CN104422738B - 一种分离分析米力农的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，其中所述高效液相色谱以甲醇‑磷酸盐溶液作为流动相，所述磷酸盐溶液包含二乙胺或三乙胺，并且所述磷酸盐溶液的pH为5.5‑6.5。本发明的方法能够有效地将米力农与合成中间体1‑(4‑吡啶基)丙酮以及其它有关物质分离，并且使得色谱峰的理论塔板数高，基线平稳，能够检测到较多的杂质数目，从而大大提高了对米力农及其有关物质检测的灵敏度和准确度。本发明的方法为米力农及其有关制剂的质量控制奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离分析米力农的方法。
背景技术
米力农的分子式为C12H9N3O，分子量为211.22，化学名为1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-[3，4’-二吡啶]-5-甲腈，其化学结构式如下：
米力农及米力农注射液是抗心力衰竭的药物，属于新型正性肌力药物中的磷酸二脂酶抑制剂，该药用于治疗各种原因引起的急、慢性顽固性充血性心力衰竭，而该病症用洋地黄、利尿剂、血管扩张剂治疗则无效或效果欠佳。米力农及其注射液在国内已生产上市，并有进口制剂。国内生产上市的药物为山东鲁南贝特制药有限公司生产的米力农注射液，进口药物为进口自原研企业法国赛诺菲制药的商品名为伊克维的乳酸米力农注射液。
在米力农中，通常不可避免地含有在制备过程中产生的中间体（例如1-(4-吡啶基)丙酮）、副产物（例如米力农有关物质A）以及其它杂质。这些物质存在于药物中会对药物的效果产生不利影响。因此，在制备米力农药物制剂时，需要对米力农进行分离分析，从而进行质量控制。
目前，分离分析米力农及其有关物质（包括工艺杂质，例如合成起始物料、中间体、副产物等；以及存放过程中产生的降解产物等）通常参照米力农美国药典标准（USP32-NF27）、米力农国家标准（WS1-(X-1090-2006Z)）及乳酸米力农进口复核标准中所记载的高效液相色谱（HPLC）法进行。
米力农美国药典标准（USP32-NF27）和米力农国家标准（WS1-(X-1090-2006Z)）中记载的流动相条件相同，都是采用乙腈-磷酸氢二钾溶液（磷酸氢二钾溶液的制备方法是：取磷酸氢二钾2.7g，加水800ml溶解后，加三乙胺2.4ml，用磷酸调pH值至7.5）作为流动相，其中乙腈与磷酸氢二钾溶液的体积比为20:80，检测波长为220nm。然而，用这两个标准中的方法进行米力农检测时，合成中间体1-(4-吡啶基)丙酮和米力农并不能有效分离。
此外，在米力农美国药典标准中，制备HPLC检测样品的方法为：将米力农与流动相混合，并在80℃水浴中进行超声溶解，样品浓度为2mg/ml。由于米力农在水中几乎不溶，在乙腈中略溶，因此用美国药典标准中的流动相在80℃水浴中超声来配制每1ml含2mg的米力农样品溶液时，很难使米力农溶解，并且溶解后放置在室温下时，米力农很容易析出。在米力农国家标准中，制备HPLC检测样品的方法为：直接将米力农与流动相混合，样品浓度是2mg/ml。然而，实际上这种方法并不能使米力农有效溶解，在实际操作中必须进行很长时间（大约40-60分钟）的超声，并且溶解后放置在室温下时，米力农很容易析出。不能使米力农有效溶解会影响对米力农的分析检测，同时也可能对液相系统造成损害。
乳酸米力农进口复核标准中所记载的方法采用甲醇-硼酸溶液（硼酸溶液浓度为0.01mol/L，用氢氧化钠调pH值至7.0）作为流动相，其中甲醇与硼酸溶液的体积比为32:68。然而，在用该方法检测时，发现米力农的理论塔板数较低，基线不平稳，能检测到的杂质数目较少。因此，该方法也不能有效地将米力农与其有关物质分离。
因此，需要找到能够更加有效地将米力农与其有关物质分离的分离分析方法。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种分离分析米力农的方法。
具体而言，本发明提供了：
（1）一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，其中所述高效液相色谱以甲醇-磷酸盐溶液作为流动相，所述磷酸盐溶液包含二乙胺或三乙胺，并且所述磷酸盐溶液的pH为5.5-6.5。
（2）根据（1）所述的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH为5.8-6.2，优选为6。
（3）根据（1）所述的方法，其中在所述磷酸盐溶液中，所述磷酸盐的浓度为0.01-0.05mol/L，优选为0.02mol/L；所述二乙胺或三乙胺占所述磷酸盐溶液的0.1-0.5体积%，优选占0.3体积%；所述磷酸盐溶液选自磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二铵溶液，其中优选为磷酸二氢钾溶液。
（4）根据（1）所述的方法，其中在所述流动相中，所述甲醇与所述磷酸盐溶液的体积比为(10-25):(75-90)，优选为20:80。
（5）根据（1）所述的方法，其中所述米力农样品选自米力农原料药、乳酸米力农原料药、米力农注射液、和乳酸米力农注射液。
（6）根据（1）所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
1）将所述米力农样品与甲醇混合，获得溶解有米力农的第一溶液；
2）将步骤1）获得的所述第一溶液与所述流动相混合，从而获得第二溶液；
3）用所述高效液相色谱检测步骤2）获得的所述第二溶液。
（7）根据（6）所述的方法，其中在所述步骤1）中，在将所述米力农样品与所述甲醇混合之后，对其进行超声处理；所述超声处理在10-50℃的温度下进行；超声处理的时间为0.1-30分钟，优选为1-5分钟。
（8）根据（6）所述的方法，其中在所述步骤2）中，所述第二溶液中的米力农浓度为1-2mg/ml。
（9）根据（6）所述的方法，其中在所述步骤3）中，所述高效液相色谱采用填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶的色谱柱；柱温为25-35℃；检测波长为210-220nm，优选为220nm。
（10）根据（5）所述的方法，其中当所述米力农样品选自米力农注射液、和乳酸米力农注射液时，所述方法包括：直接用所述高效液相色谱检测所述米力农样品。
（11）一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，所述高效液相色谱采用填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，检测波长为210-220nm，其中所述高效液相色谱以甲醇-磷酸二氢钾溶液作为流动相，所述甲醇与所述磷酸二氢钾溶液的体积比为(10-25):(75-90)，所述磷酸二氢钾溶液的pH为6.0，并且包含占该磷酸二氢钾溶液0.1-0.5体积%的三乙胺，并且所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.01-0.05mol/L，所述方法包括以下步骤：
a）取所述米力农样品，将其与甲醇混合，进行超声处理直至米力农完全溶解，用所述流动相进行稀释，得到米力农的浓度为1-2mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
b）取所述供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
1.本发明的方法对HPLC法的流动相进行了摸索和改进，使得本发明能够有效地将米力农与合成中间体1-(4-吡啶基)丙酮以及其它有关物质（包括其它合成中间体、合成起始物料、合成副产物等）分离，因此本发明能够更好地实现对米力农的质量控制。
2.利用本发明的方法进行分离分析，色谱峰的理论塔板数高，基线平稳，并且能够检测到较多的杂质数目，由此大大提高了对米力农及其有关物质检测的灵敏度和准确度。
3.本发明还进一步优化了在用HPLC分离分析米力农的过程中配制HPLC检测样品的方法，从而使米力农能够有效地溶解，而且避免了米力农沉淀或析出，由此提高了分离分析的效率，并且有利于米力农在分离分析后的进一步纯化。
附图说明
图1是对对比例1中米力农待测试样进行分析分离的HPLC图；
图2是对对比例1中米力农合成中间体1-(4-吡啶基)丙酮待测试样进行分析分离的HPLC图；
图3是对对比例2中米力农待测试样进行分析分离的HPLC图；
图4是对试验例1中米力农待测试样进行分析分离的HPLC图；
图5是对试验例1中米力农合成中间体1-(4-吡啶基)丙酮待测试样进行分析分离的HPLC图；
图6是对试验例2中米力农系统适用性试验溶液进行分析分离的HPLC图；
图7是对试验例3中米力农与各有关物质的混合溶液进行分析分离的HPLC图；
图8是对试验例4中米力农酸破坏待测试样进行分析分离的HPLC图；
图9是对试验例4中米力农碱破坏待测试样进行分析分离的HPLC图；
图10是对试验例4中米力农氧化破坏待测试样进行分析分离的HPLC图；
图11是对试验例4中米力农光照破坏待测试样进行分析分离的HPLC图；
图12是对试验例4中米力农高温破坏待测试样进行分析分离的HPLC图；
图13是试验例5中进样精密度试验的HPLC图；
图14是对试验例6中进行溶液稳定性试验放置0小时后的待测试样进行检测的HPLC图；
图15是对试验例6中进行溶液稳定性试验放置2小时后的待测试样进行检测的HPLC图；
图16是对试验例6中进行溶液稳定性试验放置4小时后的待测试样进行检测的HPLC图；
图17是对试验例6中进行溶液稳定性试验放置8小时后的待测试样进行检测的HPLC图；
图18是对试验例6中进行溶液稳定性试验放置10小时后的待测试样进行检测的HPLC图；
图19是实施例1中有关物质A对照品溶液的HPLC图；
图20是实施例1中供试品溶液的HPLC图；
图21是实施例1中对照溶液的HPLC图；
图22是实施例1中系统适用性试验溶液的HPLC图；
图23是实施例2中供试品溶液的HPLC图；
图24是实施例3中供试品溶液的HPLC图；
图25是实施例4中供试品溶液的HPLC图；
图26是实施例5中供试品溶液的HPLC图；
图27是实施例6中供试品溶液的HPLC图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
为了解决现有技术中所存在的上述问题，本发明的发明人尝试对利用HPLC法分离分析米力农的方法进行改进。由于在利用HPLC对物质进行检测时，试验参数的改变通常会导致显著的检测结果差异，因此，在对权威的标准方法进行改变时，通常只在原有基础上进行较小的变化。然而，本发明的发明人摸索了多种试验条件（对所用色谱柱、所用流动相的组成、pH、浓度等，以及它们的组合均进行了试验），最终经过这些大量的创造性试验惊奇地发现，当以甲醇-磷酸盐溶液作为HPLC的流动相，并且使所述磷酸盐溶液的pH为5.5-6.5时，能够有效地将米力农与其有关物质（包括合成起始物料、中间体、副产物等）分离，并且色谱峰的理论塔板数高，基线平稳，能够检测到较多的杂质数目，从而大大提高对米力农及其有关物质检测的灵敏度和准确度。
因此，本发明提供了一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，其中所述高效液相色谱以甲醇-磷酸盐溶液作为流动相，所述磷酸盐溶液包含二乙胺或三乙胺，并且所述磷酸盐溶液的pH为5.5-6.5。
本发明的方法可用于检测米力农原料药、乳酸米力农原料药、米力农注射液、和乳酸米力农注射液。
在本文中，在述及米力农时所提到的术语“米力农有关物质”或“有关物质”的含义是本领域技术人员所公知的，其是指在合成米力农过程中混入米力农中的物质，包括合成起始物料、中间体、副产物等工艺杂质、以及存放过程中产生的降解产物等。所述合成起始物料例如原甲酸三乙酯、4-甲基吡啶等；所述中间体例如1-(4-吡啶基)丙酮；所述副产物例如米力农有关物质A。
在本文中，术语“米力农有关物质A”在米力农国家标准WS1-(X-109)-2006Z中有所记载，其含义是本领域技术人员所公知的，其化学名称为1，6-二氢-2-甲基-6-氧代-(3，4’-二吡啶)-5-酰胺。
在本文中，术语“乳酸米力农”是本领域技术人员所公知的，当用HPLC进行检测时，乳酸与米力农分离，从而在色谱图上出现分离的米力农峰和乳酸峰。
在本文中，术语“系统适用性试验溶液”是指，米力农与米力农有关物质A的混合物溶液，其可用于考察色谱条件是否能够用于分离分析米力农。
在本文中，术语“分离度”是指，米力农主峰与其有关物质峰的分离程度。
在本文中，术语“室温”是指10-30℃。
在本发明的方法中，所述磷酸盐溶液的pH优选为5.8-6.2，更优选为6。
在本发明的方法中，优选的是，在所述磷酸盐溶液中，所述磷酸盐的浓度为0.01-0.05mol/L，更优选为0.02mol/L。
此外，在所述磷酸盐溶液中，所述二乙胺或三乙胺优选占所述磷酸盐溶液的0.1-0.5体积%，更优选占0.3体积%。
在本发明中，所述磷酸盐溶液优选选自磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二铵溶液，其中更优选为磷酸二氢钾溶液。
此外，在所述流动相中，所述甲醇与所述磷酸盐溶液的体积比优选为(10-25):(75-90)，更优选为20:80。当在流动相中甲醇占10%时，米力农主峰保留时间稍长，但各杂质与米力农能够更加有效的分离；当在流动相中甲醇占25%时，米力农主峰保留时间较适中，各杂质与米力农也能够基线分离。因此，在上述比例范围内都能够满足分离要求。
进一步地，本发明的发明人还优化了配制HPLC检测样品的方法，发现先用甲醇溶解米力农样品，再用所述流动相进行稀释，这样可以使米力农得到更有效的溶解，而且避免了米力农沉淀或析出，由此提高了分离分析的效率，并且有利于米力农在分离分析后的进一步纯化。
具体而言，本发明的方法优选包括以下步骤：
1）将所述米力农样品与甲醇混合，获得溶解有米力农的第一溶液；
2）用所述流动相稀释步骤1）获得的所述第一溶液，从而获得第二溶液；
3）用所述高效液相色谱检测步骤2）获得的所述第二溶液。
在本发明的方法的所述步骤1）中，在将所述米力农样品与所述甲醇混合之后，优选对所获得混合液进行超声处理，这样能够使米力农更加迅速地溶解。
所述超声处理可以在小于或等于50℃的温度下进行，例如可以在室温（即10-30℃）下进行。超声处理所需的时间可以根据需要进行，并且远远低于米力农美国药典标准（USP32-NF27）和米力农国家标准（WS1-(X-1090-2006Z)）所需的时间，例如，在本发明中，超声处理可以进行0.1-30分钟，例如可以进行1-5分钟。
在本发明的方法的所述步骤2）中，所述第二溶液中的米力农浓度优选为1-2mg/ml。
在本发明的方法中，在进行HPLC检测时，可以使用填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶的色谱柱。柱温可以为25-35℃。检测波长可以为210-220nm，优选为220nm。
在本发明的一个实施方案中，当米力农样品选自米力农注射液、和乳酸米力农注射液时，本发明的方法可以直接用所述高效液相色谱检测所述米力农样品，也可以先将米力农样品与流动相混合再进行HPLC检测。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明涉及一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，所述高效液相色谱采用填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，检测波长为210-220nm，其中所述高效液相色谱以甲醇-磷酸二氢钾溶液作为流动相，所述甲醇与所述磷酸二氢钾溶液的体积比为(10-25):(75-90)，所述磷酸二氢钾溶液的pH为6.0，并且包含占该磷酸二氢钾溶液0.1-0.5体积%的三乙胺，并且所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.01-0.05mol/L，所述方法包括以下步骤：
a）取所述米力农样品，将其与甲醇混合，进行超声处理直至米力农完全溶解，用所述流动相进行稀释，得到米力农的浓度为1-2mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
b）取所述供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
在本发明的又一个具体的实施方案中，本发明涉及一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，所述高效液相色谱采用填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，检测波长为210-220nm，其中所述高效液相色谱以甲醇-磷酸二氢钾溶液作为流动相，所述甲醇与所述磷酸二氢钾溶液的体积比为(10-25):(75-90)，所述磷酸二氢钾溶液的pH为6.0，并且包含占该磷酸二氢钾溶液0.1-0.5体积%的三乙胺，并且所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.01-0.05mol/L，所述方法包括以下步骤：
i）取待测米力农样品，加适量甲醇进行超声溶解，用所述流动相稀释成米力农浓度为1-2mg/ml的供试品溶液；
ii）用所述流动相将供试品溶液稀释1000倍作为对照溶液；
iii）取适量米力农有关物质A对照品，精密称定，加适量甲醇-水（体积比为80:20）进行超声溶解，用所述流动相稀释成米力农有关物质A对照品浓度为约1μg/ml的溶液，作为有关物质A对照品溶液；
iv）分别取适量米力农和米力农有关物质A对照品，向米力农中加适量甲醇进行超声溶解，向米力农有关物质A对照品中加适量甲醇-水（体积比为80:20）进行超声溶解，用所述流动相分别稀释成米力农或米力农有关物质A对照品浓度为约0.1mg/ml的溶液，取上述溶液各1ml，置同一个10ml量瓶中，用所述流动相稀释至刻度，作为系统适用性试验溶液；
v）取所述系统适用性试验溶液20μl注入高效液相色谱仪，连续进样5次，米力农有关物质A与米力农的相对保留时间约为0.88，米力农有关物质A的峰与米力农的峰的分离度大于1.5，米力农峰面积的相对标准偏差（RSD）小于2%；
vi）精密量取所述对照溶液、所述有关物质A对照品溶液和所述供试品溶液各20μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
vii）有关物质A按外标法计算，其它杂质按主成分自身对照法计算。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
米力农、米力农注射液、米力农有关物质A、1-(4-吡啶基)丙酮购自北大国际医院集团西南合成制药有限公司；原甲酸三乙酯、4-甲基吡啶购自北京化学试剂公司；辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C8柱）和十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（C18柱）购自安捷伦公司；高效液相色谱仪购自岛津公司，型号为LC-2010AHT。
对比例1：
试验名称：用米力农美国药典标准（USP32-NF27）和米力农国家标准（WS1-(X-1090-2006Z)）的方法测定米力农及其有关物质
样品制备：
取磷酸氢二钾2.7g，加水800ml溶解后，加三乙胺2.4ml，用磷酸调pH值至7.5，得水相。取水相与乙腈以80:20的体积比配制成流动相。
米力农美国药典方法：精密称取适量米力农样品，与流动相混合，在80℃水浴加热下超声处理60分钟，样品浓度为2mg/ml。该样品记为样品1。
米力农国家标准方法：精密称取适量米力农样品，与流动相混合，超声处理60分钟，样品浓度为2mg/ml。该样品记为样品2。
精密称取适量米力农合成中间体1-(4-吡啶基)丙酮样品，用流动相溶解，浓度为1mg/ml。该样品记为样品3。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取样品1-3各20μl，分别进样。
试验结果：
1）按照上述美国标准和国家标准配置样品溶液时，米力农很难溶解，并且溶解后放置在室温时，很容易析出。
2）HPLC结果如图1（样品1）和图2（样品3）所示。米力农和中间体1-(4-吡啶基)丙酮的保留时间分别为5.632分钟和5.876分钟，二者未能有效分离。
试验结论：该方法不适用于米力农及其有关物质的分离分析。
对比例2：
试验名称：用乳酸米力农注射液进口复核标准的方法测定米力农及其有关物质
样品制备：
制备0.01mol/L硼酸溶液，用氢氧化钠调pH值至7.0，得水相。取水相与甲醇以75:25的体积比配制成流动相。
精密称取适量米力农样品，用流动相溶解，样品浓度是1mg/ml。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C18色谱柱规格为15cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取所制备的样品溶液20μl，注入高效液相色谱仪。
试验结果：
结果如图3所示。米力农样品共检测到2个杂质，米力农主峰理论塔板数为2256，拖尾因子为1.676。
试验结论：用该色谱条件检测有关物质，检测到的杂质数较少，理论塔板数较低，色谱峰对称性较差，故该方法不适合测定米力农有关物质。
试验例1
试验名称：分离分析米力农及其有关物质的标准方法的优化
试验目的：优化分离分析米力农及其有关物质的标准方法
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
精密称取米力农约10mg，加适量甲醇，室温下超声溶解，用所述流动相稀释成米力农浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
精密称取米力农合成中间体1-(4-吡啶基)丙酮适量，用所述流动相溶解稀释成1-(4-吡啶基)丙酮浓度为1mg/ml的溶液。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取供试品溶液和所配制的1-(4-吡啶基)丙酮溶液各20μl，分别进样。
试验结果：
米力农色谱图见图4，中间体1-(4-吡啶基)丙酮的色谱图见图5。由图可知，在此条件下，对米力农进行分离分析能够检测到9个杂质，米力农的保留时间为15.147分钟（图4）；中间体1-(4-吡啶基)丙酮的保留时间为9.155分钟（图5）；米力农主峰理论塔板数：12200，拖尾因子：1.327。
试验结论：
当流动相的有机相采用甲醇，有机相与水相体积比为20:80，水相pH值为6.0时，米力农主峰保留时间较适中，基线较平稳，理论塔板数较高，色谱峰对称性好，能够检测到的杂质数较多，米力农与中间体能够有效分离。
试验例2：
试验名称：本发明的米力农及其有关物质分离分析方法的验证-系统适应性试验
试验目的：通过系统适应性试验，验证本发明的米力农及其有关物质分离分析方法的准确性
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
分别取米力农和米力农有关物质A对照品适量，将该米力农与适量甲醇混合，将该米力农有关物质A对照品与适量甲醇-水（体积比80:20）混合，室温下进行超声，分别用流动相稀释成米力农或米力农有关物质A对照品浓度为约0.1mg/ml的溶液，取该溶液各1ml，置于10ml量瓶中，用所述流动相稀释至刻度，摇匀，即得系统适用性试验溶液。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取系统适用性试验溶液20μl，注入高效液相色谱仪。
试验结果：
结果如图6所示。米力农有关物质A（保留时间为13.888）与米力农（保留时间为15.670）的相对保留时间约为0.88，米力农有关物质A峰与米力农峰的分离度为2.69，均大于1.5，连续进样5次，米力农峰面积的RSD为0.46%，远小于2%。
试验结论：本发明的米力农及其有关物质分离分析方法符合测试要求。
试验例3：
试验名称：本发明的方法的验证-中间体分离试验
试验目的：通过中间体分离试验，验证本发明的方法的准确性
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
分别取适量米力农、原甲酸三乙酯、1-(4-吡啶基)丙酮、米力农有关物质A和4-甲基吡啶，分别按照试验例1所述的方法用适量甲醇溶解后，用所述流动相配成1mg/ml的溶液。
另取配制好的米力农、米力农有关物质A、4-甲基吡啶、1-(4-吡啶基)丙酮和原甲酸三乙酯溶液各1ml置于同一个10ml量瓶中，混合得到混合溶液。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
上述配制的米力农、原甲酸三乙酯、1-(4-吡啶基)丙酮、米力农有关物质A、4-甲基吡啶溶液和所述混合溶液各取20μl，分别进样。由此考察米力农与有关物质A及各种其它有关物质的分离情况。
试验结果：见下表1，各有关物质的分离情况见图7。
表1.中间体分离试验结果
| 样品名称 | 保留时间（min） | 分离度 |
| 原甲酸三乙酯 | 8.251 | / |
| 1-（4-吡啶基）丙酮 | 9.385 | 3.835 |
| 米力农有关物质A | 14.239 | 12.026 |
| 米力农 | 15.842 | 3.236 |
| 4-甲基吡啶 | 23.868 | 12.392 |
试验结论：米力农与各有关物质均能有效分离。
试验例4：
试验名称：本发明的方法的验证-强制降解试验
试验目的：通过强制降解试验，验证本发明的方法的专属性
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
取米力农，分别在酸、碱、氧化、高温、光照条件下处理，以考查本品的稳定情况及降解杂质与主峰的分离情况。具体如下：
酸破坏样品：取米力农约10mg，置10ml量瓶中，加2mol/L的盐酸溶液1ml，室温放置2天，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至中性，用流动相稀释至刻度，摇匀，发现有固体析出，加入2ml甲醇超声溶解，摇匀，即得。
碱破坏样品：取米力农约10mg，置10ml量瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液2ml，室温放置2天，用1mol/L的盐酸溶液调pH值至中性，用流动相稀释至刻度，摇匀，发现有固体析出，加入2ml甲醇超声溶解，摇匀，即得。
氧化破坏样品：取米力农约10mg，置10ml量瓶中，加3%的双氧水1ml，室温放置2天，用适量甲醇超声溶解，流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
光照破坏样品：取在紫外灯下照射5天的米力农约10mg，置10ml量瓶中，用适量甲醇溶解，流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏样品：取在150℃条件下放置12小时的米力农约10mg，置10ml量瓶中，用适量甲醇溶解，流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取上述溶液各20μl，分别进样。
试验结果：见下表2，色谱图见图8-12。
表2.强制降解试验结果
| 破坏条件 | 有关物质A | 米力农主峰 | 其它杂质 |
| 酸破坏 | 略增加 | 未见明显降解 | 未见明显变化 |
| 碱破坏 | 增加约39倍 | 约降解3% | 产生几个未知杂质 |
| 氧化破坏 | 增加约13倍 | 约降解3% | 产生多个未知杂质 |
| 光照破坏 | 增加约8倍 | 约降解6% | 未见明显变化 |
| 高温破坏 | 略增加 | 约降解5% | 未见明显变化 |
试验结论：米力农在光照、碱及氧化条件下有关物质A增加比例较高，杂质数目也增加；高温、酸条件下有关物质A略增加；各破坏条件下产生的杂质与主峰均能达到基线分离，专属性符合测试要求。
试验例5：
试验名称：本发明的方法的验证-进样精密度试验
试验目的：通过精密度试验，验证本发明的方法的精密性
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
取米力农，按照试验例1所述的方法用适量甲醇溶解，用所述流动相稀释成1mg/ml的溶液。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取上述制备的样品溶液20μl，连续进样6针，考察米力农主峰峰面积及有关物质A峰面积的精密程度。
试验结果：见下表3，进样第一针的色谱图见图13。
表3.进样精密度试验结果
试验结论：从结果可以看出，本发明的方法的溶液进样精密度良好。
试验例6：
试验名称：本发明的方法的验证-溶液稳定性试验
试验目的：通过溶液稳定性试验，验证本发明的方法的米力农检测用溶液的稳定性。
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
取米力农，按照试验例1所述的方法用适量甲醇溶解，用所述流动相稀释成1mg/ml的溶液，室温下放置，于不同时间进样，来考察本发明的方法的米力农检测用溶液的稳定性。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取在室温下放置不同时间的样品溶液各20μl，分别进样。
试验结果：见下表4，色谱图见图14-18。
表4.HPLC检测用溶液的稳定性试验结果
试验结论：本发明的方法的米力农检测用溶液在10小时内稳定性均良好。
实施例1
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
精密称取米力农约10mg，加适量甲醇，在室温下超声1分钟，米力农完全溶解后，用所述流动相稀释成米力农浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。
精密量取所述供试品溶液，用所述流动相稀释成米力农浓度为1μg/ml的溶液，作为对照溶液。
精密称取米力农有关物质A对照品适量，将其与适量甲醇-水（体积比为80:20）混合，在室温下超声，用所述流动相稀释成米力农有关物质A对照品浓度为1μg/ml的溶液，作为有关物质A对照品溶液。
分别取米力农和米力农有关物质A对照品适量，将该米力农与适量甲醇混合，将该米力农有关物质A对照品与适量甲醇-水（体积比80:20）混合，在室温下分别进行超声，分别用流动相稀释成米力农或米力农有关物质A对照品浓度为约0.1mg/ml的溶液，取该溶液各1ml，置于同一10ml量瓶中，用所述流动相稀释至刻度，作为系统适用性试验溶液。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
取系统适用性试验溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。检测结果如图22所示。米力农有关物质A与米力农的相对保留时间约为0.88，米力农有关物质A峰与米力农峰的分离度大于1.5，连续进样5次，米力农峰面积的RSD小于2%。
精密量取有关物质A对照品溶液、供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。检测结果分别如图19-21所示。用杂质对照品法计算有关物质A，用主成分自身对照法计算其它杂质。
试验结果：
由图19可知米力农有关物质A峰的保留时间为13.651。由图20可知米力农峰的保留时间为15.299，其它标出保留时间的峰均为检测到的杂质，其中保留时间为13.632的峰为米力农有关物质A。图22中保留时间为13.814的峰为米力农有关物质A，保留时间为15.586的峰为米力农。
试验结论：
由图19-22可知，在本发明的条件下，系统适用性试验符合要求，米力农主峰与各杂质均能够有效分离，米力农色谱峰峰型较好，基线较平稳，可以准确测定米力农中的有关物质。
实施例2
样品制备、色谱条件以及测定方法均按照实施例1的方法进行，不同之处在于：流动相的pH为5.8。
对供试品溶液进行检测的结果如图23所示，由图可知，在本发明的条件下，米力农主峰与各杂质均能够有效分离，米力农色谱峰峰型较好，基线较平稳，可以准确测定米力农中的有关物质。
实施例3
样品制备、色谱条件以及测定方法均按照实施例1的方法进行，不同之处在于：流动相的pH为6.2。
对供试品溶液进行检测的结果如图24所示，由图可知，在本发明的条件下，米力农主峰与各杂质均能够有效分离，米力农色谱峰峰型较好，基线较平稳，可以准确测定米力农中的有关物质。
实施例4
样品制备、色谱条件以及测定方法均按照实施例1的方法进行，不同之处在于：流动相中，甲醇与水相的体积比为23:77。
对供试品溶液进行检测的结果如图25所示，由图可知，在本发明的条件下，米力农主峰与各杂质均能够有效分离，米力农色谱峰峰型较好，基线较平稳，可以准确测定米力农中的有关物质。
实施例5
样品制备、色谱条件以及测定方法均按照实施例1的方法进行，不同之处在于：流动相中，甲醇与水相的体积比为18:82。
对供试品溶液进行检测的结果如图26所示。由图可知，当甲醇与水相的体积比为18:82时，米力农主峰的保留时间较长，各杂质与米力农能够更加有效的分离。此外，由图可知，在本发明的条件下，米力农主峰与各杂质均能够有效分离，米力农色谱峰峰型较好，基线较平稳，可以准确测定米力农中的有关物质。
实施例6
样品制备：
取磷酸二氢钾2.7g，加水1000ml使其溶解，向其中加三乙胺3.0ml，用10%的磷酸溶液调节pH值至6.0，得水相。取水相与甲醇以80:20的体积比配制成流动相。
取米力农注射液，其中米力农浓度为1mg/ml，作为供试品溶液。
色谱条件：
仪器为岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，C8色谱柱规格为25cm×4.6mm，5μm；流动相为本例所配制的流动相；检测波长为220nm；流速为1.0ml/分钟。
测定方法：
精密量取供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。
试验结果：
如图27所示，保留时间为14.332的峰为米力农，保留时间为13.290的峰为米力农有关物质A。图中还可见到其它杂质峰。
试验结论：
由该结果可知，米力农主峰与各杂质均能够有效分离，米力农色谱峰峰型较好，基线较平稳，可以准确测定米力农中的有关物质。
Claims (15)
1.一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，其中所述高效液相色谱以甲醇-磷酸盐溶液作为流动相，其中在所述流动相中，所述甲醇与所述磷酸盐溶液的体积比为(10-25):(75-90)，所述磷酸盐溶液包含二乙胺或三乙胺，并且所述磷酸盐溶液的pH为5.5-6.5，
其中所述方法包括以下步骤：
1)将所述米力农样品与甲醇混合，获得溶解有米力农的第一溶液；
2)将步骤1)获得的所述第一溶液与所述流动相混合，从而获得第二溶液；
3)用所述高效液相色谱检测步骤2)获得的所述第二溶液，其中在所述步骤3)中，所述高效液相色谱采用填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶的色谱柱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH为5.8-6.2。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐溶液的pH为6。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述磷酸盐溶液中，所述磷酸盐的浓度为0.01-0.05mol/L；所述二乙胺或三乙胺占所述磷酸盐溶液的0.1-0.5体积％；所述磷酸盐溶液选自磷酸二氢钾溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸二氢钠溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢铵溶液、磷酸氢二铵溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐的浓度为0.02mol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述二乙胺或三乙胺占所述磷酸盐溶液的0.3体积％。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐溶液为磷酸二氢钾溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述流动相中，所述甲醇与所述磷酸盐溶液的体积比为20:80。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述米力农样品选自米力农原料药、乳酸米力农原料药、米力农注射液、和乳酸米力农注射液。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤1)中，在将所述米力农样品与所述甲醇混合之后，对其进行超声处理；所述超声处理在10-50℃的温度下进行；所述超声处理的时间为0.1-30分钟。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述超声处理的时间为1-5分钟。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤2)中，所述第二溶液中的米力农浓度为1-2mg/ml。
13.根据权利要求1所述的方法，柱温为25-35℃；检测波长为210-220nm。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述检测波长为220nm。
15.一种分离分析米力农的方法，所述方法采用高效液相色谱对米力农样品进行检测，所述高效液相色谱采用填充剂为辛烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，检测波长为210-220nm，其中所述高效液相色谱以甲醇-磷酸二氢钾溶液作为流动相，所述甲醇与所述磷酸二氢钾溶液的体积比为(10-25):(75-90)，所述磷酸二氢钾溶液的pH为6.0，并且包含占该磷酸二氢钾溶液0.1-0.5体积％的三乙胺，并且所述磷酸二氢钾溶液中磷酸二氢钾的浓度为0.01-0.05mol/L，所述方法包括以下步骤：
a)取所述米力农样品，将其与甲醇混合，进行超声处理直至米力农完全溶解，用所述流动相进行稀释，得到米力农的浓度为1-2mg/ml的溶液，作为供试品溶液；
b)取所述供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
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