CN111751358A - 一种检测血清中尿酸氧化酶含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测血清中尿酸氧化酶含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）标准品制备：取已知酶比活性的尿酸氧化酶，用Tris‑HCl溶液稀释；2）标准曲线制作：在试管中加入工作溶液，再加入标准品及空白血清，恒温水浴反应后加入终止液终止，检测吸光值；3）样品检测：在试管中加入工作溶液，再加入待测样品，恒温水浴反应后加入终止液终止，检测吸光值；4）数据测定与计算：根据标准品的酶比活性和标准曲线各点中的标准品蛋白含量计算各点标准品酶活性；再以标准曲线各点吸光值对各点标准品酶活性拟合标准曲线；将待测样品吸光值代入标准曲线，通过计算公式得出待测样品蛋白含量。本发明的方法很精确，且简单快速，相对于现有的复杂的方法，大大节约了成本。

Description

一种检测血清中尿酸氧化酶含量的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种血清中尿酸氧化酶的检测方法。

背景技术

尿酸氧化酶已有数个产品已经上市或处于非临床研究和临床研究阶段，用于治疗高尿酸血症、痛风等疾病。对于非临床研究和临床研究而言，实验动物或受试者血清样本中尿酸氧化酶的含量是评价尿酸氧化酶体内代谢情况的关键指标。

目前，尿酸氧化酶的检测方法主要有免疫法和活性法。其中活性法根据检测物质的不同又可以分为检测尿酸的减少与尿囊素的增加两种方法。

免疫法需要相应的抗尿酸氧化酶抗体，若市面上没有对应种属来源的商业化的抗体，则需自行制备，自行制备与纯化抗体需三个月以上，时间成本与经济成本均较高。

一般检测尿酸氧化酶产品酶比活性的方法为使用紫外分光光度计检测反应体系中的尿酸减少。将这种方法应用于血清中尿酸氧化酶的检测时，血清中其他物质也会有吸收，而且不同来源的血清吸收值差别很大，从而降低了检测的精密度和精确度。为避免这种干扰，常见的检测血清中尿酸氧化酶的活性法为质谱法，需要使用质谱仪及同位素标记的尿囊素，成本极高。

综上，现有技术存在多种技术问题，不能精确且快速检测血清中的尿酸氧化酶含量。

本发明已经解决了上述技术问题，提供了一种精确且快速检测聚血清中的尿酸氧化酶含量的方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种精确且快速检测血清中尿酸氧化酶含量的方法。

正是基于上述与现有技术完全不同的技术思路，发明人提供了一种新的技术解决方案，并解决了现有技术存在的技术问题。

本发明的技术方案如下：

一种检测血清中尿酸氧化酶含量的方法，包括如下步骤：

1)标准品制备：取已知酶比活性的尿酸氧化酶，用Tris-HCl溶液稀释；

2)标准曲线制作：在试管中加入工作溶液，再加入标准品及空白血清，恒温水浴反应后加入终止液终止，检测吸光值；

3)样品检测：在试管中加入工作溶液，再加入待测样品，恒温水浴反应后加入终止液终止，检测吸光值；

4)数据测定与计算：根据标准品的酶比活性和标准曲线各点中的标准品蛋白含量计算各点标准品酶活性；再以标准曲线各点吸光值对各点标准品酶活性拟合标准曲线；将待测样品吸光值代入标准曲线，通过计算公式得出待测样品蛋白含量；

计算公式如下：

标准品酶活＝标准品酶比活性×标准品加样体积×标准品蛋白含量×10^-6

所述步骤2)和步骤3)中，工作溶液中含有4-氨基安替比林、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、辣根过氧化物酶、亚铁氰化钾、Triton X-100、抗坏血酸氧化酶和尿酸。

优选地，

所述步骤1)中，所用Tris-HCl溶液pH值为8.0。辣根过氧化物酶的最适pH值在6.0至6.5之间，但尿酸氧化酶在此pH值范围下的酶活性只有最高酶活性的40％左右。通过将反应体系的pH值提高至弱碱性，可以显著提高反应体系的吸光值，从而提高反应的检测限和线性范围。

所述步骤2)和步骤3)中，终止液为还原型谷胱甘肽。由于反应体系中尿酸过量，体系中两组酶促反应会不断地进行，若不终止反应，体系吸光值会随着反应时间延长不断升高，无法正常读数。又因为最终生成的显色物质只能在较小的pH值范围内保持稳定，pH值过高或过低都会使显色物质快速分解。因此传统的通过加入酸碱终止酶反应的方法并不可行。因此从辣根过氧化物酶性质出发，使用还原型谷胱甘肽抑制辣根过氧化物酶的活性，从而达到终止体系反应的目的。

本发明的标准品酶活和待测样品蛋白含量的计算公式中，各参数单位如下：

酶活单位为：活性单位，U

酶比活性单位为：活性单位每毫克，U/mg

加样体积单位为：微升，μl

蛋白含量单位为：微克每毫升，μg/mL

吸光值、截距和斜率均无单位。

本发明的“尿酸氧化酶”是指任何重组尿酸氧化酶或聚乙二醇修饰尿酸氧化酶。

本发明检测过程中，反应原理如下：体系中的尿酸氧化酶催化尿酸生成尿囊素与过氧化氢，过氧化氢再与4-氨基安替比林(4-AAP)、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(DHBS)在辣根过氧化物酶(HRP)的作用下生成醌亚胺类红色物质，该物质在520nm下有最大吸收。反应路线如下：

本发明的结果是用于临床研究和非临床研究中为评价尿酸氧化酶体内代谢情况提供关键指标，不属于疾病的诊断方法。

本发明通过测定血清样本中尿酸氧化酶酶活性的方式，并创造性地归纳出新的数学式，来计算样本中尿酸氧化酶含量，产生了意想不到的技术效果。具体来说，包括如下技术效果：

1)本发明的方法很精确，从实施例可以看出，测得样品的蛋白含量结果与理论值非常接近。

2)本发明的方法简单快速，通过特定的数学式即可计算得到尿酸氧化酶蛋白含量，相对于现有的复杂的方法，大大节约了成本。

3)现有检测尿酸氧化酶产品酶比活性的方法为使用紫外分光光度计检测反应体系中的尿酸减少。将这种方法应用于血清中尿酸氧化酶的检测时，血清中其他物质也会有吸收，而且不同来源的血清吸收值差别很大，检测的时候对每一个待测样品都需要做一条标准曲线。而采用本发明的方法，不同来源的血清吸光值差异可以忽略不计，因此只需要做一条标准曲线，本发明精确度和精密度高于现有技术。

具体实施方式

实施例中涉及的原料说明如下：

尿酸氧化酶蛋白，为本领域技术人员已知的任何重组尿酸氧化酶，具体可参考中国专利CN103173471A制备。

待测样品是含一定量已知酶比活性的尿酸氧化酶的血清。血清为人血清、兔血清、鼠血清或狗血清。

分子量为10kDa的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯，购自北京键凯科技股份有限公司。

聚乙二醇修饰尿酸氧化酶，由上述尿酸氧化酶蛋白与单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯缀合而成，可通过本领域技术人员已知的任何缀合反应进行。

实施例1

1、待测样品准备

取尿酸氧化酶(蛋白含量1.5mg/mL，酶比活性为16.3U/mg)用市售空白兔血清稀释100倍，使得蛋白终浓度为0.015mg/mL。即得尿酸氧化酶待测样品。

2、溶液配制：

Tris-HCl溶液的配制：称取6.05g Tris，溶于500mL蒸馏水，调节pH至8.04。

溶液A的配制：称取0.0067g 4-AAP(4-氨基安替比林)，0.0017g亚铁氰化钾，溶于100mL Tris-HCl溶液。

溶液B的配制：称取0.212g DHBS(3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)，0.5g Triton X-100，溶于100mL Tris-HCl溶液。

尿酸溶液的配制：称取0.0168g尿酸溶于100mL Tris-HCl溶液。

Tris-HCl-B溶液的配制：取50mL Tris-HCl溶液，调节pH至6.02。

终止液的配制：称取0.006g还原型谷胱甘肽，溶于10mL Tris-HCl-B溶液。

HRP溶液的配制：称取0.007g辣根过氧化物酶，溶于10mL Tris-HCl-B溶液。

AOX溶液的配制：称取0.006g抗坏血酸氧化酶，溶于10mL Tris-HCl-B溶液。

3、操作步骤：

1)标准品制备：取已知酶比活性为14.1U/mg的尿酸氧化酶用Tris-HCl溶液稀释至20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1μg/mL作为标准品。

2)标准曲线制作：取50mL溶液A，加入100μL HRP溶液和100μL AOX溶液，混匀并称为溶液Af。在9支试管中分别加入900μL溶液Af和300μL溶液B和200μL尿酸溶液。将试管置于30℃恒温水浴下平衡10分钟。在其中8支试管中分别加入50μL空白兔血清和50μL各浓度的标准品，另1支试管中加入50μL空白兔血清和50μL Tris-HCl溶液，作为标准曲线的空白对照。将试管置于30℃恒温水浴下反应15分钟后加入100μL终止液。

3)待测样品检测：在3支试管中分别加入900μL溶液Af和300μL溶液B，并编号为1、2、3。在1、2号试管中加入200μL尿酸溶液和50μL Tris-HCl溶液，在3号试管中加入250μLTris-HCl溶液并将其作为待测样品的空白对照。将试管置于30℃恒温水浴下平衡10分钟后加入待测样品50μL，混匀后继续水浴下反应15分钟后加入100μL终止液。

4)数据测定与计算：用相应的空白对照调零，在分光光度计上测定各试管中溶液在520nm波长处的吸光值；根据标准品的酶比活性和标准曲线各点中的标准品蛋白含量计算各点标准品酶活性；再以标准曲线各点吸光值对各点标准品酶活性拟合标准曲线；将待测样品吸光值代入标准曲线，通过计算公式得出待测样品蛋白含量。

4、检测结果：

标准曲线测得结果如表1，拟合得到的标准曲线方程为y＝76.083x-0.0005。

表1标准曲线

待测样品吸光值平均值与计算得到的样品中尿酸氧化酶含量如表2。

表2样品检测结果

公式中，

酶活单位为：活性单位，U

酶比活性单位为：活性单位每毫克，U/mg

加样体积单位为：微升，μl

蛋白含量单位为：微克每毫升，μg/mL

吸光值、截距和斜率均无单位。

结论：从上述结果可以看出，采用本发明的方法得到的待测样品蛋白含量与理论值非常接近，说明本发明的方法非常精确。

实施例2采用本发明方法与现有尿酸法检测待测样品蛋白含量的对照试验

1、待测样品

待测样品为聚乙二醇化尿酸氧化酶药代动力学实验用食蟹猴血清，分别为给药前采血、给药30分钟后采血和给药4天后采血所得到的血清。用于给药的聚乙二醇化尿酸氧化酶酶比活性为3.8U/mg。

2、溶液配制：

TEA缓冲液的配制：称取0.29g EDTA、7.45g三乙醇胺，用900mL蒸馏水溶解后，调节pH至8.9。最后用蒸馏水定容到1L。

尿酸溶液(T)的配制：称取0.017g尿酸，溶于500mL TEA缓冲液。

终止液(K)的配制：称取20g氢氧化钾，溶于100mL蒸馏水。

Tris-HCl溶液的配制：称取6.05g Tris，溶于500mL蒸馏水，调节pH至8.04。

溶液A的配制：称取0.0067g 4-AAP(4-氨基安替比林)，0.0017g亚铁氰化钾，溶于100mL Tris-HCl溶液。

溶液B的配制：称取0.212g DHBS(3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)，0.5g Triton X-100，溶于100mL Tris-HCl溶液。

尿酸溶液的配制：称取0.0168g尿酸溶于100mL Tris-HCl溶液。

Tris-HCl-B溶液的配制：取50mL Tris-HCl溶液，调节pH至6.02。

终止液的配制：称取0.006g还原型谷胱甘肽，溶于10mL Tris-HCl-B溶液。

HRP溶液的配制：称取0.007g辣根过氧化物酶，溶于10mL Tris-HCl-B溶液。

AOX溶液的配制：称取0.006g抗坏血酸氧化酶，溶于10mL Tris-HCl-B溶液。

3、操作步骤：

3.1本发明AAP法

1)标准品制备：取已知酶比活性为5.5U/mg的聚乙二醇化尿酸氧化酶用Tris-HCl溶液稀释至20、10、5、2、1、0.5μg/mL作为标准品。

2)标准曲线制作：取50mL溶液A，加入100μL HRP溶液和100μL AOX溶液，混匀并称为溶液Af。在9支试管中分别加入900μL溶液Af和300μL溶液B和200μL尿酸溶液。将试管置于30℃恒温水浴下平衡10分钟。在其中8支试管中分别加入50μL空白猴血清和50μL各浓度的标准品，另1支试管中加入50μL空白猴血清和50μL Tris-HCl溶液，作为标准曲线的空白对照。将试管置于30℃恒温水浴下反应15分钟后加入100μL终止液。

3)待测样品检测：在3支试管中分别加入900μL溶液Af和300μL溶液B，并编号为1、2、3。在1、2号试管中加入200μL尿酸溶液和50μL Tris-HCl溶液，在3号试管中加入250μLTris-HCl溶液并将其作为待测样品的空白对照。将试管置于30℃恒温水浴下平衡10分钟后加入待测样品50μL，混匀后继续水浴下反应15分钟后加入100μL终止液。

4)数据测定与计算：用相应的空白对照调零，在分光光度计上测定各试管中溶液在520nm波长处的吸光值；根据标准品的酶比活性和标准曲线各点中的标准品蛋白含量计算各点标准品酶活性；再以标准曲线各点吸光值对各点标准品酶活性拟合标准曲线；将待测样品吸光值代入标准曲线，通过计算公式得出待测样品蛋白含量。

3.2现有尿酸法

1)标准曲线制作：在5支试管中分别加入4、3.5、3、2.5和2mL TEA缓冲液，再加入0.5、1、1.5、2和2.5mL尿酸溶液(T)，混匀作为标准曲线。另取1支试管，加入4.5mL TEA缓冲液，作为标准曲线的空白对照。将试管置于30℃恒温水浴下平衡10分钟后加入100μL空白猴血清并混匀，继续放置5分钟后加入0.5mL终止液(K)。

2)待测样品检测：在3支试管中分别加入3mL TEA缓冲液和1.5mL尿酸溶液(T)，并编号为1、2、3。将3号试管作为对照。将试管置于30℃恒温水浴下平衡10分钟后，在1、2号试管中加入待测样品100μL，混匀后继续水浴下反应5分钟后加入0.5mL终止液(K)。最后在3号试管中加入0.5mL终止液(K)并混匀后加入待测样品100μL。

3)数据测定与计算：用空气调零，在分光光度计上测定各试管中溶液在292nm波长处的吸光值；再以标准曲线各点吸光值对各点尿酸微摩尔数拟合标准曲线；将待测样品吸光值代入标准曲线，通过计算公式得出待测样品蛋白含量。

4、检测结果：

4.1本发明AAP法

标准曲线测得结果如表3，拟合得到的标准曲线方程为y＝86.819x-0.0039。

表3标准曲线

待测样品吸光值平均值与计算得到的样品中尿酸氧化酶含量如表4。

表4样品检测结果

公式中，

酶活单位为：活性单位，U

酶比活性单位为：活性单位每毫克，U/mg

加样体积单位为：微升，μl

蛋白含量单位为：微克每毫升，μg/mL

吸光值、截距和斜率均无单位。

4.2现有尿酸法

标准曲线测得结果如表5，拟合得到的标准曲线方程为y＝1.4734x+0.5105。

表5标准曲线

待测样品吸光值平均值与计算得到的样品中尿酸氧化酶含量如表6。

表6样品检测结果

公式中，

酶比活性单位为：活性单位每毫克，U/mg

加样体积单位为：毫升，mL

蛋白含量单位为：微克每毫升，μg/mL

吸光值和斜率均无单位。

5、结论

从表3-6可以看出，两种方法测得的各采血点的猴血清中聚乙二醇化尿酸氧化酶血药浓度基本一致，所反应的血药浓度随时间的变化趋势也一致。另外，本发明AAP法各采血点平行管之间的吸光值差异明显小于尿酸法，说明AAP法精密度好于尿酸法。

Claims (3)

1.一种检测血清中尿酸氧化酶含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)标准品制备：取已知酶比活性的尿酸氧化酶，用Tris-HCl溶液稀释；

2)标准曲线制作：在试管中加入工作溶液，再加入标准品及空白血清，恒温水浴反应后加入终止液终止，检测吸光值；

3)样品检测：在试管中加入工作溶液，再加入待测样品，恒温水浴反应后加入终止液终止，检测吸光值；

4)数据测定与计算：根据标准品的酶比活性和标准曲线各点中的标准品蛋白含量计算各点标准品酶活性；再以标准曲线各点吸光值对各点标准品酶活性拟合标准曲线；将待测样品吸光值代入标准曲线，通过计算公式得出待测样品蛋白含量；

计算公式如下：

标准品酶活＝标准品酶比活性×标准品加样体积×标准品蛋白含量×10^-6

所述的标准品酶活和待测样品蛋白含量的计算公式中，各参数单位如下：

酶活单位为：活性单位，U

酶比活性单位为：活性单位每毫克，U/mg

加样体积单位为：微升，μl

蛋白含量单位为：微克每毫升，μg/mL

吸光值、截距和斜率均无单位；

所述步骤2)和步骤3)中，工作溶液中含有4-氨基安替比林、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、辣根过氧化物酶、亚铁氰化钾、Triton X-100、抗坏血酸氧化酶和尿酸。

2.根据权利要求1所述的检测血清中尿酸氧化酶含量的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所用Tris-HCl溶液pH值为8.0。

3.根据权利要求1所述的检测血清中尿酸氧化酶含量的方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中，终止液为还原型谷胱甘肽。