CN104007110A - 一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测饲料中微量植酸酶活性的方法。本方法在现有方法的基础上，通过增加称样量和反应体系中的酶液量，能显著提高饲料中植酸酶的检测灵敏度，使线性检测限降低到0.1U/g。当饲料中植酸酶酶活为0.18U/g时，利用本发明所述方法检测的酶活回收率高达98.92％，变异系数仅为0.5％(n＝6)，两次实验的误差小，从而说明本发明提供的方法其准确性和精确度均超过国标GB/T18634-2009《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》的要求，取得意料不到的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及酶制剂检测技术领域，具体涉及一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法。
背景技术
植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。
由于植酸酶可将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色的复合物，因此，在波长415nm下进行比色，可测定植酸酶活性。目前已形成国标GB/T18634—2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》。
但是，饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题：①由于植酸酶在饲料中的添加量较低，现有方法不能将饲料中的植酸酶完全浸提出来；②饲料中存在大量物质可在酸性条件下与钒钼酸铵发生显色反应，干扰415nm波长下的比色反应，从而影响酶活测定。
国标GB/T18634—2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》用于测定植酸酶样品，相对较为准确，但是，用于测定添加在饲料中的植酸酶，该方法的检测下限为2.0U/g饲料，而实际饲料中的植酸酶酶活约为0.5U/g饲料，远远低于该方法的检测下限。另外，饲料中无机磷含量远高于反应生成的无机磷量，影响植酸酶与底物的反应。样品空白吸光值超出测定范围。因此，目前急需开发一种准确检测饲料中微量植酸酶含量的方法。
发明内容
本发明为解决现有技术问题提供了一种能够检测饲料中微量植酸酶活性的方法，具体是通过增加称样量和反应体系中的酶液量，有效提高检测的灵敏度。
本发明所采用的技术方案是：本发明所述测定饲料中微量植酸酶活性的方法，其步骤如下：
(1)试剂和溶液的配制
本方法中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
(1.1)0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ):称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa·3H2O)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。
(1.2)0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅱ)：称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa·3H2O)，0.5g TrionX－100,0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。
(1.3)7.5mmol/L植酸钠溶液：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ)溶解并定容至刻度，用盐酸调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。
(1.4)硝酸溶液：1体积硝酸与2体积水混合均匀。
(1.5)100g/L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
(1.6)2.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。
(1.7)颜色终止液：移取2份硝酸溶液(1.4)，1份钼酸铵溶液(1.5)，1份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。
(1.8)植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)
(1.9)已知酶活的液体植酸酶
(2)测定
(2.1)标准曲线
称取不含植酸酶的空白饲料试样7份，每份10克，精确至0.0002克，分别加入150ml三角瓶中，加入一个磁力棒，加入一定体积已知酶活的液体植酸酶(1.9)，使每个三角瓶中植酸酶酶活分别约为0u、0.5u、1u、2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸缓冲液(1.1)，使加入液体总体积为50ml，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上清液过0.45u m滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001mg)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定容至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(1.3)开始，向每只试管中加入的时间间隔要绝对一致，37℃水浴30min。
反应步骤及试剂、溶液用量见表1。
表1反应步骤及试剂、溶液用量
| 反应顺序 | 样品、标准品 | 样品空白(标准空白) |
| 1.加乙酸缓冲液(1.1) | 1.2ml | 1.2ml(2.0ml) |
| 2.加待反应液 | 0.8ml | 0.8ml |
| 3.混合 | ∨ | ∨ |
| 4.37℃预热5min | ∨ | ∨ |
| 5.依次加入底物(1.3) | 4ml | 4ml(第二步) |
| 6.混合 | ∨ | ∨ |
| 7.37℃水解30min | ∨ | ∨ |
| 8.依次加入终止液(1.7) | 4ml | 4ml(第一步) |
| 9.混合 | ∨ | ∨ |
| 总体积 | 10ml | 10ml |
混合后的试样在37℃下显色10min，如出现混浊需在离心机上以7000xg离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，A-A0为实测吸光值。
以实测吸光值为横坐标、酶活为纵坐标，列出直线回归方程(y＝ax+b)。
(2.2)试样溶液的制备
取试样35克，粉碎至全部过20标准筛，装入密闭容器4℃保存。
称取试样两份，每份10克，精确至0.0002g，置于150ml三角瓶中，加入50mL乙酸缓冲液(1.1)，一个磁力棒，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上清液过0.45u m滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001g)的超滤管，7000xg离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定溶至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
(2.3)反应
操作同回归曲线相应部分。
当样品中植酸酶活性低于0.2U/g，反应液加量改为1.6ml，乙酸缓冲液(1.1)加量为0.4ml。如样品中植酸酶活性高于于0.8U/g，反应液加量改为0.4ml，乙酸缓冲液(1.1)加量为1.6ml。
(2.4)样品测定
同标准曲线相应部分。得到实测吸光值后，用直线回归方程计算植酸酶的活性。
(2.5)结果计算和表示
(2.5.1)植酸酶活性计算
U＝C/m
U—试样中植酸酶的活性，U/g
C—根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U。
m—试样质量，g。
(2.5.2)结果表示
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示。
(2.5.3)重复性
同一样品两个平行测定值的相对偏差不大于10％。
本发明的有益效果是：
1)本发明所述检测方法通过利用微滤膜除去提取液中的酯类、使用超滤柱除去水溶性磷，在0～1.5U/g的植酸酶酶活范围内，使变异系数(CV)降低至0.5～6％(n＝6)，添加的植酸酶活性与测定的植酸酶活性呈线形关系(r2＝0.99,P<0.01)。
2)所述方法通过增加称样量和反应体系中的酶液量(当检测样品中植酸酶活性低于0.2U/g，反应液加量增至1.6ml，乙酸缓冲液(1.1)加量为0.4ml；当检测样品中植酸酶活性高于0.8U/g，反应液加量减至0.4ml，乙酸缓冲液(1.1)加量为1.6ml)，显著提高了检测灵敏度，线性检测下限达到0.1U/g，远远低于国标方法和现有公开的检测方法，取得了意料不到的技术效果。
3)当检测饲料样品中植酸酶的酶活为0.42718U/g时，酶活回收率高达98.74％，CV＝0.5％(n＝6)。当饲料样品中植酸酶的酶活低至0.18U/g时，酶活回收率高达98.92％，CV＝0.5％(n＝6)。可见，本发明所述方法适合应用于饲料中微量植酸酶的检测，能取得显著的技术效果。
具体实施方式
本发明实施例中所用仪器设备如下：
实验室常用仪器设备。
恒温水浴：(37±0.1)℃。
分光光度计：有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。
磁力搅拌器。
涡流式混合器。
酸度计：精确至小数点后2位。
离心机：角转子7000×g以上。
0.45um滤膜
超滤管(Amicon Ultra-4,30K，Millipore Corp.)
实施例1
1、试剂和溶液
本方法中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。
(1.1)0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ):称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa·3H2O)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。
(1.2)0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅱ)：称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa·3H2O)，0.5g Trion X－100,0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。
(1.3)7.5mmol/L植酸钠溶液：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ)溶解并定容至刻度，用盐酸调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。
(1.4)硝酸溶液：1体积硝酸与2体积水混合均匀。
(1.5)100g/L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
(1.6)2.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。
(1.7)颜色终止液：移取2份硝酸溶液(1.4)，1份钼酸铵溶液(1.5)，1份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。
(1.8)植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)。
(1.9)已知酶活的液体植酸酶。
2酶活测定
2.1标准曲线
称取不含植酸酶的空白饲料试样7份，每份10克，精确至0.0002克，分别加入150ml三角瓶中，加入一个磁力棒，加入一定体积已知酶活的液体植酸酶(1.9)，使每个三角瓶中植酸酶酶活分别约为2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸缓冲液(1.1)，使加入液体总体积为50ml，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上清液过0.45u m滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001mg)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定容至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(1.3)开始，向每只试管中加入的时间间隔要绝对一致，37℃水浴30min。
反应步骤及试剂、溶液用量见表1。
表1反应步骤及试剂、溶液用量
| 反应顺序 | 样品、标准品 | 样品空白(标准空白) |
| 1.加乙酸缓冲液(1.1) | 1.2ml | 1.2ml(2.0ml) |
| 2.加待反应液 | 0.8ml | 0.8ml |
| 3.混合 | ∨ | ∨ |
| 4.37℃预热5min | ∨ | ∨ |
| 5.依次加入底物(1.3) | 4ml | 4ml(第二步) |
| 6.混合 | ∨ | ∨ |
| 7.37℃水解30min | ∨ | ∨ |
| 8.依次加入终止液(1.7) | 4ml | 4ml(第一步) |
| 9.混合 | ∨ | ∨ |
| 总体积 | 10ml | 10ml |
混合后的试样在37℃下显色10min，如出现混浊，需在离心机上以7000×g离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，A-A0为实测吸光值，具体结果如表2所示：
表2已知酶活与实测吸光值的关系
| 序号 | 酶活(U/g) | 实测吸光值 |
| 1 | 0 | 0 |
| 2 | 0.1 | 0.11021 |
| 3 | 0.2 | 0.21842 |
| 4 | 0.4 | 0.43484 |
| 5 | 0.6 | 0.65126 |
| 6 | 0.8 | 0.86768 |
| 7 | 1.0 | 1.0841 |
以表2中所述实测吸光值为横坐标(x)、酶活为纵坐标(y)，制作标准曲线，该曲线的直线回归方程为：y＝1.0821x+0.002。
2.2试样酶活测定
称取不含植酸酶的空白饲料试样100克，添加植酸酶至0.42718U/g，充分混合均匀，然后粉碎至全部过20目标准筛，装入密闭容器4℃保存。
称取试样6份(1#，2#，3#，4#，5#，6#)，每份10g，精确至0.0002g，置于150ml三角瓶中，加入50mL乙酸缓冲液(1.1)，一个磁力棒，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上清液过0.45u m滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001g)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定容至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
反应步骤及试剂、溶液用量同2.1标准曲线相应部分，混合后的试样在37℃下显色10min，如出现混浊，需在离心机上以7000×g离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，OD为实测吸光值；每个试样设置3个平行样品，计算实测吸光值的平均数，再根据直线回归方程y＝1.0821x+0.002计算试样中的植酸酶活性。再进一步计算植酸酶回收率。
植酸酶活性计算
U＝C/m
U—试样中植酸酶的活性，U/g
C—根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U。
m—试样质量，g。
回收率＝(检测酶活/实际添加酶活)×100％。
结果如表3所示：
表3试样中植酸酶的检测酶活及回收率试验结果
上述实验是通过在饲料中添加已知酶的方法来验证本发明所述测定方法的可行性与准确性，从表3的结果可以得出结论，利用本发明所述方法检测饲料中的植酸酶酶活回收率高于97％，变异系数小CV＝0.5％(n＝6)，两次实验之间的误差小(<5％)。本发明所述检测方法具有良好的准确性及精确度。
实施例2微量植酸酶(低于0.2U/g)的检测方法
称取不含植酸酶的空白饲料试样120克，添加植酸酶至0.18U/g，充分混合至均匀，然后粉碎至全部过20目标准筛，装入密闭容器4℃保存。
称取样品10份，每份10克；试样分为两组，第一组的5份试样按照实施例1中2.1所述操作步骤及试剂、溶液用量(表1)进行检测，并根据2.1中得到的回归方程计算试样中植酸酶的酶活；第二组的5份试样依据表4中所述操作步骤及试剂、溶液用量进行检测，同时按照实施例1中2.1所述方，参照表4中所述反应步骤及试剂、溶液用量，重新做标准曲线，得到新的直线回归方程y＝0.9506x+0.0016。根据该方程计算第二组试样中植酸酶的酶活，具体结果见表5：
表4反应步骤及试剂、溶液用量
| 反应顺序 | 样品、标准品 | 样品空白(标准空白) |
| 1.加乙酸缓冲液(1.1) | 0.4ml | 0.4ml(2.0ml) |
| 2.加待反应液 | 1.6ml | 1.6ml |
| 3.混合 | ∨ | ∨ |
| 4.37℃预热5min | ∨ | ∨ |
| 5.依次加入底物(1.3) | 4ml | 4ml(第二步) |
| 6.混合 | ∨ | ∨ |
| 7.37℃水解30min | ∨ | ∨ |
| 8.依次加入终止液(1.7) | 4ml | 4ml(第一步) |
| 9.混合 | ∨ | ∨ |
| 总体积 | 10ml | 10ml |
表5第一组和第二组试样中植酸酶酶活检测结果
从表5的检测结果可以看出，当饲料中植酸酶的含量低于0.2U/g时，如果还是采用表1中所述试剂和溶液用量，检测出酶活的回收率仅为91.63％；而通过增加反应液的添加量(1.6mL)和降低乙酸缓冲液的添加量(0.4mL)，检测出植酸酶的酶活回收率为98.92％，变异系数CV＝0.5％(n＝6)，检测结果更接近实际添加酶活，更准确。上述结果表明通过增加反应液的添加量能有效进行背景干扰除杂，并且降低了酶活检测下限(0.1U/g)，提高了检测准确度，取得了意料不到的技术效果。
实施例3市售饲料样品中植酸酶的酶活检测
取市售山东六和集团的肉鸡饲料试样80克，粉碎至全部过20目标准筛，装入密闭容器，4℃保存。
称取试样6份(1#，2#，3#，4#，5#，6#)，每份10克，精确至0.0002g，分别置于150ml三角瓶中，加入50mL乙酸缓冲液(1.1)，一个磁力棒，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上清液过0.45u m滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001g)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定容至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
反应步骤及试剂、溶液用量同2.1标准曲线相应部分，混合后的试样在37℃下显色10min，如出现混浊，需在离心机上以7000×g离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，OD为实测吸光值；每个试样设置3个平行样品，计算实测吸光值的平均数，再根据直线回归方程y＝1.0821x+0.002计算试样中的植酸酶活性。
具体结果如表6所示：
表6各饲料试样中植酸酶酶活的检测结果
| 样品号 | OD1 | OD2 | OD3 | OD平均 | 酶(U/g) |
| 1# | 0.466 | 0.465 | 0.461 | 0.464 | 0.504 |
| 2# | 0.463 | 0.475 | 0.469 | 0.469 | 0.5095 |
| 3# | 0.465 | 0.465 | 0.468 | 0.466 | 0.5063 |
| 4# | 0.463 | 0.461 | 0.463 | 0.4623 | 0.5023 |
| 5# | 0.466 | 0.463 | 0.465 | 0.4645 | 0.5046 |
| 6# | 0.466 | 0.471 | 0.470 | 0.469 | 0.5095 |
从表6的检测结果可以看出，利用本发明所述方法检测市售6组饲料样品中植酸酶的活性，其变异系数仅为0.6％(n＝6)，实验误差较小，从而保证了检测结果的准确性及精确度。也说明本发明所述方法能广泛应用于市售饲料中植酸酶的酶活检测。
Claims (1)
1.一种微量植酸酶活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)试剂
本方法中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。消洗实验用容器不要用含磷消洗剂。
(1.1)0.25mol/L乙酸缓冲液(I)：称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa.3H2O)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。
(1.2)0.25mol/L乙酸缓冲液(II)：称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa.3H2O)，0.5gTrionx-100，0.5g牛血消白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。
(1.3)7.5mmol/L植酸钠溶液：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(I)溶解并定容至刻度，用盐酸调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。
(1.4)硝酸溶液：1体积硝酸与2体积水混合均匀。
(1.5)100g/L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水溶解定容至刻度。
(1.6)2.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。
(1.7)颜色终止液：移取2份硝酸溶液(1.4)，1份钼酸铵溶液(1.5)，1份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。
(1.8)植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)
(1.9)已知酶活的液体植酸酶
(2)测定
(2.1)标准曲线
称取不含植酸酶的空白饲料试样7份，每份10克，精确至0.0002克，分别加入150ml三角瓶中，加入一个磁力棒，加入一定体积已知酶活的液体植酸酶(1.9)，使每个三角瓶中植酸酶酶活分别约为0u、0.5u、1u、2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸缓冲液(1.1)，使加入液体总体积为50ml，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上消液过0.45um滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001mg)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2），通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定溶至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(1.3)开始，向每只试管中加入的时间间隔要绝对一致，37℃水浴30min。
反应步骤及试剂、溶液用量见下表。
混合后的试样在37℃下显色10min，如出现混浊需在离心机上以7000×g离心10min，上消液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，A-A0为实测吸光值。
以实测吸光值为横坐标、酶活为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax+b)。
(2.2)试样溶液的制备
取试样，粉碎至全部过20标准筛，装入密闭容器4℃保存。
称取试样两份，每份10克，精确至0.0002g，置于150ml三角瓶中，加入50mL乙酸缓冲液(1.1)，一个磁力棒，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上消液过0.45um滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001g)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定容至4ml，混合均匀，制成待反应样液。
(2.3)反应
操作同回归曲线相应部分。
当样品中植酸酶活性低于0.2U/g，反应液加量改为1.6ml，乙酸缓冲液(11)加量为0.4ml。当样品中植酸酶活性高于于0.8U/g，反应液加量改为0.4ml，乙酸缓冲液(1.1)加量为1.6ml。
(2.4)样品测定
同标准曲线相应部分。得到实测吸光值后，用直线回归方程计算植酸酶的活性。
(2.5)结果计算和表示
(2.5.1)植酸酶活性计算
U＝C/m
u-试样中植酸酶的活性，u/g
C-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U。
m-试样质量，g。
(2.5.2)结果表示
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示。
(2.5.3)重复性
同一样品两个平行测定值的相对偏差不大于10％。
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