CN101676719A - 用分光光度计测定糖化酶活力的方法 - Google Patents

Abstract

一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法，属于生物化学分析领域。用分光光度计来测量由糖化酶水解淀粉产生的葡萄糖与3，5－二硝基水杨酸反应对波长为520nm光的吸收，来确定糖化酶酶活。该方法包括梯度样品的制作、梯度样品吸光度的测定、待测糖化液的制备、空白液制备、酶活力的测定。此方法简单，快速，灵敏度高，准确及时地指导糖化酶工业化生产。

Description

用分光光度计测定糖化酶活力的方法

技术领域

本发明属于生物化学分析领域，具体涉及一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法。

背景技术

葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase EC3.2.1.3)又称γ-淀粉酶，简称糖化酶。主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中，同时也存在于人的唾液、动物胰腺及细菌中。已报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种，细菌有3属3种，用于工业生产的菌株主要是黑曲霉。糖化酶是一种外切型糖苷酶，从淀粉的非还原性末端依次水解a-1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像β-淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a-1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖.糖化酶也能微弱水解a-1，3连接的碳链，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖，因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中，是我国产量最大的酶制剂产品之一。但是，测定糖化酶活性的条件各不相同，我国大多采用终浓度1-1.6％可溶性淀粉为底物，加入酶液后于pH4.5-4.8，40-50℃反应一定时间，用次碘酸盐法测定还原糖含量，以每小时生成1mg葡萄糖所需的酶量，称为一个单位。美国Miles公司糖化酶DIAZYME采用4％淀粉为底物于pH值4.2，60℃反应1h用Schoorl法测定所生成葡萄糖的量，以1h生成1g还原糖作为1个单位(DU)。日本常用SP单位表示糖化酶活性，使用1.1％可溶性淀粉为底物，于pH4.8，55℃反应1h，用Lane-Eynon法定量还原糖，以每小时生成10mg葡萄糖所需酶量为1个单位。所有这些检测方法不仅速度慢，而且操作繁琐，对生产糖化酶过程中的在线测量十分不利，不能及时地指导生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有测定糖化酶活性方法中存在的测量速度慢，操作繁琐的缺点，提供一种测量速度快，操作方便的用分光光度计测定糖化酶活力的方法。

本发明目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的用分光光度计测定糖化酶活力的方法，它是按以下步骤进行的：

(1)梯度样品的制作：称取已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020～0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比色管，分别加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0～2mL的蒸馏水后摇匀40℃水浴预热5～10min；5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比色管中分别加入不同稀释倍数的糖化酶溶液，开始计时，反应25～35min，分别向每个比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；

(2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤(1)得到的反应液稀释20倍，取0.5～2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3～5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程；

(3)待测糖化液的制备：称取0.5～1.5g糖化酶样品，于500mL容量瓶中用pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；加入待测糖化酶溶液1.5～2.5mL，开始计时，反应25～35min，向比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；

(4)空白液制备：于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；向比色管中添加0.2～.5质量浓度为20～25％的NaOH溶液，加入1.5～2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却；

(5)酶活力的测定：分别吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取005～1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3～5min，在520nm处比色，记录吸光度；

(6)测出样品吸光度后，带入步骤(2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。

所用的3，5-二硝基水杨酸溶液的制备方法如下：

(1)甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10％氢氧化钠中，并稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠；

(2)乙液：称取255g酒石酸钠，加到300mL 10％氢氧化钠中，再加入880mL 1％3，5-二硝基水杨酸溶液；

(3)将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7～10天以后使用。

本发明方法的测定原理如下：一定量的淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，用酶活量越高，反应液还原糖越多，利用3，5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，反应液的颜色强度和酶活力呈正比例关系，利用分光光度计比色可以知道样品中的酶活力。

由于3，5-二硝基水杨酸与还原糖显色反应灵敏度高，利用分光光度计进行定量检测，可以快速测量糖化酶酶活，另外该方法操作简便，有利于工业化生产。

附图说明

图1是实施例1中的标准曲线图。

图2是实施例2中的标准曲线图。

图3是实施例3中的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

本发明方法的测定原理如下：一定量的淀粉经糖化酶水解为葡萄糖，用酶活量越高，反应液还原糖越多，利用3，5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，反应液的颜色强度和酶活力呈正比例关系，利用分光光度计比色可以知道样品中的酶活力。

糖化酶水解淀粉反应如下：

(C₆H₁₀O₅)n+nH₂O＝nC₆H₁₂O₆

3，5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖的反应如下：

        黄色                棕红色

在520nm处，3-氨基-5-硝基水杨酸有强吸收，以空白为0点，以确定吸光度。

1.材料与试剂

HH-S₂₄数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器四厂

721可见光分光光度计上海箐华科技仪器有限公司

BS/BT124s分析天平  北京赛多利斯仪器系统有限公司

糖化酶(酶活132600u·g^-1)  河南瑞驰生物科技有限公司生产

化学试剂：均为分析纯

2.试剂的配制

2.1 0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)：称取6.7g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)，吸取冰乙酸2.6mL，用蒸馏水溶解定容至1000mL，上述缓冲溶液应以酸度计校正pH值。

2.2 20％氢氧化钠溶液：称取20g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至100mL。

2.3 2％可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉2.00g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100mL，此溶液需当天配制。

注：可溶性淀粉应符合HG 3-30 95质量标准要求。

2.4 DNS溶液的配制

(1)甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10％氢氧化钠中，并稀释至69毫升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。

(2)乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10％氢氧化钠中，再加入880毫升1％3，5-二硝基水杨酸溶液。

(3)将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7～10天以后使用。

3.测定方法

(1)梯度样品的制作：在分析天平准确称取1.3g已知酶活132600u·g^-1液体糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取6个50mL的比色管，分别加25mL2％的淀粉溶液，5mL0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，用微量移液管取2mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、0mL蒸馏水，摇匀。40℃水浴锅中恒温预热5min。依次加入0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2mL稀释的液体糖化酶到比色管中，立即计时，反应30min。分别向每个比色管中添加0.2mL 20％NaOH，迅速用水冷却，终至酶反应。

(2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取5mL反应液，用蒸馏水定容到100mL，然后取0.5mL稀释的反应液到试管中，加入0.5mL DNS，沸水浴3min。分别向试管中加入8mL蒸馏水，用1cm比色皿，以0mL稀释糖化酶为0.00的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长在520nm，测定各比色管中溶液的吸光度，记录吸光度，结果见表1。以酶活为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图1。

表1.不同酶活力的吸光度

(3)待测酶液的制备：称取1g样品，于500mL的容量瓶中，用乙酸-乙酸鈉缓冲溶液(pH4.6)稀释定容至刻度。

吸取25mL2％的淀粉溶液，置入50mL比色管中，加5mL 0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，于40℃水浴预热5min。准确加入待测酶液2mL，摇匀，立即计时，于40℃水浴锅保温糖化30min，迅速加入0.2mL 20％NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终至酶解反应。

(4)空白液的制备：吸取25mL2％的淀粉溶液，置入50mL比色管中，加5mL0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，于40℃水浴锅中预热5min，再保温30min，迅速加入0.2mL 20％NaOH溶液，加2mL待测酶液，摇匀，迅速用水冷却。

(5)酶活力的测定：吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸馏水定容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸馏水定容至刻度。然后分别取甲、乙容量瓶稀释液0.5mL到甲(糖化液)、乙(空白液)两试管中，各加入0.5mL DNS，共同沸水浴3min。分别向试管中加入8mL蒸馏水，在520nm处比色，记录吸光度。

(6)测出样品吸光度后，在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。

4.计算

4.11g酶液在40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

由不同的酶活力测的吸光度，做出直线，如图1。得到函数式：Y＝0.0309·X

式中：X-酶活力(10⁴u/g)

Y-吸光度

测出样品的吸光度就可以通过公式把酶活力计算出来。

4.2加标回收

用13.2×10⁴u/g标准酶液向样品中加1g标准酶液，溶液，连续平行测量4次，测量结果见表2。

表2糖化酶酶活回收率测量结果

根据表2结果，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收率可保证在95.0％～105.0％范围之间内，相对标准偏差为0.957％，完全符合分析方法中的规定。

3.3对照实验

取13.2×10⁴u/g标准酶液1g，分别用分光光度计法和碘量法进行测量糖化酶酶活力，测量结果见表3。碘量法测量糖化酶酶活力按GB8276-87进行测定。

表3分光光度计法与碘量法实验对照

实验表明，分光光度计法与碘量法的精度相差不大，但分光光度计法比碘量法步骤简单，实验时间短等优点，易于应用在糖化酶企业的在线检测。

实施例2

1.材料与试剂

HH-S₂₄数显恒温水浴锅  金坛市大地自动化仪器四厂

721可见光分光光度计  上海箐华科技仪器有限公司

BS/BT124s分析天平  北京赛多利斯仪器系统有限公司

糖化酶(酶活132600u·g^-1)  河南瑞驰生物科技有限公司生产

化学试剂：均为分析纯

2.试剂的配制

2.1 0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)：称取6.7g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)，吸取冰乙酸2.6mL，用蒸馏水溶解定容至1000mL，上述缓冲溶液应以酸度计校正pH值。

2.2 25％氢氧化钠溶液：称取25g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至100mL。

2.3 1.5％可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉1.50g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100mL，此溶液需当天配制。

注：可溶性淀粉应符合HG 3-30 95质量标准要求。

2.4 DNS溶液的配制

(1)甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10％氢氧化钠中，并稀释至69毫升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。

(2)乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10％氢氧化钠中，再加入880毫升1％3，5-二硝基水杨酸溶液。

(3)将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7～10天以后使用。

3.测定方法

(1)梯度样品的制作：在分析天平准确称取1.5g已知酶活132600u·g^-1液体糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取5个50mL的比色管，分别加20mL2％的淀粉溶液，3mL乙酸-乙酸钠缓冲液，用微量移液管取1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、0mL、蒸馏水，摇匀。40℃水浴锅中恒温预热10min。依次加入0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、稀释的液体糖化酶到比色管中，立即计时，反应25min。分别向每个比色管中添加0.5mL 25％NaOH，迅速用水冷却，终至酶反应。

(2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取5mL反应液，用蒸馏水定容到100mL，然后取2mL稀释的反应液到试管中，加入2mL DNS，沸水浴4min。分别向试管中加入10mL蒸馏水，用1cm比色皿，以0mL稀释糖化酶为0.00的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长在20nm，测定各比色管中溶液的吸光度，记录吸光度，结果见表4。以酶活为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图2。

表4.不同酶活力的吸光度

(3)待测酶液的制备：称取0.5g样品，于500mL的容量瓶中，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)稀释定容至刻度。

吸取20mL2％的淀粉溶液，置入50mL比色管中，加3mL 0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，于40℃水浴预热10min。准确加入待测酶液2mL，摇匀，立即计时，于40℃水浴锅保温糖化25min，迅速加入0.5L 20％NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终至酶解反应。

(4)空白液的制备：吸取20ml 1.5％的淀粉溶液，置入50mL比色管中，加3mL 0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，于40℃水浴锅中预热5min，再保温30min，迅速加入0.5L 20％NaOH溶液，加2mL待测酶液，摇匀，迅速用水冷却。

(5)酶活力的测定：吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸馏水定容至刻度，吸取5mL空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸馏水定容至刻度。然后分别取甲、乙容量瓶稀释液0.5mL到甲(糖化液)、乙(空白液)两试管中，各加入0.5mL DNS，共同沸水浴3min。分别向试管中加入8mL蒸馏水，在520nm处比色，记录吸光度。

(6)测出样品吸光度后，在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。

4.计算

4.11g酶液在40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

由不同的酶活力测的吸光度，做出直线，如图2。得到函数式：Y＝0.0309·X

式中：X-酶活力(10⁴u/g)

Y-吸光度

测出样品的吸光度就可以通过公式把酶活力计算出来。

4.2加标回收

用13.2×10⁴u/g标准酶液向样品中加1g标准酶液，溶液，连续平行测量4次，测量结果见表2。

表5  糖化酶酶活回收率测量结果

根据表2结果，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收率可保证在95.0％～105.0％范围之间内，相对标准偏差为0.733％，完全符合分析方法中的规定。

3.3对照实验

取13.2×10⁴u/g标准酶液1g，分别用分光光度计法和碘量法进行测量糖化酶酶活力，测量结果见表3。碘量法测量糖化酶酶活力按GB8276-87进行测定。

表6分光光度计法与碘量法实验对照

实验表明，分光光度计法与碘量法的精度相差不大，但分光光度计法比碘量法步骤简单，实验时间短等优点，易于应用在糖化酶企业的在线检测。

实施例3

2.材料与试剂

HH-S₂₄数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器四厂

721可见光分光光度计  上海箐华科技仪器有限公司

BS/BT124s分析天平  北京赛多利斯仪器系统有限公司

糖化酶(酶活132600u·g^-1)  河南瑞驰生物科技有限公司生产

化学试剂：均为分析纯

2.试剂的配制

2.1 0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)：称取6.7g乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)，吸取冰乙酸2.6mL，用蒸馏水溶解定容至1000mL，上述缓冲溶液应以酸度计校正pH值。

2.223％氢氧化钠溶液：称取23g分析纯氢氧化钠，用蒸馏水溶解定容至100mL。

2.3 2.5％可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉2.50g，然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却，用蒸馏水定容至100mL，此溶液需当天配制。

注：可溶性淀粉应符合HG 3-30 95质量标准要求。

2.4 DNS溶液的配制

(1)甲液：溶解6.9克结晶酚于15.2毫升10％氢氧化钠中，并稀释至69毫升，在此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。

(2)乙液：称取255克酒石酸钠，加到300毫升10％氢氧化钠中，再加入880毫升1％3，5-二硝基水杨酸溶液。

(3)将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中。在室温下，放置7～10天以后使用。

3.测定方法

(1)梯度样品的制作：在分析天平准确称取1.0g已知酶活132600u·g^-1液体糖化酶，定容到500mL的容量瓶中。取6个50mL的比色管，分别加30mL2％的淀粉溶液，8mL0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，用微量移液管取2mL、1.6mL、1.2mL、0.8mL、0.4mL、0mL蒸馏水，摇匀。40℃水浴锅中恒温预热8min。依次加入0mL、0.4mL、0.8mL、1.2mL、1.6mL、2mL稀释的液体糖化酶到比色管中，立即计时，反应35min。分别向每个比色管中添加0.3mL 25％NaOH，迅速用水冷却，终至酶反应。

(2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取5mL反应液，用蒸馏水定容到100mL，然后取1.5mL稀释的反应液到试管中，加入1.5mL DNS，沸水浴3min。分别向试管中加入8mL蒸馏水，用1cm比色皿，以0mL稀释糖化酶为0.00的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长在520nm，测定各比色管中溶液的吸光度，记录吸光度，结果见表7。以酶活为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，见图3。

表7.不同酶活力的吸光度

(3)待测酶液的制备：称取1.5g样品，于500mL的容量瓶中，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)稀释定容至刻度。

吸取30mL2％的淀粉溶液，置入50mL比色管中，加8mL 0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，于40℃水浴预热5min。准确加入待测酶液2mL，摇匀，立即计时，于40℃水浴锅保温糖化30min，迅速加入0.2mL 20％NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终至酶解反应。

(4)空白液的制备：吸取30mL2％的淀粉溶液，置入50mL比色管中，加8mL0.1mol·L^-1乙酸-乙酸钠缓冲液，于40℃水浴锅中预热5min，再保温30min，迅速加入0.3mL 20％NaOH溶液，加2mL待测酶液，摇匀，迅速用水冷却。

(5)酶活力的测定：吸取5mL糖化液，于100mL容量瓶甲中，用蒸馏水定容至刻度，吸取5Mlp空白液，于100mL容量瓶乙中，用蒸馏水定容至刻度。然后分别取甲、乙容量瓶稀释液0.5mL到甲(糖化液)、乙(空白液)两试管中，各加入0.5mL DNS，共同沸水浴3min。分别向试管中加入8mL蒸馏水，在520nm处比色，记录吸光度。

(6)测出样品吸光度后，在标准曲线上查出对应的糖化酶活力。

4.计算

4.11g酶液在40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

由不同的酶活力测的吸光度，做出直线，如图3。得到函数式：Y＝0.031·X

式中：X-酶活力(10⁴u/g)

Y-吸光度

测出样品的吸光度就可以通过公式把酶活力计算出来。

4.2加标回收

用13.2×10⁴u/g标准酶液向样品中加1g标准酶液，溶液，连续平行测量4次，测量结果见表8。

表8  糖化酶酶活回收率测量结果

根据表2结果，用分光光度法测定糖化酶酶活加标回收率可保证在95.0％～105.0％范围之间内，相对标准偏差为0.823％，完全符合分析方法中的规定。

3.3对照实验

取13.2×10⁴u/g标准酶液1g，分别用分光光度计法和碘量法进行测量糖化酶酶活力，测量结果见表9。碘量法测量糖化酶酶活力按B8276-87进行测定。

表9  分光光度计法与碘量法实验对照

实验表明，分光光度计法与碘量法的精度相差不大，但分光光度计法比碘量法步骤简单，实验时间短等优点，易于应用在糖化酶企业的在线检测。

Claims (2)

1.一种用分光光度计测定糖化酶活力的方法，其特征在于它是按以下步骤进行的：

(1)梯度样品的制作：称取已知酶活的液体糖化酶，定容配制成浓度为0.0020～0.0030g/mL的糖化酶溶液，取至少5个比色管，分别加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，分别加入0～2mL的蒸馏水后摇匀40℃水浴预热5～10min；5个试管中蒸馏水的添加量呈梯度变化，向上述比色管中分别加入糖化酶溶液，开始计时，反应25～35min，分别向每个比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；

(2)梯度样品吸光度的测定：分别吸取步骤(1)得到的反应液稀释20倍，取0.5～2mL稀释的反应液到试管中，加入相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，沸水浴3～5min，在波长在520nm，测定各个溶液的吸光度，以酶活为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到函数方程；

(3)待测糖化液的制备：称取0.5～1.5g糖化酶样品，于500mL容量瓶中用pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲溶液稀释定容，于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；加入待测糖化酶溶液1.5～2.5mL，开始计时，反应25～35min，向比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，摇匀，迅速用水冷却，终止酶反应；

(4)空白液制备：于比色管中加入20～30mL质量浓度为1.5～2.5％的淀粉溶液和3～8mL pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，40℃水浴预热5～10min；向比色管中添加0.2～0.5mL质量浓度为20～25％的NaOH溶液，加入1.5～2.5mL待测糖化酶溶液，摇匀，迅速用水冷却；

(5)酶活力的测定：分别吸取5mL糖化液和5mL空白液，用蒸馏水稀释20倍定容至刻度，然后分别取0.05～1.5mL糖化液、空白液于两个试管中，各加相同体积量的3，5-二硝基水杨酸溶液，共同沸水浴3～5min，在520nm处比色，记录吸光度；

(6)测出样品吸光度后，带入步骤(2)得到的函数方程得到对应的糖化酶活力。

2.根据权利要求1所述的用分光光度计测定糖化酶活力的方法，其特征在于：所用的3，5-二硝基水杨酸溶液的制备方法如下：

(1)甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL10％氢氧化钠中，并稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠；

(2)乙液：称取255g酒石酸钠，加到300mL 10％氢氧化钠中，再加入880mL 1％3，5-二硝基水杨酸溶液；

(3)将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下，放置7～10天以后使用。

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