CN102980856B - 一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羧甲基纤维素酶活力测定方法。经过考察显色剂用量、显色时间、静置时间、羧甲基纤维素钠底物浓度、酶促反应温度、酶促反应时间、酶液稀释度等猴头菌培养物活性成分酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响因素，以及该测定方法的精密度与适应性，最终确立了酸性羧甲基纤维素酶活力的测定方法。本发明具有测定方法简便快速，测定现象清晰明了，测定结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及纤维素酶活力测定方法，具体说是一种羧甲基纤维素酶活力(CMCNa-DNS)的测定方法。
背景技术
纤维素酶(Cellulase)是一种多组分的复合酶，不同来源的纤维素酶其组成及各组分比例有较大差异。一般来讲，纤维素酶包括外切β-1，4-葡聚糖酶(Exop-1，4-glucanase，E C3.2.1.91)、内切β-1，4-葡聚糖酶(Endop-1，4-glucanase，E C3.2.1.4)和纤维二糖酶(Cellobiase，E C3.2.1.21)。不同来源的纤维素酶制剂产品中三种酶组分含量的比例不同，因此其最终的表观酶活力会有差异。同时纤维素酶作用的底物也比较复杂，致使纤维素酶活力的测定方法很多，且方法复杂而不统一。常用的方法有：羧甲基纤维素糖化力法、羧甲基纤维素液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。上述测定方法中，羧甲基纤维素糖化力主要代表外切β-1，4葡聚糖苷酶和内切酶的活力总和，在研究和实际生产中应用比较普遍。
国内外采用羧甲基纤维素糖化法测定纤维素酶活力的方法很多。目前，国际上有较公认的IPUAC推荐的纤维素酶测定方法(T.K.GHOSE，1987)，该方法分别对来自三个厂家(Primfast CL购自杰能科公司，Cellusoft L购自诺维信公司，A5为本公司自主研发产品)纤维素酶进行多次检测，其变异系数达2％以上。造成较大误差 的原因可能是加入的羧甲基纤维素钠浓度高和粘度大，容易在操作过程中带来较大误差，且该方法反应时间为30分钟，利用比色管显色后需稀释用分光光度计检测吸光度值，整个操作繁琐且耗时；另外，该方法DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂配制未经定容，从而造成批次间测定结果存在较大差异。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的测定过程复杂，测定不准确的问题，提供一种新的羧甲基纤维素酶活力的测定方法，采用本发明的方法，测定过程简便快速，测定现象清晰明了，测定结果准确可靠。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，包括如下步骤：
（1）猴头菌培养物溶液的制备：猴头菌培养物经粉碎，过筛，以适量水溶解，振摇2~4小时，滤过，定容。
（2）吸光度测定：精密量取1%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml置具塞刻度试管中，精密加猴头菌培养物溶液0.5ml，混匀，置45~55℃水浴中保温25~35分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5~15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1~2小时，以空白管进行调零，在540nm波长处测定吸光度。空白管加1%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml，置45~55℃水浴中保温25~35分钟，取出，精密加猴头菌培养物溶液0.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5~15分钟，取出，迅速自来水冷却10分 钟，再加水至刻度，摇匀，静置1~2小时。
（3）计算羧甲基纤维素酶活力：从葡萄糖标准曲线上读出猴头菌培养物溶液中还原糖的重量（mg），按照下式计算羧甲基纤维素酶活力：
U=A×1/0.5×n×2
式中 U——每1g含酸性羧甲基纤维素酶活力单位，U/g；
A——吸光度在标准曲线上查得的还原糖重量，mg；
n——样品稀释倍数；
2——时间换算系数。
1g固体酶在50±1℃、pH4.8条件下，1小时水解1%羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量为一个酸性羧甲基纤维素酶活力单位，以U/g表示。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定方法，其中步骤（3）所述的葡萄糖标准曲线测绘方法为：分别精密量取0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0mg/ml的葡萄糖对照品溶液1.5ml，置具塞刻度试管中，各精密加pH4.8柠檬酸盐缓冲液0.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5~15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1~2小时，以相应的试剂为空白，在540nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述具塞刻度试管容积为25ml。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述猴头菌培养物溶液为8~10 mg/ml，且临用新制。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述羧甲基纤维素钠溶液的配置方法是精密称取1.0g羧甲基纤维素钠，置具塞锥形瓶中，精密加入pH4.8柠檬酸盐缓冲液80ml，称定重量，85±5℃边加热边磁力搅拌至完全溶解，放冷，再称定重量，用pH4.8柠檬酸盐缓冲液补足减失的重量，摇匀，以3mol/l盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至4.8，转移至100ml量瓶中，加pH4.8柠檬酸盐缓冲液至刻度，摇匀，即得1%羧甲基纤维素钠溶液。
上述的羧甲基纤维素酶活力的测定，其中上述DNS试剂的配置方法是取结晶酚6.9g，加10%氢氧化钠溶液15ml溶解后，加水稀释至70ml，摇匀，再加入6.9g亚硫酸氢钠，即得DNS甲液。取酒石酸钾钠255g，加10%氢氧化钠溶液300ml溶解后，再加入1%3,5-二硝基水杨酸880ml，摇匀，即得DNS乙液。取上述甲液与乙液混合，摇匀，置玻璃塞的棕色玻瓶中，4℃放置7天后使用。
本发明的测定方法是经过考察显色剂用量、显色时间、静置时间、羧甲基纤维素钠底物浓度、酶促反应温度、酶促反应时间、酶液稀释度等猴头菌培养物活性成分酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响因素，以及该测定方法的精密度与适应性，最终确立的酸性羧甲基纤维素酶活力的测定方法。采用本发明进行酸性羧甲基纤维素酶活力的测定，测定方法简便快速，测定现象清晰明了，测定结果准确可靠。
显色剂DNS试剂用量对吸光度测定的影响：精密量取0.5mg/ml葡萄糖标准溶液1.5ml置25 ml具塞刻度试管中，精密加入pH4.8柠檬酸盐缓冲液0.5ml及不同体积的DNS试剂，摇匀，置沸水浴中保温30分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1.5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表1、图1所示。
表1显色剂用量对吸光度测定的影响
结果表明，当显色剂DNS试剂用量小于1.5ml时，吸光度随显色剂用量的增加而增大，当显色剂用量大于1.5ml时，吸光度则基本保持不变。因此，显色剂DNS试剂的最适用量为1.5ml。
显色时间对吸光度测定的影响：精密量取0.5mg/ml葡萄糖标准溶液1.5ml置25 ml具塞刻度试管中，精密加入pH4.8柠檬酸盐缓冲液0.5ml及DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温不同时间，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1.5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表2、图2所示。
表2显色时间对吸光度测定的影响
结果表明，随沸水浴显色时间的延长，吸光度变大，但在15分钟之后，吸光度较稳定。因此，沸水浴显色时间确定为15分钟。
静置时间对吸光度测定的影响：精密量取葡萄糖标准溶液1.5ml置25 ml具塞刻度试管中，精密加入pH4.8柠檬酸盐缓冲液0.5ml及DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来 水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，立即在540nm波长处进行时间程序扫描3小时，结果如图3所示。
结果表明，当静置时间小于1.5小时时，随静置时间的增加，吸光度逐渐增加；当静置时间大于2.0小时时，随静置时间的增加，吸光度逐渐减小；静置时间在1.5~2.0小时时，吸光度基本保持不变。因此，静置1.5小时后在540nm波长处测定吸光度。
羧甲基纤维素钠底物浓度对酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响：精密量取以pH4.8柠檬酸盐缓冲液配置的浓度依次为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的羧甲基纤维素钠底物溶液各1.5ml，置25ml具塞刻度试管中，样品管精密加入纤维素酶液0.5ml，空白管精密加入水0.5ml，混匀，同时置50℃水浴中保温30分钟，取出，均立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1.5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表3、图4所示。
表3羧甲基纤维素钠底物浓度对酶活力测定的影响
结果表明，随羧甲基纤维素钠底物浓度的增大，酶活力测定结果也逐渐增加，当其浓度达到1.0%时，酸性羧甲基纤维素酶活力基本趋于平缓。因此，选择1.0%羧甲基纤维素钠底物浓度进行酶活力的测定。
酶促反应温度对酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响：精密量取1.0%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml置25ml具塞刻度试管中，样品管精 密加入纤维素酶液0.5ml，空白管精密加入水0.5ml，混匀，于不同温度水浴中保温30分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1.5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表4、图5所示。
表4酶促反应温度对酶活力测定的影响
结果表明，当酶促反应温度为50℃时，酸性羧甲基纤维素酶活力最高，即50℃为该酶的最适酶解温度。
酶促反应时间对酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响：精密量取1.0%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml置25ml具塞刻度试管中，样品管精密加入纤维素酶液0.5ml，空白管精密加入水0.5ml，混匀，置50℃水浴中保温不同时间，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1.5小时，在540nm波长处测定吸光度，结果如表5、图6所示。
表5酶促反应时间对酶活力测定的影响
结果表明，当酶促反应时间低于30分钟时，随着酶促反应时间的增加，酸性羧甲基纤维素酶活力呈明显增强趋势；当酶促反应时间超过30分钟时，酸性羧甲基纤维素酶活力基本保持不变。因此，选择酶促反应时间为30分钟。
酶液稀释度对酸性羧甲基纤维素酶活力测定的影响：精密量取1.0%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml置25ml具塞刻度试管中，样品管精密加入不同浓度的纤维素酶液0.5ml，混匀，置50℃水浴中保温30分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1.5小时，在540nm波长处测定吸光度。空白管精密加入1.0%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml，置50℃水浴中保温30分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，相应浓度的纤维素酶液0.5ml，摇匀，自“置沸水浴中保温15分钟”起，依法进行。结果如表6所示。
表6酶液稀释度对酶活力的影响
结果表明，酸性羧甲基纤维素酶活力随酶液稀释度的降低而减小。因此，测定时，应规定合适的稀释度范围，既使空白溶液的吸光度符合药典规定，又充分发挥酸性羧甲基纤维素酶的活力。所以，最终确立酶液的稀释度为100。
附图说明
图1为本发明所述的羧甲基纤维素酶活力测定方法中显色剂用量对酶活力测定吸光度的影响。
图2为本发明所述的羧甲基纤维素酶活力测定方法中显色时间对酶活力测定吸光度的影响。
图3为本发明所述的羧甲基纤维素酶活力测定方法中静置时间对酶活力测定吸光度的影响。
图4为本发明所述的羧甲基纤维素酶活力测定方法中羧甲基纤维素钠底物浓度对酶活力测定吸光度的影响。
图5为本发明所述的羧甲基纤维素酶活力测定方法中酶促反应温度对酶活力测定吸光度的影响。
图6为本发明所述的羧甲基纤维素酶活力测定方法中酶促反应时间对酶活力测定吸光度的影响。
具体实施方式
实施例1
我们采用如下方法制备猴头菌培养物：
1、无菌培养：猴头菌培养物通过培养基灭菌，10万级洁净区内接种、无菌条件下培养45天，温度为25℃，防止污染；
2、二次培养：一次培养掏瓶后即得猴头菌培养物，再转入塑料袋中在培养室培养7天，培养温度为25℃，取出；
3、低温干燥：在温度为45℃的条件下，采用真空低温连续干燥技术干燥；
4、低温灭菌：在温度为45℃的条件下灭菌，采取紫外灭菌的方式灭菌。
对照品溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含1mg的溶液，即得。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml、10.0ml，分别置10ml容量瓶中，各加水至刻度，摇匀。分别精密量取上述溶液1.5ml，置25ml具塞刻度试管中，各精密加pH4.8柠檬酸盐缓冲液0.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1.5小时，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录V A），在540nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备：取猴头菌培养物或者二次猴头菌培养物（过二号筛）约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水200ml，密塞，称定重量，振摇3小时，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，即得。本液应临用新制。
测定法：精密量取1%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml置25ml具塞刻度试管中，精密加供试品溶液0.5ml，混匀，置50℃水浴中保温30分钟，取出，照标准曲线的制备项下的方法，自“立即精密加入DNS试剂1.5ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中还原糖的重量（mg）。空白管加1%羧甲基纤维素钠溶液1.5ml，置50℃水浴中保温30分钟，取出，精密加供试品溶液0.5ml，混匀，照标准曲线的制备项下的方法，自“立即精密加入DNS试剂1.5ml”起，依法进行。按下式计算：
U=A×1/0.5×n×2
式中 U——每1g含酸性羧甲基纤维素酶活力单位，U/g；
A——吸光度在标准曲线上查得的还原糖重量，mg；
n——样品稀释倍数；
2——时间换算系数。
1g固体酶在50±1℃、pH4.8条件下，1小时水解1%羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量为一个酸性羧甲基纤维素酶活力单位，以U/g表示。
所得结果如下：
表7 猴头菌培养物与二次猴头菌培养物的羧甲基纤维素酶活力比较
Claims (1)
1.一种羧甲基纤维素酶活力的测定方法，包括如下步骤：
(1)猴头菌培养物溶液的制备：猴头菌培养物经粉碎，过筛，以适量水溶解，振摇2-4小时，滤过，定容；
(2)吸光度测定：精密量取1％羧甲基纤维素钠溶液1.5ml置具塞刻度试管中，精密加猴头菌培养物溶液0.5ml，混匀，置50℃水浴中保温30分钟，取出，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5～15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1～2小时，以空白管进行调零，在540nm波长处测定吸光度；空白管加1％羧甲基纤维素钠溶液1.5ml，置50℃水浴中保温30分钟，取出，精密加猴头菌培养物溶液0.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5～15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1～2小时；
(3)计算羧甲基纤维素酶活力：从葡萄糖标准曲线上读出猴头菌培养物溶液中还原糖的质量，按照下式计算羧甲基纤维素酶活力：
U＝A×1/0.5×n×2
式中U——每1g含酸性羧甲基纤维素酶活力单位，U/g；
A——吸光度在标准曲线上查得的还原糖质量，mg；
n——样品稀释倍数；
2——时间换算系数；
1g固体酶在50±1℃、pH4.8条件下，1小时水解1％羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1mg葡萄糖的还原糖量为一个酸性羧甲基纤维素酶活力单位，以U/g表示；
上述步骤(3)所述的葡萄糖标准曲线测绘方法为：分别精密量取0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的葡萄糖对照品溶液1.5ml，置具塞刻度试管中，各精密加pH4.8柠檬酸盐缓冲液0.5ml，混匀，立即精密加入DNS试剂1.5ml，摇匀，置沸水浴中保温5～15分钟，取出，迅速自来水冷却10分钟，再加水至刻度，摇匀，静置1～2小时，以相应的试剂为空白，在540nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线；
上述猴头菌培养物溶液为8～10mg/ml，且临用新制；
上述具塞刻度试管容积为25ml；
上述羧甲基纤维素钠溶液的配置方法是精密称取1.0g羧甲基纤维素钠，置具塞锥形瓶中，精密加入pH4.8柠檬酸盐缓冲液80ml，称定重量，85±5℃边加热边磁力搅拌至完全溶解，放冷，再称定重量，用pH4.8柠檬酸盐缓冲液补足减失的重量，摇匀，以3mol/l盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至4.8，转移至100ml量瓶中，加pH4.8柠檬酸盐缓冲液至刻度，摇匀，即得1％羧甲基纤维素钠溶液；
上述DNS试剂的配置方法是取结晶酚6.9g，加10％氢氧化钠溶液15ml溶解后，加水稀释至70ml，摇匀，再加入6.9g亚硫酸氢钠，即得DNS甲液；取酒石酸钾钠255g，加10％氢氧化钠溶液300ml溶解后，再加入1％3,5-二硝基水杨酸880ml，摇匀，即得DNS乙液；取上述甲液与乙液混合，摇匀，置玻璃塞的棕色玻瓶中，4℃放置7天后使用。
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| 3种食用菌菌糠纤维素酶和木聚糖酶部分酶学性质;马怀良等;《安徽农业科学》;20101231;第38卷(第28期);第15479-15480页 * |
| 中华人民共和国国家发展和改革委员会.羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS)测定方法.《中华人民共和国轻工行业标准 QB2583-2003 纤维素酶制剂》.2003, * |
| 亚硒酸钠对猴头菌生长的影响;何冬兰等;《湖北农业科学》;20050831(第04期);第77-78页 * |
| 猴头菌降解木质纤维素的研究;王玉万等;《河北大学学报(自然科学版)》;19890228(第01期);第34-38页 * |
| 高效降解纤维素菌株的筛选与鉴定;王希国等;《黑龙江畜牧兽医》;20070831(第08期);第70-71页，尤其是第70页右栏1.4.2节 * |
| 黑木耳原种胞外酶活性的研究;韩增华等;《生物技术》;20091031;第19卷(第05期);第14-16页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102980856A (zh) | 2013-03-20 |
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