筛，取0.5g入150ml锥形瓶中，加入50ml提取液，在摇床上振荡30min，4000r/min离心10min；

(3)样品稀释液的制备：取步骤(2)所得的上清液0.5-1.0ml入50ml容量瓶中，用稀释液定容，摇匀；

(4)反应：取2ml样品稀释液，37℃预热5min，加入已预热至37℃的植酸钠溶液2ml，37℃保温30min，加入6ml显色液，反应后在水浴中静置10min，4000r/min离心10min；取上清液，以样品空白为参比，在波长415nm处测定样品溶液的吸光值；

(5)用直线回归方程计算磷的含量，根据磷含量按下式计算植酸酶活性：

$U/g=\frac{C}{m\×30}\×N$

其中：U-样品植酸酶活力，U/g；

C-样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应磷的浓度，mmol/L；

N-样品溶液反应前的总稀释倍数；

m-样品质量，g；

30-反应时间，min；

上述各步骤中：

所述的提取液的配置方法如下：称取46.06g一水草酸钾，9.8g醋酸钾，于1000ml容量瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50，加入0.25g牛血清白蛋白溶解，用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放1个月有效；

所述的稀释液的配置方法如下：称取8.2g无水乙酸钠，0.25g牛血清白蛋白于1000ml容量瓶中，加入950ml水溶解，用冰乙酸调节pH值至5.50，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放1个月有效；

所述的植酸钠溶液的配置方法如下：称取0.9239g植酸钠、0.82g无水乙酸钠于100mL容量瓶中，加入90ml水溶解，用冰乙酸调pH值至5.50，并用蒸馏水定容；

所述显色液的配置方法如下：在搅拌下将钼酸铵溶液缓缓倒入钒酸铵溶液中，用水稀释至750ml；其中，钼酸铵溶液为20g四水钼酸铵溶入于200ml水中而成，钒酸铵溶液为0.75g钒酸铵溶于100ml水中，缓缓加入85ml硝酸溶液而成。

2.如权利要求1检测饲料中植酸酶活性的方法，其特征在于：步骤(2)所述饲料粉碎过筛后，对饲料进行50000道尔顿截留分子量的分子筛浸提预处理。

3.如权利要求1检测饲料中植酸酶活性的方法，其特征在于：所述的稀释液中含有氯化钙。