CN111334556B - 一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶或有机磷农药的比色检测方法 - Google Patents
一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶或有机磷农药的比色检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，包括：采用NaAc‑HAc缓冲溶液配制ACP溶液和AAP溶液，将多个不同浓度的ACP溶液与AAP溶液、MnO2纳米片、ABTS混合；在420nm波长处测定紫外吸光度A、A0，测得吸光度差值ΔA，获得ACP浓度与吸光度差值ΔA的线性关系；根据线性关系与待测样品吸光度差值ΔA，得到待测样品ACP的浓度。本发明还公开了一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的比色检测方法，在酸性磷酸酶的比色检测方法的基础上，加入有机磷农药。本发明对酸性磷酸酶和有机磷农药进行比色，具有简易、高灵敏、低成本、高通量检测的优势。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶或有机磷农药的比色检测方法，更具体地，涉及一种基于二氧化锰的生物模拟氧化酶活性，用于酸性磷酸酶以及有机磷农药的检测。
背景技术
酸性磷酸酶(ACP)是一种普遍存在的多功能酶，主要分布于哺乳动物的血液和组织中，在弱酸性条件下可以水解有机磷化合物的磷酸酯键。酸性磷酸酶作为一种磷酸单酯酶，它在调节细胞内各种生理变化中起着重要的作用。同时，大量研究指出，ACP的非正常表达与活化，与许多人类疾病存在关联性，包括甲状旁腺功能亢进、转移性前列腺癌、戈谢氏病、血栓性静脉炎以及与肾脏、静脉、骨骼等相关的疾病。因此，ACP被认为是一种重要的生物标志物和相关疾病的预后指标。此外，一些ACPs亚型如2C4型磷脂酸酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)被认为是潜在的药物靶点。因此，开发简便、灵敏、高选择性的ACP检测方法对临床诊断和药物筛选具有重要意义。近年来，人们探索了几种检测ACP的方法，包括分光光度法如荧光法和比色法、高效液相色谱法、表面声波传感器和电化学方法等。上述方法虽然能有效地定量检测ACP，但大多需要繁琐的样品制备、昂贵的信号标记和复杂的仪器操作。因此，建立一种简便灵敏的ACP定量检测体系成为目前生化分析和临床诊断的热点。
有机磷农药作为一类重要的农药，对环境和农产品会产生有害的影响，继而对生态系统造成危害。此外，有机磷农药还会通过食物中的残留逐渐积累在体内，以及通过皮肤、呼吸道、嗅吸等途径对人体产生危害。Fariba等人比较了长期接触农药的农民与普通人之间的毒理学代谢指标，用于研究有机磷农药对人体的作用，结果显示，长期接触有机磷农药可能会抑制乙酰胆碱酯酶的活性继而导致中枢神经系统毒性，伴随着DNA氧化损伤和抑制免疫系统。因此，采用高灵敏度、高选择性、可靠的测定方法对有机磷农药浓度进行监测具有重要意义。根据以往的报道，有机磷酸酯(Ops)可以有效的抑制ACP的催化能力，从而通过此途径对其进行分析和检测。
纳米酶因其与天然酶相媲美的高催化活性，且具有稳定性好、易合成、易修饰等优点而受到越来越多的关注。二氧化锰纳米片(MnO2nanosheets)是一种具有生物模拟氧化酶活性的二维纳米材料。具有皱褶二维平面结构的MnO2纳米片与其他金属纳米酶相比，具有更高的摩尔消光系数(9.6×103M-1·cm-1)、高比表面积、易于制备/修饰、良好的生物相容性和水溶性等优点。因此，它已成功地应用于电池、磁共振成像、传感、药物传递、催化和超级电容器等领域。
综上所述，实现简便，快速、灵敏检测酸性磷酸酶和有机磷农药是现在研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有酸性磷酸酶检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，提供一种基于二氧化锰生物模拟氧化酶活性建立的比色传感体系。在该比色传感体系中，底物2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)在二氧化锰纳米片的作用下由无色变为深绿色，在体系中加入抗坏血酸(AA)后，二氧化锰纳米片被分解成锰离子(Mn2+)，继而失去其生物模拟氧化酶活性，ABTS不会出现由无色到绿色的颜色变化。酸性磷酸酶(ACP)可以催化底物维生素C磷酸酯(AAP)转变为AA，故同样适用于本比色传感体系。此外，有机磷农药可以有效抑制ACP的活性，使其不能催化AAP产生AA使二氧化锰纳米片分解，所以也可通过本比色传感体系进行定性或定量的检测。综上，本发明成功构建了酸性磷酸酶或有机磷农药的比色传感体系(原理见图1)。原理验证见图2，当体系中只存在ABTS，无紫外吸收峰，溶液呈无色，仅存在MnO2纳米片时，溶液呈浅棕色，当上述两溶液混合时，在420nm处有强紫外吸收峰存在，溶液呈深绿色，这是因为MnO2纳米片具有生物模拟酶活性，可以使显色底物ABTS出现相应变化。在ABTS+MnO2纳米片体系中加入AA后，绿色褪去。在ABTS+MnO2纳米片体系中加入AAP，溶液仍呈深绿色。在ABTS+MnO2纳米片体系中加入AAP和ACP，绿色褪去，产生的变化与加入AA基本相似，这是由于AA可以使MnO2纳米片分解成Mn2+，失去生物模拟氧化酶活性引起的。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，包括如下步骤：
步骤(a)、采用NaAc-HAc缓冲溶液配制ACP溶液和AAP溶液，将多个不同浓度的ACP溶液与其底物AAP溶液混合并孵育；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，进行孵育反应；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合体系中加入显色底物ABTS溶液，进行孵育反应，获得比色传感体系；
步骤(d)、在420nm波长处测定样品的紫外吸光度A；测定没有目标物ACP时，反应体系在420nm波长处的吸光度A0；利用测得的A0与A的吸光度差值ΔA，获得ACP浓度与吸光度差值ΔA的线性关系；
步骤(e)、根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品的吸光度差值ΔA，得到待测样品中ACP的浓度。
所述的比色传感体系中，AAP的浓度为1mM；ACP的浓度为0.075～3mU·mL-1；MnO2纳米片的浓度为0.015～0.15mg·mL-1，优选为0.075mg·mL-1；ABTS的浓度为2.5～10mM，优选为2.5mM。
步骤(a)中，所述的NaAc-HAc缓冲溶液为0.2mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液。
所述的孵育为在36～38℃下孵育5～30min，优选为在37℃下孵育20min。
步骤(b)中，所述的孵育为在36～38℃下孵育5～15min，优选为在37℃下孵育10min。
所述的MnO2纳米片可根据本领域公知的方法制得。具体步骤如下：将50mg高锰酸钾溶于45mL超纯水中，室温下搅拌1h，然后缓慢加入15mg N,N,N-三甲基1-十六烷基溴化铵(CTAB)，匀速缓慢搅拌，直至形成稳定的乳状液；随后，逐滴加入5mL 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲溶液(0.1M,pH 6.0)，所得棕黑色溶液在室温下匀速搅拌过夜；最后，用超纯水溶液离心洗涤多次，直至上清液澄清，得到MnO2纳米片，真空干燥定量，用超纯水溶解超声，得到MnO2纳米片溶液。
所述的MnO2纳米片也可以使用现有技术，如Journal of the American ChemicalSociety,2008,130(47)：15938-15943中记载的方法进行制备。
所述的MnO2纳米片溶液采用超纯水溶解超声配制而成。
步骤(c)中，所述的孵育为在36～38℃下孵育5～60min，优选为在37℃下孵育50min。
步骤(d)中，测定吸光度的方法为：将样品放置紫外可见分光光度计后进行200～800nm全波长扫描，扫描速度为1200nm/min，光电倍增管电压为750V，狭缝宽度为5nm，测定420nm处的吸光度值A或A0。
步骤(e)中，所述的待测样品的吸光度差值ΔA按照步骤(a)-步骤(d)获得。
具体的，所述的待测样品的吸光度差值ΔA由以下方法获得：采用0.2mol·L-1、pH4.6的NaAc-HAc缓冲溶液或pH 7的磷酸盐缓冲液配制待测样品溶液，采用0.2mol·L-1、pH4.6的NaAc-HAc缓冲溶液配制AAP溶液，将待测样品溶液和AAP溶液混合，在37℃下孵育20min；往孵育后的混合体系加入MnO2纳米片，在37℃下孵育10min；再加入ABTS，37℃下孵育50min，比色传感体系中AAP的浓度为1mM，MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，ABTS的浓度为2.5mM；在420nm波长处测定待测样品的紫外吸光度A、不含目标物ACP的混合体系的吸光度A0；利用测得的A0与A获得待测样品的吸光度差值ΔA。
本发明所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法在检测食物样本、水样、血液或除血液外的生物样本中ACP含量的应用。
本发明的另一个目的是在前述的酸性磷酸酶的比色检测方法的基础上，提供一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的比色检测方法，包括以下步骤：
步骤(a)、采用NaAc-HAc缓冲溶液配制有机磷农药溶液、ACP溶液和AAP溶液；将不同浓度的有机磷农药溶液与ACP溶液混合并孵育；将有机磷农药和ACP的混合体系与AAP溶液混合并孵育；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，进行孵育反应；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合体系中加入显色底物ABTS溶液，进行孵育反应，获得比色传感体系；
步骤(d)、在420nm波长处测定样品的紫外吸光度A；测定没有有机磷农药时，反应体系在420nm波长处的吸光度A0；利用测得的A0与A的吸光度差值ΔA，获得有机磷农药浓度与吸光度差值ΔA的线性关系；
步骤(e)、根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品的吸光度差值ΔA，得到待测样品中有机磷农药的浓度。
所述的有机磷农药为对硫磷、内吸磷、甲拌磷、甲基对硫磷(PM)、敌敌畏等中的至少一种，上述有机磷农药通过抑制乙酰胆碱酯酶，使乙酰胆碱积聚，引起毒蕈碱样症状、烟碱样症状以及中枢神经系统症状，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。
优选的，所述的有机磷农药为甲基对硫磷。
步骤(a)中，有机磷农药和ACP的孵育为在37℃下孵育10min。
所述的比色传感体系中，有机磷农药的浓度为0.05～3μg·mL-1；ACP的浓度为3mU·mL-1；AAP的浓度为1mM；MnO2纳米片的浓度为0.015～0.15mg·mL-1，优选为0.075mg·mL-1；ABTS的浓度为2.5～10mM，优选为2.5mM。
步骤(e)中，所述的待测样品的吸光度差值ΔA按照步骤(a)-步骤(d)获得。
具体的，所述的待测样品的吸光度差值ΔA由以下方法获得：采用0.2mol·L-1、pH4.6的NaAc-HAc缓冲溶液或pH 7的磷酸盐缓冲液配制待测样品溶液，采用0.2mol·L-1、pH4.6的NaAc-HAc缓冲溶液配制ACP溶液、AAP溶液，将待测样品溶液与ACP溶液混合，在37℃下孵育10min；将待测样品溶液和ACP的混合体系与AAP溶液混合，在37℃下孵育20min；往孵育后的混合体系加入MnO2纳米片，在37℃下孵育10min；再加入ABTS，37℃下孵育50min，比色传感体系中ACP的浓度为3mU·mL-1，AAP的浓度为1mM，MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，ABTS的浓度为2.5mM；在420nm波长处测定待测样品的紫外吸光度A、不含待测样品的混合体系的吸光度A0；利用测得的A0与A获得待测样品的吸光度差值ΔA。
本发明所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的比色检测方法在检测食物样本、水样、血液或除血液外的生物样本中有机磷农药含量的应用。
本发明所述的待测样品为食物样本、水样、血液或除血液外的生物样本。所述的待测样品为食物样本或水样时，采用0.2mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液配制待测样品溶液；所述的待测样品为血液或除血液外的生物样本时，采用pH 7的磷酸盐缓冲液配制待测样品溶液。
本发明的有益效果：
1)、本发明方法采用MnO2纳米片作为生物模拟氧化酶，用于ACP的比色检测。这种比色传感平台与常用的色谱光谱法相比，具有低成本、操作简便快捷、不需要复杂昂贵仪器的优点。
2)、本发明基于MnO2纳米片生物模拟氧化酶活性，成功将MnO2纳米片用于构建比色传感平台并用于有机磷农药的检测。与已有的基于同一机理的文献报道相比，本发明的检测灵敏度与其相似，但操作简易，实际使用方便。并且，本发明方法不需要复杂的仪器设备，只需要简单的加样就能在均相溶液中检测有机磷农药。可以用于坏境和农药样品的定量检测，具有良好的回收率。
3)、与现有技术相比，本发明对酸性磷酸酶和有机磷农药进行比色，具有简易、高灵敏、低成本、高通量检测的优势，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是基于MnO2纳米片生物模拟氧化酶活性建立的比色传感方法用于检测酸性磷酸酶ACP和有机磷农药-PM的原理图。
图2A是基于MnO2纳米片生物模拟氧化酶用于ACP检测的紫外光谱原理图；图2B是相对应的颜色变化图。管a对应纯ABTS溶液，为无色；管b为MnO2纳米片，为浅棕色；管c为ABTS+MnO2纳米片溶液，颜色呈深绿色；管d在管c基础上加入AA，绿色褪去呈无色；管e在管c基础上加入AAP，颜色仍呈深绿色；管f在管e基础上加入ACP，绿色褪去，呈无色
图3是对ACP反应条件的优化结果；其中，图3A是MnO2纳米片浓度对ΔA的影响；图3B是AAP与ACP孵育时间对ΔA的影响；图3C是pH对ΔA的影响；图3D是AAP浓度对ΔA的影响。
图4A是不同体系浓度的ACP对应的紫外-可见光谱的变化趋势，a-n对应ACP体系浓度依次为0.075,0.12,0.15,0.24,0.3,0.36,0.45,0.6,0.75,1.2,1.5,2.25,2.7,3mU·mL-1；图4B是比色传感体系中加入0.15,0.3,0.6,1.2,2.4,3mU·mL-1的ACP后相对应的颜色变化图，呈现从深绿色到无色的颜色渐变；图4C是比色传感体系中吸光度差值ΔA随不同浓度AA变化的相对标准曲线图；图4D是比色传感体系中吸光度差值ΔA随不同浓度ACP变化的相对标准曲线图；
图5是比色传感体系在干扰物存在下的选择性结果；图中，Blank是空白样品，Tyr，Phe，Lys，Sar，Asp分别是酪氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，肌氨酸，天冬氨酸，HAS，BSA，Glu，Lysozyme，Try分别是人血清白蛋白，牛血清白蛋白，葡萄糖，溶菌酶素，胰蛋白酶，ALP是碱性磷酸酶，此外还有一些离子干扰物，包括K+,Ca2+,Na+,Mg2+,Zn2+。
图6是紫外-可见光谱吸光度差值ΔA随不同浓度PM变化的相对标准曲线图。
图7是在ACP体系浓度为3mU·mL-1下加入不同浓度PM所产生的的抑制曲线。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的技术方案。虽然以下为描述本发明技术方案的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
药品和试剂：分析纯的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、ABTS、ACP、PM、肌氨酸、天冬氨酸、溶菌酶素，均购买于阿拉丁试剂(上海，中国)。CTAB、人血清白蛋白、酪氨酸，均购买于国药试剂(上海，中国)。碱性磷酸酶、维生素C磷酸酯钠，均购买于源叶生物(上海，中国)；紫外吸收光谱及吸光度值由UV-2450紫外分光光度计获得(日本)。其他试剂均购买自国药试剂(上海，中国)，并且均为分析纯。
MnO2纳米片由以下方法制得，具体步骤如下：将50mg高锰酸钾溶于45mL超纯水中，室温下搅拌1h，然后缓慢加入15mg N,N,N-三甲基1-十六烷基溴化铵，匀速缓慢搅拌直至形成稳定的乳状液。随后，加入5ml MES缓冲溶液(0.1M,pH 6.0)，所得棕黑色溶液在室温下匀速搅拌过夜。最后用超纯水溶液离心洗涤多次，直至上清液澄清，得到MnO2纳米片，放置真空干燥箱干燥定量，后用超纯水溶解超声，得到固定浓度的MnO2纳米片溶液。
实施例1
为了获得最优的ACP检测环境，发明人以吸光度差值ΔA作为标准((ΔA＝A0–A，A0和A分别代表存在和不存在ACP时，420nm处的吸光度值)，对影响因素MnO2纳米片在体系中的浓度、AAP与ACP的孵育时间、pH、AAP在体系中的浓度进行了优化。
(一)、MnO2纳米片浓度对ΔA的影响
步骤(a)、采用纯水(pH＝7.0)配制ACP溶液和AAP溶液，将ACP溶液与AAP溶液混合，在37℃下孵育10min；以不添加ACP为对照；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，在37℃下孵育10min；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合体系中加入ABTS溶液，在37℃下孵育50min，获得比色传感体系；比色传感体系中，AAP的浓度为0.1mM，ACP的浓度为3mU·mL-1，MnO2纳米片的浓度为0.015-0.15mg·mL-1，ABTS的浓度为2.5mM；
步骤(d)、在420nm波长处测定：含不同浓度的MnO2纳米片的样品的紫外吸光度A、不含ACP的反应体系在420nm波长处的吸光度A0；计算A0与A的吸光度差值ΔA，结果见图3A。
MnO2纳米片浓度影响本发明方法的灵敏度和动态变化范围，从图3A可以看到：当MnO2纳米片浓度在0.075mg·mL-1时，ΔA值达到最大。推测可能是因为低浓度的MnO2纳米片造成与生成的AA反应不完全，而过高浓度的MnO2纳米片氧化酶活性过剩，反应前后的变化不明显，ΔA低。因此，选用0.075mg·mL-1MnO2纳米片浓度。
(二)、AAP与ACP的孵育时间对ΔA的影响
步骤(a)、采用纯水(pH＝7.0)配制ACP溶液和AAP溶液，将ACP溶液与AAP溶液混合，在37℃下孵育5、10、20、30、45min；以不添加ACP为对照；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，在37℃下孵育10min；
步骤(c)、(d)同“(一)、MnO2纳米片浓度对ΔA的影响”；比色传感体系中，AAP的浓度为0.1mM，ACP的浓度为3mU·mL-1，MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，ABTS的浓度为2.5mM。
如图3B所示，AAP与ACP的孵育20min时，ΔA值最大，说明AAP与ACP反应完全。
(三)、AAP与ACP混合体系的pH对ΔA的影响
根据相关文献知识，ACP在酸性条件下活性较强，故选择0.2mol·L-1、pH＝3.6、4、4.6、5、5.5、6的NaAc-HAc缓冲溶液考察pH。
步骤(a)、采用不同pH的缓冲液配制ACP溶液和AAP溶液，将ACP溶液与AAP溶液混合，在37℃下孵育20min；以不添加ACP为对照；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，在37℃下孵育10min；
步骤(c)、(d)同“(一)、MnO2纳米片浓度对ΔA的影响”；比色传感体系中，AAP的浓度为0.1mM，ACP的浓度为3mU·mL-1，MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，ABTS的浓度为2.5mM。
如图3C所示，pH4.6时ΔA值最大，选用该pH值作为AAP与ACP的反应条件。
(四)、AAP的浓度对ΔA的影响
AAP的浓度影响着AA的生成，故对其进行考察。
步骤(a)、采用0.2mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液配制不同浓度ACP溶液和AAP溶液，将ACP溶液与AAP溶液混合，在37℃下孵育20min；以不添加ACP为对照；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，使体系中MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，在37℃下孵育10min；
步骤(c)、(d)同“(一)、MnO2纳米片浓度对ΔA的影响”；比色传感体系中，AAP的浓度为0.1-1.5mM，ACP的浓度为3mU·mL-1，MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，ABTS的浓度为2.5mM。
如图3D所示，体系中AAP的浓度为1mM时，ΔA值最大。
实施例2
一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，包括如下步骤：
步骤(a)、采用0.2mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液配制不同浓度的ACP溶液、AAP溶液，将不同浓度的ACP溶液与AAP溶液混合，在37℃下孵育20min；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，在37℃下孵育反应10min；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合系统中加入显色底物ABTS，在37℃下孵育反应50min，获得比色传感体系；比色传感体系中，ACP的浓度分别为0.075,0.12,0.15,0.24,0.3,0.36,0.45,0.6,0.75,1.2,1.5,2.25,2.7,3mU·mL-1，AAP浓度为1mM，MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，体系中ABTS的浓度为2.5mM；
步骤(d)、将样品放置紫外可见分光光度计后进行200～800nm全波长扫描，扫描速度为1200nm/min，光电倍增管电压为750V，狭缝宽度为5nm，测定420nm处的吸光度值A；测定不含目标物ACP的反应体系在420nm波长处的吸光度A0；计算A0与A的吸光度差值ΔA，获得ACP浓度与吸光度差值ΔA的线性关系(见图4)：ΔA＝0.6065C+0.0132；所获得的传感器的比色检测可视化检测限为0.6mU·mL-1；
步骤(e)、按照步骤(a)-步骤(d)获得待测样品获得的吸光度差值ΔA，根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品获得的吸光度差值ΔA，得到待测样品中ACP的浓度。
实施例3
本发明检测方法的选择性实验
将实施例2步骤(a)中的ACP更换为100μM酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、肌氨酸、天冬氨酸、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、葡萄糖、溶菌酶素、胰蛋白酶、碱性磷酸酶、1mMK+,Ca2+,Na+,Mg2+,Zn2+等干扰物，重复实施例2中的步骤(b)、(c)、(d)，其它条件不变，检测吸光度差值，得到本方法检测目标ACP的选择性结果，见图5，从图中可以看出本发明方法对酸性磷酸酶具有良好的选择性。
实施例4
本发明检测方法的回收率实验
血清样本(来自中南大学附属中大医院)12000rmp离心5min去除不溶性沉淀，用磷酸盐缓冲液(pH＝7，10mM Na2HPO4/NaH2PO4)进行百倍稀释，在其中加入AAP使体系中AAP浓度为1mM，在37℃下孵育20min，后续步骤与实施例2步骤(b)、(c)一致。
在血清样本中分别添加0.15、0.3、0.45mU·mL-1的ACP，在其中加入AAP使体系中AAP浓度为1mM，在37℃下孵育20min，重复实施例2步骤(b)、(c)、(d)，进行加样检测，获得本方法在实际样品检测中的回收率，结果见表1，说明本发明方法能够很好的用于实际生物样本的检测分析。
表1、采用本发明方法测定人血清样本中ACP含量及加样回收率实验
实施例5
将实施例2所构建的比色传感器应用于有机磷农药—甲基对硫磷(PM)的测定，需预先将不同浓度的甲基对硫磷与ACP混合并反应，后续操作与实施例2步骤(a)、(b)、(c)、(d)一致。
一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，包括如下步骤：
步骤(a)、采用0.2mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液配制甲基对硫磷溶液、ACP溶液、AAP溶液，将不同浓度的甲基对硫磷溶液与ACP溶液混合，在37℃下孵育10min；将上述混合体系与AAP溶液混合，在37℃下孵育20min；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，在37℃下孵育反应10min；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合系统中加入显色底物ABTS，在37℃下孵育反应50min，获得比色传感体系；比色传感体系中，ACP的浓度为6mU·mL-1，甲基对硫磷的浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1、2、3μg·mL-1，AAP浓度为1mM，MnO2纳米片的浓度为0.075mg·mL-1，ABTS的浓度为2.5mM；
步骤(d)、将样品放置紫外可见分光光度计后进行200～800nm全波长扫描，扫描速度为1200nm/min，光电倍增管电压为750V，狭缝宽度为5nm，测定420nm处的吸光度值A；测定不含PM的反应体系在420nm波长处的吸光度A0；计算A0与A的吸光度差值ΔA，获得PM浓度与吸光度差值ΔA的线性关系(见图6)：ΔA＝1.080C+0.061；
步骤(e)、按照步骤(a)-步骤(d)获得待测样品获得的吸光度差值ΔA，根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品获得的吸光度差值ΔA，得到待测样品中PM的浓度。
对获得的数据样本测定PM半抑制最大浓度IC50(见图7)，IC50值为0.2625μg·mL-1。
实施例6
本发明方法用于甲基对硫磷PM的实际样品测定及回收率检测。
首先对实际样本进行离心处理，12000rmp离心5min去除不溶性沉淀。添加ACP使体系浓度分别为0.15、0.3、0.45mU·mL-1，进行加样检测，重复实施例5步骤(b)、(c)、(d)，获得本发明方法在实际样品检测中的回收率，结果见表2。
表2、采用本发明方法测定实际样品中PM含量及加样回收率实验
注：苹果、柿子先粉碎、离心，上清液再添加0.2mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液；河水、自来水直接离心处理，再添加0.2mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液。
实施例7
本发明方法与已报道的荧光及其他比色检测方法在分析性能上的比较，见表3。
表3、本发明方法用于ACP检测效能与已报道的其他检测方法的比较
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (11)
1.一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的非诊断目的的比色检测方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(a)、采用NaAc-HAc缓冲溶液配制ACP溶液和AAP溶液，将多个不同浓度的ACP溶液与其底物AAP溶液混合并孵育；所述的NaAc-HAc缓冲溶液为0.2 mol·L-1、pH 4.6的NaAc-HAc缓冲溶液；所述的孵育为在37 ℃下孵育20 min；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系进行孵育反应，所述的孵育为在36～38 ℃下孵育5～15 min；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合系统中加入显色底物ABTS，进行孵育反应，获得比色传感体系；所述的比色传感体系中，ACP的浓度为0.075～3 mU·mL-1；AAP的浓度为1mM；MnO2纳米片的浓度为0.075 mg·mL-1；ABTS的浓度为2.5～10mM；
步骤(d)、在420 nm波长处测定样品的紫外吸光度A；测定没有目标物ACP时，反应体系在420 nm波长处的吸光度A0；利用测得的A0与A的吸光度差值ΔA，获得ACP浓度与吸光度差值ΔA的线性关系；
步骤(e)、根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品的吸光度差值ΔA，得到待测样品中ACP的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于步骤(c)中，所述的孵育为在36～38 ℃下孵育5～60 min。
3.根据权利要求2所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于步骤(b)中，所述的孵育为在37 ℃下孵育10 min；
步骤(c)中，所述的孵育为在37 ℃下孵育50 min。
4.根据权利要求1所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于所述的比色传感体系中，ABTS的浓度为2.5 mM。
5.根据权利要求1所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法，其特征在于步骤(d)中，测定吸光度的方法为：将样品放置紫外可见分光光度计后进行200～800nm全波长扫描，扫描速度为1200 nm/min，光电倍增管电压为750 V，狭缝宽度为5 nm，测定420 nm处的吸光度值A或A0。
6.权利要求1-5任一项所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于酸性磷酸酶的比色检测方法在检测食物样本、水样中ACP含量的应用。
7.一种基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的非诊断目的的比色检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(a)、采用NaAc-HAc缓冲溶液配制有机磷农药溶液、ACP溶液和AAP溶液；将不同浓度的有机磷农药溶液与ACP溶液混合并孵育，有机磷农药和ACP的孵育为在37 ℃下孵育10min；将有机磷农药和ACP的混合体系与AAP溶液混合并孵育；
步骤(b)、将MnO2纳米片溶液与步骤(a)得到的混合体系混合，进行孵育反应；
步骤(c)、在步骤(b)得到的混合体系中加入显色底物ABTS溶液，进行孵育反应，获得比色传感体系；所述的比色传感体系中，ACP的浓度为3mU·mL-1；AAP的浓度为1mM；MnO2纳米片的浓度为0.075 mg·mL-1；ABTS的浓度为2.5～10mM；
步骤(d)、在420 nm波长处测定样品的紫外吸光度A；测定没有有机磷农药时，反应体系在420 nm波长处的吸光度A0；利用测得的A0与A的吸光度差值ΔA，获得有机磷农药浓度与吸光度差值ΔA的线性关系；
步骤(e)、根据步骤(d)所得到的线性关系与待测样品的吸光度差值ΔA，得到待测样品中有机磷农药的浓度。
8.根据权利要求7所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的比色检测方法，其特征在于所述的有机磷农药为对硫磷、内吸磷、甲拌磷、甲基对硫磷、敌敌畏中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的比色检测方法，其特征在于所述的有机磷农药为甲基对硫磷。
10.根据权利要求7所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的比色检测方法，其特征在于所述的比色传感体系中，有机磷农药的浓度为0.05～3 µg·mL-1；ABTS的浓度为2.5 mM。
11.权利要求7-10任一项所述的基于二氧化锰仿生物模拟氧化酶活性对于有机磷农药的比色检测方法在检测食物样本、水样中有机磷农药含量的应用。
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