CN101881759A - 三聚氰胺快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种三聚氰胺快速检测试剂盒及其应用,该试剂盒内分别设有测试液体:样品处理液A:1%(w/v)的三氯乙酸溶液,试剂B:40%(w/v)氢氧化钠溶液,试剂C:含量为88%食品级的乳酸原液,显色剂D:碱性碘化汞钾试液。该试剂盒适用于配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中三聚氰胺的半定量测定。本发明解决了目前市场上检测三聚氰胺需要大型的精密仪器设备,熟练的专业人士操作,费时费力及不适合现场测定等难题。本发明能够半定量检测三聚氰胺,最低检出限为2mg/kg。总之,该试剂盒具有特异、灵敏、快速、准确、方便、廉价等特点;盒中主要试剂均以工作液的形式提供,检测效率高,操作简单,携带方便,经济与社会效益非常显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学成分检测试剂盒及其应用,特别涉及一种用于配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中的三聚氰胺快速检测试剂盒及其应用。
背景技术
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,简称三胺,又叫2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。三聚氰胺由于具有多个氨基,因此其pKb值为8.0。三聚氰胺常用于制造三聚氰胺树脂,是建筑业中常用的防火材料,本来与食品、饲料行业毫不相干,但是发生在美国的数起饲料致死宠物的事件和近期国内婴儿奶粉受三聚氰胺污染导致婴儿肾结石事件,使两者联系在一起。经过调查,发现这些进口饲料中含有一定浓度的三聚氰胺,对此,美国食品药品监督管理局(FDA)关注在使用添加三聚氰胺及其类似物饲料喂养的宠物的食用安全,要求饲料厂商提供三聚氰胺的检测报告,因此,三聚氰胺事件也使得分析领域掀起了检测方法的开发热潮。
2008年10月7日,国家标准委员会规定了高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱/质谱法三种方法为三聚氰胺的标准检测方法,但是这三种方法不但需要大型的精密仪器、熟练的操作人员,耗时也较长。传统的色谱检测方法检测三聚氰胺,其分析结果容易得到“假阳性”结果;而利用质谱方法进行三聚氰胺检测,则更容易出现“假阴性”结果。ELISA试剂盒是一种经典的免疫学测定方法,广泛应用于临床诊断、食品安全(如瘦肉精)、农药残留等方面的检测,作为一种准确的定量检测方法得到美国FDA认可。与色谱、质谱精确定量检测法相比,ELISA检测方法因其检出精度相对较低,只能用于疑似含有三聚氰胺的样品检测。
因此,基于当前形势的迫切需要,亟需提供一种方便、快捷且敏感度高的检测方法,即研制并开发一种快速检测配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中三聚氰胺残留的试剂盒及其应用,造福于人类,将是该技术领域科研人员急需深入研究开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处,提供一种应用效果显著的三聚氰胺快速检测试剂盒及其应用。
为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下:一种三聚氰胺快速检测试剂盒,其特征在于:
该试剂盒内分别设有测试液体:
样品处理液A:1%(w/v)的三氯乙酸溶液;
试剂B:40%(w/v)氢氧化钠溶液;
试剂C:含量为88%食品级的乳酸原液;
显色剂D:碱性碘化汞钾试液,
碱性碘化汞钾试液的配制:
(1)取氢氧化钠81g,用300ml无氨水溶解,溶解后冷却;
(2)取碘化钾36g,用100ml无氨水溶解;取氯化汞13.6g,将300ml无氨水加热后使其溶解,加热温度为50~80℃;氯化汞溶解后,在不断搅拌下缓缓加到碘化钾溶液中,用无氨水定容至500ml;
(3)将冷却后的氢氧化钠溶液缓缓倒入步骤(2)配制的碘化汞钾溶液中,避光、静置≥12h,取上清液备用。
根据权利要求1所述的三聚氰胺快速检测试剂盒的应用,其特征在于:该试剂盒在温度为25±5℃条件下,用于配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中三聚氰胺的半定量测定;
应用所述三聚氰胺快速检测试剂盒进行检测,具体操作步骤如下:
(1)进行饲料原料中三聚氰胺的检测步骤:称取5g粉末状或细颗粒状样品,准确加入50ml样品处理液A,充分振荡摇匀,依次静置2~3min、滤纸过滤,或用离心机10000rpm、10min,取滤液或上清液20ml;然后滴加试剂B2~3滴,混匀,依次静置2~3min、滤纸过滤、取滤液1ml;再加处理液A9ml,混匀,取混匀后的液体5ml,滴加显色剂D3滴,静置,在3~5min之内,观察结果;
或进行肉食品中三聚氰胺的检测步骤:称取5g肉食品,剪碎,放于研钵中,加入50ml样品处理液A,依次充分研磨、纱布过滤、取滤液20ml;然后滴加试剂B2~3滴,混匀,依次静置2~3min、10000rpm离心10min、取离心后的全部上清液;滴加试剂C5~6滴,混匀,依次静置2~3min、10000rpm离心10min、取上清液1ml;再加处理液A9ml,依次混匀、取混匀后的液体5ml,滴加显色剂D3滴,静置,在3~5min之内,观察结果;
(2)待测样品经过上述处理后,采用目视比浊测定法进行结果判定:
阳性:低浓度时,三聚氰胺浓度为2~10ppm,在靠近瓶底部出现一层类白色沉淀带;随着浓度的升高,三聚氰胺浓度为>10ppm,出现白色或黄色絮状沉淀;阴性:不出现沉淀反应;采用该目视比浊测定法,最低检出浓度为2ug/ml。
本发明试剂盒的检测原理:
三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体,无味,密度1.573g/cm3(16℃)。常压熔点354℃(分解);快速加热升华,升华温度300℃。溶于热水,水溶性3G/L(20℃),微溶于冷水,极微溶于热乙醇,不溶于醚、苯和四氯化碳,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。低毒。三聚氰胺分子模型呈弱碱性(pKb=8),与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。
在中性或微碱性情况下,与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺,但在微酸性中(pH值5.5~6.5)与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解,胺基逐步被羟基取代,先生成三聚氰酸二酰胺,进一步水解生成三聚氰酸一酰胺,最后生成三聚氰酸。三聚氰胺水解生成的产物能够与碱性碘化汞钾试剂生成沉淀或发生颜色反应,利用这一特点可作为三聚氰胺的鉴定及半定量检测。
本发明的有益效果是:本发明具有特异、灵敏、准确、快速、方便、价廉等特点,而且适用范围较广,主要适用于配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中三聚氰胺的半定量测定。本发明所提供的三聚氰胺快速试剂盒主要是应用比浊测法半定量检测样品中三聚氰胺,最低检出浓度为2ug/ml。
本发明所提供的三聚氰胺快速检测试剂盒的优点在于:样品前处理过程操作简便,无需培养专业技术人员,易于实施,能够对样品进行快速检测;完成全部检测操作过程只需30~60min,而且检测结果的精密度较高,非常适合大中小型养殖场的需求。
本发明所提供的三聚氰胺快速检测试剂盒中的主要试剂均以工作液形式提供,使用方便,并且试剂易于保存。显色剂与三聚氰胺分解产物发生反应,生成类白色或黄色沉淀,通过目视比浊法就可以观察样品中是否含有三聚氰胺。该试剂盒可供10次检测使用,有效降低检测成本。因此,本发明有效解决了目前市场上检测三聚氰胺需要大型的精密仪器设备,熟练的专业人士操作,费时费力及不适合现场测定等难题。该试剂盒在饲料、饲料原料及肉食品中三聚氰胺含量检测中具有广阔的应用前景,并且具有巨大的经济效益和社会效益。
具体实施方式
以下结合较佳实施例,对依据本发明提供的具体实施方式详述如下:
实施例1
三聚氰胺快速检测试剂盒的组成部分如下:
样品处理液A:1%(w/v)的三氯乙酸溶液;6瓶,100ml/瓶。
试剂B:40%(w/v)氢氧化钠溶液;1瓶,10ml/瓶。
试剂C:含量为88%食品级的乳酸原液(市售);1瓶,10ml/瓶。
显色剂D:碱性碘化汞钾试液,1瓶,5ml/瓶。
碱性碘化汞钾试液的配制:
(1)取氢氧化钠81g,用300ml无氨水溶解,溶解后冷却;
(2)取碘化钾36g,用100ml无氨水溶解;取氯化汞13.6g,将300ml无氨水加热后使其溶解,加热温度为50~80℃;氯化汞溶解后,在不断搅拌下缓缓加到碘化钾溶液中,用无氨水定容至500ml;
(3)将冷却后的氢氧化钠溶液缓缓倒入步骤(2)配制的碘化汞钾溶液中,避光、静置时间≥12h,取上清液备用。
该试剂盒在温度为25±5℃条件下(三聚氰胺溶解性较好)用于配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中三聚氰胺的半定量测定。
应用所述三聚氰胺快速检测试剂盒对饲料及蛋白性饲料原料中三聚氰胺的检测具体操作步骤如下:
称取5g饲料原料,例如鱼粉(或豆柏、酒糟、棉柏、玉米粉),放于50ml具塞的比色管中,加入处理液A50ml,充分振荡、摇匀,静置2~3min;滤纸过滤,取滤液20ml,滴加试剂B2~3滴,混匀,静置2~3min;滤纸过滤;取滤液1ml,加处理液A 9ml,混匀;取混匀后的液体5ml,滴加显色剂D3滴,静置,滴加显色剂后3~5min之内观察结果。
阳性:低浓度时(三聚氰胺浓度为2~10ppm),在靠近瓶底部出现一层类白色沉淀带;随着浓度的升高(三聚氰胺浓度为>10ppm),出现白色或黄色絮状沉淀;阴性:不出现沉淀反应。
如检测颗粒饲料时,应先将其研磨粉碎后,再按照试验步骤操作;具有离心机时,滤纸过滤步骤可用离心机取代(10000rpm,10min)。
本发明的一个优选实施方案中,试剂盒中所提供的显色剂为纳氏试剂。在碱性条件下,三聚氰胺的分解产物能够与显色剂反应,生成类白色或黄色沉淀,通过目视比浊法就可以观察样品中是否含有三聚氰胺。而且还发现在进行对三聚氰胺提取时,随温度升高,其在溶剂中溶解度呈现增大趋势。因此,一定要注意提取温度(25±5℃)及样品中三聚氰胺含量。本发明所提供的试剂盒能够对样品中三聚氰胺进行半定量检测即在显色反应中,如果发现靠近瓶底部出现一层类白色沉淀带时,说明样品中三聚氰胺含量在2~10ppm范围;随着浓度的升高(三聚氰胺浓度为>10ppm),出现白色或黄色絮状沉淀,并且沉淀物的量随着三聚氰胺含量的增高,沉淀越加明显。本方法还可以用浊度仪对样品中三聚氰胺含量进行定量检测。
实施例2
配制三聚氰胺快速检测试剂盒中的测试液体同实施例1。
应用所述三聚氰胺快速检测试剂盒肉食品中三聚氰胺的检测具体操作步骤如下:
称取5g猪肉,剪碎,放于研钵中,加入50ml处理液A,充分研磨;纱布过滤;取滤液20ml,滴加试剂B2~3滴,混匀,静置2~3min;离心10000rpm,10min;取离心后的全部上清液,滴加试剂C5~6滴,混匀,静置2~3min;离心10000rpm,10min;取上清液1ml,加处理液A9ml,混匀;取混匀后的液体5ml,滴加显色剂D3滴,静置,滴加显色剂后3~5min之内观察结果。
阳性:低浓度时(三聚氰胺浓度为2~10ppm),在靠近瓶底部出现一层类白色沉淀带;随着浓度的升高(三聚氰胺浓度为>10ppm),出现白色或黄色絮状沉淀;阴性:不出现沉淀反应。
其它同实施例1。
应用试验分析实例1:
三聚氰胺快速检测试剂盒精密度试验:
本实验例为精密度试验,具体操作为:
将配制好的三聚氰胺快速检测试剂盒对供试品分别进行重复性、中间精密度、重现性试验。重复性试验:在规定范围内,设计3个不同浓度,每个浓度做3个平行,每个浓度的3个平行都测3次,用所得测定结果进行评价;中间精密度试验:在本实验室内,由3个不同的分析人员用不同设备配制上述3个不同浓度的溶液,每个浓度做3个平行,每个浓度的3个平行都测3次,用所得测定结果进行评价;并且用所得到的测定结果与重复性试验得到的测定结果进行评价;重现性试验:在2个不同的试验室内由不同的分析人员对上述3个不同浓度的溶液进行测定。将重复性试验、中间精密度试验、重现性试验所得到试验结果进行评定,试验结果一致,表明本发明所提供的三聚氰胺快速检测试剂盒精密度达到了要求。
应用试验分析实例2:
三聚氰胺快速检测试剂盒回收率试验:
在规定范围内,设计3个不同浓度,精密称取三聚氰胺标样,对样品进行添加回收试验,每个浓度做3个平行,分别计算回收率。结果表明饲料中的添加回收率为100%。
应用试验分析实例3:
三聚氰胺快速检测试剂盒保存期试验:
长期试验:将三批配制好的试剂盒放于25℃阴凉干燥处保存,分别于0、3、6、9、12个月时对同一批送检样品进行测定,结果测定表明三聚氰胺添加实际测定值均在正常范围之内。
加速试验:将三批配制好的试剂盒放于40℃恒温箱内放置2周,进行加速老化试验,然后对同一批送检样品进行测定,结果表明待测样中三聚氰胺添加实际测定值均在正常范围之内;将三批配制好的试剂盒放于-20℃冰箱冷冻1周,然后对同一批送检样品进行测定,结果表明待测样中三聚氰胺添加实际测定值均在正常范围之内。
本发明所提供的三聚氰胺快速检测试剂盒检测限的确定试验,通过直观法确定三聚氰胺快速检测试剂盒最低检出浓度为2ug/ml;通过具体实施例(半定量检测豆柏;棉柏;酒糟;鱼粉;玉米粉中三聚氰胺含量)来说明本发明所提供的三聚氰胺快速检测试剂盒的检测及观察方法。
本发明所提供的三聚氰胺快速检测试剂盒检测限的确定试验,通过精密称取100mg三聚氰胺标准品(准确至0.1mg)于100mL容量瓶中,加少量1%三氯乙酸溶液完全溶解后,然后用1%三氯乙酸溶液定容至刻度,混匀,制成100μg/mL的标准贮备液,4℃条件下避光保存,有效期为1个月。
在使用时配制成不同浓度的三聚氰胺标准工作液,分别为0ug/ml;2ug/ml;4ug/ml;6ug/ml;8ug/ml;10ug/ml。在配制好上述三聚氰胺溶液后,准备6个清洁的西林瓶摆成一排,分别取溶液5ml于相应的西林瓶内,同时在每一西林瓶内滴加显色剂D3滴,在3~5min内观察试验结果。
三聚氰胺快速检测试剂盒灵敏、快速、准确,主要用于配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中三聚氰胺残留的筛查;盒中的主要试剂均以工作液的形式提供,使用方便,具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点。
上述参照实施例对该三聚氰胺快速检测试剂盒及其应用进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种三聚氰胺快速检测试剂盒,其特征在于:
该试剂盒内分别设有测试液体:
样品处理液A:1%(w/v)的三氯乙酸溶液;
试剂B:40%(w/v)氢氧化钠溶液;
试剂C:含量为88%食品级的乳酸原液;
显色剂D:碱性碘化汞钾试液,
碱性碘化汞钾试液的配制:
(1)取氢氧化钠81g,用300ml无氨水溶解,溶解后冷却;
(2)取碘化钾36g,用100ml无氨水溶解;取氯化汞13.6g,将300ml无氨水加热后使其溶解,加热温度为50~80℃;氯化汞溶解后,在不断搅拌下缓缓加到碘化钾溶液中,用无氨水定容至500ml;
(3)将冷却后的氢氧化钠溶液缓缓倒入步骤(2)配制的碘化汞钾溶液中,避光、静置≥12h,取上清液备用。
2.根据权利要求1所述的三聚氰胺快速检测试剂盒的应用,其特征在于:该试剂盒在温度为25±5℃条件下,用于配合饲料、动物性蛋白质饲料、植物性蛋白质饲料及肉食品中三聚氰胺的半定量测定;
应用所述三聚氰胺快速检测试剂盒进行检测,具体操作步骤如下:
(1)进行饲料原料中三聚氰胺的检测步骤:称取5g粉末状或细颗粒状样品,准确加入50ml样品处理液A,充分振荡摇匀,依次静置2~3min、滤纸过滤,或用离心机10000rpm、10min,取滤液或上清液20ml;然后滴加试剂B2~3滴,混匀,依次静置2~3min、滤纸过滤、取滤液1ml;再加处理液A9ml,混匀,取混匀后的液体5ml,滴加显色剂D3滴,静置,在3~5min之内,观察结果;
或进行肉食品中三聚氰胺的检测步骤:称取5g肉食品,剪碎,放于研钵中,加入50ml样品处理液A,依次充分研磨、纱布过滤、取滤液20ml;然后滴加试剂B2~3滴,混匀,依次静置2~3min、10000rpm离心10min、取离心后的全部上清液;滴加试剂C5~6滴,混匀,依次静置2~3min、10000rpm离心10min、取上清液1ml;再加处理液A9ml,依次混匀、取混匀后的液体5ml,滴加显色剂D3滴,静置,在3~5min之内,观察结果;
(2)待测样品经过上述处理后,采用目视比浊测定法进行结果判定:
阳性:低浓度时,三聚氰胺浓度为2~10ppm,在靠近瓶底部出现一层类白色沉淀带;随着浓度的升高,三聚氰胺浓度为>10ppm,出现白色或黄色絮状沉淀;阴性:不出现沉淀反应;采用该目视比浊测定法,最低检出浓度为2ug/ml。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101110 |