CN116449026A - 一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白i的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白I的方法，涉及纳米生物传感技术领域。包括以下步骤：首先将二氧化锰纳米片与聚乙烯亚胺、cTnI抗体、BSA抗体进行预处理，随后将cTnI抗体、BSA、待测cTnI液在检测皿中结合，后加入预处理后的二氧化锰纳米片孵育一段时间，后加入缓冲液和TMB孵育一段时间，即可将其进行紫外‑可见光检测。本发明的方法，其检测限较低，能够较为容易的检测出低浓度的cTnI，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物传感技术领域，具体涉及一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白I的方法。
背景技术
二氧化锰，是一种无机化合物，化学式为MnO2，为黑色无定形粉末或黑色斜方晶体，具有独特的物理化学性质，在生物治疗、生物传感、细胞工程、能量储存、催化剂、环境修复等领域得到了广泛的关注，特别是二氧化锰纳米片凭借其固有的优点，在生物医学应用领域引起了人们的热烈研究。
心肌肌钙蛋白I（cTnI）为心肌组织特有的一种调节蛋白，可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，在心肌收缩过程中起重要作用。cTnI是心肌细胞损伤最敏感和最特异性的血清标志物之一，已逐渐成为判断急性心肌梗死患者心肌细胞损伤的主要生化指标。因此，对心肌肌钙蛋白I的检测是一种重要的工作，目前虽然存在较多的心肌肌钙蛋白I检测方法，比如胶体金法、化学发光法等，但是这些方法的检出限较高，难以检测一些低浓度的心肌肌钙蛋白I。
发明内容
为解决至少一种上述问题，本发明提出了一种二氧化锰纳米片在心肌肌钙蛋白I检测方面的应用，该方法检测心肌肌钙蛋白I的检测限极低，能够检测微量的心肌肌钙蛋白I。
本发明的技术方案如下：一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白I的方法，包括以下步骤：
前驱体的制备：取浓度为0.15~0.25mg/mL的二氧化锰纳米片分散液，将其和2~3μg/mL的聚乙烯亚胺溶液混合并反应1~2h，后除去未反应的聚乙烯亚胺溶液；将产物与浓度为80~120μg/mL的心肌肌钙蛋白I抗体溶液、浓度为8~15μg/mL的牛血清白蛋白抗体溶液混合并在不高于4℃的条件下孵育12~14h，后将其分离提纯即得；其中，二氧化锰纳米片分散液、聚乙烯亚胺溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液的体积相等，牛血清白蛋白抗体溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液的体积比为5:100；
检测前操作：取浓度为80~110μg/mL的心肌肌钙蛋白I抗体溶液在检测皿中培养10~15h，后除去前述心肌肌钙蛋白I抗体溶液，后在检测皿中加入80~110μg/mL的牛血清白蛋白溶液并培养20~60min，除去前述牛血清白蛋白溶液，在检测皿中继续加入心肌肌钙蛋白I待测液并培养0.5~2h，除去前述心肌肌钙蛋白I待测液，在检测皿中加入浓度为0.15~0.25mg/mL的前驱体分散液并孵育50~80min，除去前驱体分散液，在检测皿中加入浓度pH为3.6~5.0、浓度为2mM的HAc-NaAc缓冲溶液、浓度为10mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液孵育5~10min；其中，心肌肌钙蛋白I抗体溶液、牛血清白蛋白溶液、心肌肌钙蛋白I待测液、前驱体分散液、HAc-NaAc缓冲溶液和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的体积比为1:0.95~1.05：0.95~1.05：0.95~1.05：1.6~2.0：0.15~0.25；
将上述反应后的产物进行紫外-可见光谱检测。
同时，对于上述的检测，可以采用标准曲线法获得心肌肌钙蛋白I待测液中，心肌肌钙蛋白I的准确含量。其中，标准曲线法是事先采用一系列不同浓度的标准心肌肌钙蛋白I溶液进行测试，最终制得标准曲线，对于后续的待测溶液，测得其吸光度值后，根据标准曲线进行计算即得。这些属于本领域常识，因此对其具体操作步骤不予赘述。
同时，在本发明中，通常是采用透光性好、不会影响紫外-可见光检测的微量滴定板作为检测皿，但是在实际过程中，本领域技术人员可采用其余的、不影响紫外-可见光检测的容器作为检测皿。当然，在检测前操作过程中，需要多种物质在检测皿上生长，因此，要求检测皿通常为塑料材质，比如聚丙烯。
本发明的一种实施方式在于，所述二氧化锰纳米片采用以下方式制备：取高锰酸钾将其配置为0.8~1.2mg/ml的水溶液，在水溶液中加入现榨橙汁或橘汁，在室温条件下搅拌反应15~50min，反应结束后，对其进行分离提纯即得，其中，水溶液和橙汁或橘汁的体积比为8：0.8~1.3。
进一步的，所述现榨橙汁或橘汁是指，将橙子或橘子榨汁后，1min中内的橙汁或橘汁。因此，通常的操作是，在将橙子或橘子榨汁后，立即将其加入高锰酸钾溶液中。发明人经过大量测试发现，通常所采用的橙子或橘子都能够满足本发明的需求：比如常见的脐橙（赣南早脐橙、清家脐橙）、血橙（塔罗科血橙）、甜橙（冰糖橙）、砂糖橘、不知火等等都能应用于本发明。
对于聚乙烯亚胺，可以采用本领域常见的、水溶性聚乙烯亚胺，其聚合度可以为50~120。
具体的，在本发明中，采用现榨橙汁或现榨橘汁，主要是利用其内部的Vc（维生素C）将高锰酸钾还原成二氧化锰纳米片，因此，通常要求鲜榨橙汁或现榨橘汁中的Vc含量过量，同时，现榨橙汁或现榨橘汁中还有部分物质可能会对二氧化锰纳米片进行改性：发明人尝试过采用单纯的Vc，发现其虽然同样能够制得二氧化锰纳米片，但是其在检测心肌肌钙蛋白I方面的能力不如利用现榨橙汁或现榨橘汁。
本发明的一种实施方式在于，所述前驱体的制备过程中的分离提纯步骤的具体操作为：取产物，除去液相，并采用PBS缓冲液洗涤数次即得，对于PBS缓冲液，其是常见的生物检测过程中所用的缓冲液，因此在此对其配比不予赘述，同时，在本步骤中，其pH为7~7.5，优选为7.2。
本发明的一种实施方式在于，检测前操作中，除去检测皿中的溶液或分散液的具体操作为：取培养或孵育后的产物，除去液相，后用PBS缓冲液洗涤检测皿数次即得。同时，在本步骤中，PBS缓冲液的pH为7-7.5，优选为7.2。
本发明的一种实施方式在于，所述心肌肌钙蛋白I待测液中，心肌肌钙蛋白I浓度大于0.7pg/mL。本发明中，对心肌肌钙蛋白I的检测限为0.7pg/mL，因此，要求溶液中心肌肌钙蛋白I的浓度大于0.7pg/mL，同时，从理论上讲，本发明对心肌肌钙蛋白I的检测上限为10ng/mL，但是，本领域技术人员清楚的是，对于浓度过高的溶液，可将其稀释后进行检测，因此，对心肌肌钙蛋白I的上限并无要求。
本发明的一种实施方式在于，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的溶剂为二甲亚砜。对于TMB（3,3’,5,5’–四甲基联苯胺）溶液，要求其溶剂即能够溶解TMB，同时，该溶剂还能够溶于水，因此，可选择二甲基甲酰胺、二甲亚砜、丙酮等常见的溶剂，但是从性能上来讲，优选二甲亚砜。
本发明的有益效果在于：
本发明的方法，利用现榨橙汁或现榨橘汁制备二氧化锰纳米片，并用该二氧化锰纳米片作为生物传感器对心肌肌钙蛋白I进行检测，能够对微量的心肌肌钙蛋白I进行检测，且其检测限极低，能够达到0.7pg/mL，远优于现有的检测方法，同时其具有较好的选择性，常见的干扰物质均难以对其检测造成干扰。
附图说明
图1是实施例一中测得心肌肌钙蛋白I的标准曲线图，图1A为不同浓度的cTnI检测时的吸光度强度，图1B为根据图1A的结果做的标准曲线；
图2为实施例1中制得二氧化锰纳米片的微观图，2A为TEM图像，图2B为比例尺为10nm的HRTEM图像，图2C为比例尺为2nm的HRTEM图像；
图3为实施例2中现榨橘汁和Vc的测试效果对比图；
图4为实施例3中的选择性、稳定性、重现性测试结果图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和技术优点更加清楚，下面将结合实施例和附图，对本发明的实施过程中的技术方案进行清楚、完整的描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，若未做说明，所述的溶液（分散液）的溶剂（连续相）均为水。
下述实施例中，所述的PBS缓冲液的pH为7.2。
下述实施例中，所述的TMB溶液的溶剂为二甲亚砜。
实施例1：二氧化锰纳米片的制备：取不知火制成现榨橘汁，取现榨橘汁5ml并加入40ml的1mg/ml的高锰酸钾溶液中，持续搅拌30min；取固相，用去离子水和乙醇洗涤，随后冻干即得。
前驱体的制备：将1mL MnO2纳米片分散液（0.2mg/mL）与1mL 聚乙烯亚胺（PEI，聚合度为100）溶液（2.5μg/mL）混合，连续超声90分钟。将得到的溶液用去离子水洗涤3次以除去未结合的PEI。同时，将获得的溶液与cTnI抗体溶液（1mL，100μg/mL）和BSA（牛血清白蛋白）抗体溶液（50µL，10μg/mL）在4℃下混合孵育12小时。最后，取制得的产物，除去液相后得到前驱体，将前驱体用PBS缓冲液洗涤3次，并在4℃下储存。
检测前操作：将100μL的cTnI抗体溶液（100μg/mL）加入96孔微量滴定板中培养12小时，之后，将液相倾倒除去后，用PBS缓冲液洗涤前述96孔微量滴定板3次，以去除未结合的抗体；将100μL BSA溶液（100μg/mL）依次加入前述96孔微量滴定板中0.5小时，以阻断非特异性活性位点，将液相倾倒除去，用PBS缓冲液洗涤前述96孔微量滴定板3次；将100μL不同浓度的cTnI溶液加入前述96孔微量滴定板中培养1小时，将液相倾倒除去后，用PBS缓冲液将96孔微量滴定板洗涤3次以除去未结合的抗原；然后，将前驱体分散液（0.2mg/mL，100μL）加入前述96孔微量滴定板中并孵育1小时，将液相倾倒除去后，用PBS缓冲液洗涤前述96孔微量滴定板3次；将HAc-NaAc缓冲溶液（pH 4.0，180μL ，2mM）、TMB溶液（20μL，10mM）加入前述96孔微量滴定板中一起孵育7分钟。
将孵育后的产物进行紫外-可见光谱检测。
其中，图1A为不同浓度的cTnI检测时的吸光度强度，图1B为根据图1A的检测结果做的标准曲线。
对于图1A，其吸光度曲线从上至下对应浓度为0.001~10ng/mL且浓度由高到低的cTnI吸光度曲线，cTnI浓度由低到高如表1所示。
表1 图1A中吸光度曲线对应浓度
从图1A可以看出，在本发明实施例的方法中，cTnI含量越高，则检测出的吸光度越高，反之亦然。当cTnI浓度为10 ng/mL时，其吸光度最高，当cTnI浓度为大于10 ng/mL时，其吸光度超过检测上限。当然，本领域技术人员知晓的是，本实施例的方法并非仅能够检测浓度为10 ng/mL的cTnI，当其浓度较高时，可对其进行稀释后再进行检测。
从图1B可知，本实施例的方法，能够很好的检测出1pg/mL~10ng/mL的cTnI的浓度：当cTnI浓度为1pg/mL~10ng/mL时，ΔA=0.51+0.104 logC，R2=0.98，式中，A为吸光度，C为cTnI的浓度，ng/mL。说明采用本发明实施例的方法对cTnI进行检测时，cTnI浓度的对数和吸光度具有较好的线性关系。同时根据计算公式LOD（检测限）=3σ/s，计算得出采用本发明实施例的方法检测cTnI时，其检测限为0.7pg/mL。
同时，对制得的二氧化锰纳米片进行图像扫描，获得其TEM图像和HRTEM图像，最终结果如图2所示。其中，图2A为TEM图像，图2B和2C为HRTEM图像，从图2可知，本发明制得的二氧化锰为二维纳米级。
同时，为了对比本发明实施例的方法的效果，将本领域常规用于检测cTnI的方法的检测限进行对比，具体如表2所示。
表2 多种cTnI检测方法的检测限统计表
从表2可以看出，即使现有技术中存在大量的采用纳米片作为辅助检测材料的方法，但是这些方法的检测限仍然较高，难以应用于微量cTnI的检测。
实施例2：现榨橘汁和Vc制备的二氧化锰纳米片在心肌肌钙蛋白I检测方面的区别：
Vc制备二氧化锰纳米片的操作：取高锰酸钾将其配置为1mg/ml的水溶液，并配置2.8mg/mL的维生素C水溶液，将两者等体积混合，在室温条件下搅拌反应30min，反应结束后，对其进行分离提纯即得。
现榨橘汁制备二氧化锰纳米片的方法和实施例1相同。
检测方法：将150μL的HAc-NaAc缓冲溶液（0.2M,pH=4），10μL的H2O2溶液（10mM），10μL的TMB溶液（10mM）与10μL的MnO2纳米片水分散液（0.2mg/mL）混合，再加入20μL心肌肌钙蛋白I溶液（0.5mM），在室温下静置5min后对其进行紫外-可见光谱测量。
最终两者对比如图3所示。从图3可以看出，利用橘汁制备的二氧化锰纳米片的效果优于采用Vc制备二氧化锰纳米片。
实施例3：选择性、稳定性和重现性的检测
本实施例中，二氧化锰纳米片的制备方法和实施例1相同。区别在于，同时制备多个对比例，每个对比例中分别加入较为常见的、与cTnI相同浓度的干扰物质，这些干扰物质包括牛血清白蛋白、C反应蛋白（CRP）、糖类抗原（CA125）、癌胚抗原（CEA）。最终检测结果如图4第一横排所示；在加入cTnI5倍浓度的干扰物质，最终检测结果如图4第二横排所示；加入浓度约为0.1ng/mL的cTnI溶液并重复实验5次后，最终检测结果如图4第三横排所示。
从图4第一横排可知，只有对cTnI有较高的吸光度，说明该材料对cTnI有较好的选择性；由第二横排可知，常见的这些干扰物质加入溶液中后，溶液的吸光度基本不变，稳定性较好，说明这些常见的干扰物质对本发明实施例的检测方法基本不具有干扰性，本发明实施例的检测方法具有较好的稳定性；由第三横排可知，每次检测溶液的吸光度基本不变，回收率基本相同，说明该本实施例的方法有很好的重现性。
实施例4：本实施例中，二氧化锰纳米片的制备方法和实施例1相同，区别在于，在检测过程中，检测样本为人全血，同时对人全血进行以下操作：将人全血样本在13000rpm条件下离心10min，取上清液使用PBS（pH=7.2）稀释100倍。采用实施例1的方法将其作为cTnI待测液进行检测，最终检测结果如表3所示。
表3 采用本实施例方法和常规医用方法对人血清中cTnI的检测结果对比
从表3可知，使用我们开发的方法对样品进行测试，如表所示。相对误差率在8.85%以下，表明我们开发的人血清cTnI检测方法具有良好的可行性和可靠性。同时，目前医院采用的检测方法，其检测限相对较高，本发明实施例的方法，其检测限相对更低。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种基于二氧化锰纳米片检测心肌肌钙蛋白I的方法，其特征在于，包括以下步骤：
前驱体的制备：取浓度为0.15~0.25mg/mL的二氧化锰纳米片分散液，将其和2~3μg/mL的聚乙烯亚胺溶液混合并反应1~2h，后除去未反应的聚乙烯亚胺溶液；将产物与浓度为80~120μg/mL的心肌肌钙蛋白I抗体溶液、浓度为8~15μg/mL的牛血清白蛋白抗体溶液混合并在不高于4℃的条件下孵育12~14h，后将其分离提纯即得；其中，二氧化锰纳米片分散液、聚乙烯亚胺溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液的体积相等，牛血清白蛋白抗体溶液和心肌肌钙蛋白I抗体溶液的体积比为5:100；
检测前操作：取浓度为80~110μg/mL的心肌肌钙蛋白I抗体溶液在检测皿中培养10~15h，后除去前述心肌肌钙蛋白I抗体溶液，后在检测皿中加入80~110μg/mL的牛血清白蛋白溶液并培养20~60min，除去前述牛血清白蛋白溶液，在检测皿中继续加入心肌肌钙蛋白I待测液并培养0.5~2h，除去前述心肌肌钙蛋白I待测液，在检测皿中加入浓度为0.15~0.25mg/mL的前驱体分散液并孵育50~80min，除去前驱体分散液，在检测皿中加入浓度pH为3.6~5.0、浓度为2mM的HAc-NaAc缓冲溶液、浓度为10mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液孵育5~10min；其中，心肌肌钙蛋白I抗体溶液、牛血清白蛋白溶液、心肌肌钙蛋白I待测液、前驱体分散液、HAc-NaAc缓冲溶液和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的体积比为1:0.95~1.05：0.95~1.05：0.95~1.05：1.6~2.0：0.15~0.25；
将上述反应后的产物进行紫外-可见光谱检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二氧化锰纳米片采用以下方式制备：取高锰酸钾将其配置为0.8~1.2mg/ml的水溶液，在水溶液中加入现榨橙汁或橘汁，在室温条件下搅拌反应15~50min，反应结束后，对其进行分离提纯即得，其中，水溶液和橙汁或橘汁的体积比为8：0.8~1.3。
3.根据权利要求1所述的方法，所述现榨橙汁或橘汁是指，将橙子或橘子榨汁后，1min中内的橙汁或橘汁。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前驱体的制备过程中的分离提纯步骤的具体操作为：取产物，除去液相，并采用PBS缓冲液洗涤数次即得。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测前操作中，除去检测皿中的溶液或分散液的具体操作为：取培养或孵育后的产物，除去液相，后用PBS缓冲液洗涤检测皿数次即得。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白I待测液中，心肌肌钙蛋白I浓度大于0.70 pg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的溶剂为二甲亚砜。
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