CN104807764A - 碱性木聚糖酶活力测定的方法 - Google Patents

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杨仁党
杨飞
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Abstract

本发明公开了一种碱性木聚糖酶活力测定的方法，属于木聚糖酶活力测定领域。所述方法包括以下步骤：配制pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，并在此基础上配制木糖标准溶液、木聚糖标准溶液及碱性木聚糖酶样品；制作木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线；在pH＝7.8的碱性环境下，用待测碱性木聚糖酶水解木聚糖，并检测水解得到的木糖的吸光度AE；同时设置不加碱性木聚糖酶的空白对照组，并测其吸光度AB；将所测水解得到的木糖的吸光度值用标准曲线对应获得所述水解产物木糖的含量；根据公式计算出碱性木聚糖酶活力。本发明针对碱性木聚糖酶活力测定方法进行了改进，解决了现有检测方法不能客观地反应碱性木聚糖酶的活力的问题。

Description

碱性木聚糖酶活力测定的方法
技术领域
本发明属于木聚糖酶活力测定领域，具体涉及一种碱性木聚糖酶活力测定的方法。
背景技术
木聚糖酶是可将木聚糖降解为单糖和寡糖的水解酶。一直以来，其在造纸、食品、饲料、能源等工业都有着较为重大的应用价值，因而引起科研工作者的广泛关注，并对其进行了相关研究。酶活力是衡量酶生物活力的重要指标。对于木聚糖酶活力的测定，已有既定的国家标准GB 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，然而该标准是在37℃、pH为5.50的条件下来进行测定。而对于很多工业而言，碱性的环境使得木聚糖酶的使用并非十分便利。随着对木聚糖酶的研究和发展，新型的碱性木聚糖酶正在相关行业中崭露头角。由于传统的木聚糖酶活力测定方法是酸性方法，对于碱性木聚糖酶而言，酸性木聚糖酶的检测条件和方法已经有所不足。酸性条件下的碱性木聚糖酶活力不是最佳，并且会对碱性木聚糖酶活力造成降低，从而对碱性木聚糖酶的活力表示偏差很大。传统的测定方法已经无法再客观地反应碱性木聚糖酶的活力，新的方法亟待出现。
发明内容
本发明针对已有的技术的不足，提供一种碱性木聚糖酶活力测定的方法，该方法能够更为客观地反应碱性木聚糖酶的活力。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
碱性木聚糖酶活力测定的方法，包括如下步骤：
(1)依据碱性木聚糖酶的特性，配制pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，并在此基础上配制木糖标准溶液、木聚糖标准溶液及待测碱性木聚糖酶样品；
(2)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线，其斜率为K，截距为C0；
(3)在pH＝7.8的碱性环境下，用步骤(1)中待测碱性木聚糖酶样品水解木聚糖为木糖，记录酶解反应时间t，并用紫外分光光度法检测水解得到的木糖的吸光度AE；同时设置不加碱性木聚糖酶的空白对照组，并测其吸光度AB；
(4)根据以下公式计算出碱性木聚糖酶活力XD：
       X D = [ ( A E - A B ) × K + C 0 ] M × t × 1000
式中：
XD——稀释酶液中木聚糖酶的活力，U·mL-1；
AE——酶反应液的吸光度；
AB——酶空白样的吸光度；
K——标准曲线的斜率；
C0——标准曲线的截距；
M——木糖的摩尔质量，M(C5H10O5)＝150.2g·mol-1；
t——酶解反应时间，min；
1000——转化因子，1mmol＝1000μmol。
步骤(1)所述pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液的配制过程如下：取磷酸氢二钠35.90g，加水溶解，并稀释至500mL，得到甲液；取磷酸二氢钠2.76g，加水溶解，并稀释至100mL，得到乙液；取91.5mL甲液与8.5mL乙液混合，摇匀，即得所述pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液；
所述木糖标准溶液的配制过程如下：称取无水木糖1.000g，加pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解，定容至100mL，即得所述木糖标准溶液；
所述木聚糖标准溶液的配制过程如下：在50℃下，称取木聚糖1.0000g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时加热，直至木聚糖完全溶解；然后停止加热，继续搅拌30min，加入1.18g磷酸氢二钠；继续磁力搅拌，同时测定其pH；如果pH为7.80，用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，如果pH偏离7.80，再用甲液或乙液调节至7.80，然后再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，得到所述木聚糖标准溶液。
所述碱性木聚糖酶样品的反应用酶液配制过程如下：
碱性木聚糖酶样品为固体样品的反应用酶液制备过程为：称样量称取试样两份，精确至0.001g，加入40mL pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，磁力搅拌30min，再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，在4℃条件下避光保存1h～2h；上离心机1000g离心3min～5min，取上清液，再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液做适当稀释，稀释后的待测酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04U·mL-1～0.10U·mL-1之间；
碱性木聚糖酶样品为液体样品的反应用酶液制备过程为：液体样品可以直接用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液进行稀释、定容，稀释后的酶液中木聚糖酶活力最好能控制在0.04U·mL-1～0.10U·mL-1之间；如果稀释后酶液的pH偏离7.80，需要用步骤(1)中甲液或乙液调节校正至7.80，然后再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液做适当稀释定容。
步骤(2)所述制作木糖吸光度-木糖浓度标准曲线时，吸取步骤(1)配制的pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液4.00mL，加入DNS试剂5.00mL，沸水浴加热5min，冷却至室温，用水定容至25.00mL，制成标准空白样。
步骤(3)测定酶活力的过程中，整个液体环境保持在50℃、pH＝7.80条件下。可用配制pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液的甲液或乙液调节至该条件下。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明提供了一种新型的碱性木聚糖酶活力的测定方法，该方法能够更为客观地反应碱性木聚糖酶的活力。
附图说明
图1为实施例1的木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
里氏木霉ATCC56765培养发酵产生的碱性木聚糖酶活力的测定，步骤如下：
(1)将里氏木霉ATCC56765培养发酵产生的粗酶液8000r/min条件下离心5min，取碱性木聚糖酶上清液待测；
称取无水木糖1.000g，加pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解，定容至100mL，得木糖标准溶液；
在50℃下，称取木聚糖1.0000g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时加热，直至木聚糖完全溶解；然后停止加热，继续搅拌30min，加入1.18g磷酸氢二钠；继续磁力搅拌，同时测定其pH；如果pH为7.80，用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，如果pH偏离7.80，再用甲液或乙液调节至7.80，然后再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，得到木聚糖标准溶液；
(2)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线，如图1所示，其斜率K＝1.15，截距C0＝-0.087；
(3)在pH＝7.8的碱性环境下，取步骤(1)中待测碱性木聚糖酶上清液稀释1000倍，并用来水解木聚糖。用紫外分光光度计在λ＝540nnm检测水解得到的木糖的吸光度AE，不加碱性木聚糖酶的组作为空白对照，测其吸光度AB，其结果如表1；
(4)根据以下公式计算碱性木聚糖酶的活力：计算结果如表1所示，平行测定3次，取平均值。
表1碱性木聚糖酶活力测定吸光度值
      
Df为试样的稀释倍数。
由表1的数据可知，该碱性木聚糖酶粗酶液的活力为80.30U/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)依据碱性木聚糖酶的特性，配制pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，并在此基础上配制木糖标准溶液、木聚糖标准溶液及待测碱性木聚糖酶样品；
(2)制作木糖吸光度-木糖浓度的标准曲线，其斜率为K，截距为C0；
(3)在pH＝7.8的碱性环境下，用步骤(1)中待测碱性木聚糖酶样品水解木聚糖为木糖，记录酶解反应时间t，并用紫外分光光度法检测水解得到的木糖的吸光度AE；同时设置不加碱性木聚糖酶的空白对照组，并测其吸光度AB；
(4)根据以下公式计算出碱性木聚糖酶活力XD：
X D = [ ( A E - A B ) × K + C 0 ] M × t × 1000
式中：
XD——稀释酶液中木聚糖酶的活力，U·mL-1；
AE——酶反应液的吸光度；
AB——酶空白样的吸光度；
K——标准曲线的斜率；
C0——标准曲线的截距；
M——木糖的摩尔质量，M(C5H10O5)＝150.2g·mol-1；
t——酶解反应时间，min；
1000——转化因子，1mmol＝1000μmol。
2.根据权利要求1所述的碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，步骤(1)所述pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液的配制过程如下：取磷酸氢二钠35.90g，加水溶解，并稀释至500mL，得到甲液；取磷酸二氢钠2.76g，加水溶解，并稀释至100mL，得到乙液；取91.5mL甲液与8.5mL乙液混合，摇匀，即得所述pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液；
步骤(1)所述木糖标准溶液的配制过程如下：称取无水木糖1.000g，加pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解，定容至100mL，即得所述木糖标准溶液；
步骤(1)所述木聚糖标准溶液的配制过程如下：在50℃下，称取木聚糖1.0000g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时加热，直至木聚糖完全溶解；然后停止加热，继续搅拌30min，加入1.18g磷酸氢二钠；继续磁力搅拌，同时测定其pH；如果pH为7.80，用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，如果pH偏离7.80，再用甲液或乙液调节至7.80，然后再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，得到所述木聚糖标准溶液；
步骤(1)所述碱性木聚糖酶样品的反应用酶液配制过程如下：
碱性木聚糖酶样品为固体样品的反应用酶液制备过程为：称样量称取试样两份，精确至0.001g，加入40mL pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，磁力搅拌30min，再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液定容至100mL，在4℃条件下避光保存1h～2h，上离心机1000g离心3min～5min，取上清液，再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液做适当稀释，稀释后的待测酶液中木聚糖酶活力控制在0.04U·mL-1～0.10U·mL-1之间；
碱性木聚糖酶样品为液体样品的反应用酶液制备过程为：液体样品直接用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液进行稀释、定容，稀释后的酶液中木聚糖酶活力控制在0.04U·mL-1～0.10U·mL-1之间；如果稀释后酶液的pH偏离7.80，需要用甲液或乙液调节校正至7.80，然后再用pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液做适当稀释定容。
3.根据权利要求1所述的碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，步骤(2)所述制作木糖吸光度-木糖浓度标准曲线时，吸取步骤(1)配制的pH＝7.8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液4.00mL，加入DNS试剂5.00mL，沸水浴加热5min，冷却至室温，用水定容至25.00mL，制成标准空白样。
4.根据权利要求1所述的碱性木聚糖酶活力测定的方法，其特征在于，步骤(3)测定酶活力的过程中，整个液体环境保持在50℃、pH＝7.80条件下。
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