CN114609376A - 一种上转换生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物传感器药物残留检测技术领域，公开了一种上转换生物传感器及其制备方法和应用。所述上转换生物传感器是由上转换荧光探针和猝灭剂组成，所述上转换荧光探针为适配体修饰的稀土掺杂上转换纳米颗粒，简写为UCNPs@apt；其中，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为NaReF4，简写为UCNPs，所述UCNPs@apt是在除油酸配体后UCNPs表面用PEI功能化，得到PEI包覆的UCNPs，再将PEI包覆的UCNPs与适配体结合构成；所述猝灭剂为MnO2纳米片或纳米氧化石墨烯。该生物传感器可实现对浓度为10～3000ng/mL目标检测物的快速检测，具有高灵敏、高选择性、操作简单、成本低廉等优点。

Description

一种上转换生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感器检测技术领域，更具体地，涉及一种上转换生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
上转换生物传感器主要由能量供体(如稀土掺杂上转换纳米颗粒)以及能量受体(也称猝灭剂，如二氧化锰纳米片、纳米氧化石墨烯等)构成，在生物检测领域具有良好的应用前景。镧系离子掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)具有独特的光学性质，在近红外980nm激光照射，可有效避免背景荧光的干扰，同时UCNPs发出较低波长的光，如可见光。与传统荧光试剂相比，UCNPs具有化学稳定性高、毒性低、量子产率高、发射峰窄、荧光寿命长、无背景干扰等优势，因此，基于上转换发光纳米探针构建的荧光传感器具有良好的潜在用途。
适配体是由SELEX法进行富集和筛选，具有价格低廉、合成简单等优点，已被广泛运用于分子层面的检测。适配体是具有抗体功能的单链寡肽核苷酸，即一种单链DNA或RNA碱基序列，其特殊的立体结构能辨别特定的蛋白质，对目标检测物具有专一识别能力，在食品安全检测领域具有很好的有应用潜力。猝灭剂材料如二氧化锰纳米片、纳米氧化石墨烯等通过与碱基对相互作用，以特定的作用力自发吸附适配体的单链DNA或RNA。因此，适配体修饰的UCNPs与猝灭剂材料通过特定作用力组装形成生物传感器。
影响人类健康的食源性病原体很多，以常见的兽药残留为例，兽药残留是指动物产品的任何可食部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质。如兽药中恩诺沙星，是属于喹诺酮类抗生素的一种，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有显著活性。它在农业中被用作兽药和抗生素，价格低廉，却非常有效。当在兽医学中因过度使用或滥用而在食物或环境中残留时，长期食用兽药残留超标的食品后，当体内蓄积的兽药残留浓度达到一定量时，人体就会产生多种急慢性中毒，最终会对人体健康造成危害，引起对致病性菌株的过敏反应和耐药性。
目前，对兽药残留检测的常用方法有微生物法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和色谱-质谱法等。上述技术虽然灵敏度高，但样品预处理成本高，步骤复杂，测量时间长。许多人也尝试使用荧光探针来检测兽药残留，传统的荧光探针由于表面存在疏水基团或在有机溶剂中反应制得，在水溶液中分散能力较差，这限制了其在生物体系中的应用；同时检测的灵敏度不高，检测范围小，成本高。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本发明提供一种上转换生物传感器。
本发明另一目的在于提供上述上转换生物传感器的制备方法。该方法基于适配体修饰的UCNPs探针和纳米材料猝灭剂构建的生物传感器则可解决上述的问题，实现对食品安全领域各种食源性病原体的高选择性、高灵敏、快速、价廉的检测。
本发明再一目的在于提供上述上转换生物传感器的应用。
本发明的目的通过下述方案来实现：
一种上转换生物传感器，所述上转换生物传感器是由上转换荧光探针和猝灭剂组成，所述上转换荧光探针为适配体修饰的稀土掺杂上转换纳米颗粒，简写为UCNPs@apt；其中，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为NaReF4，简写为UCNPs，所述UCNPs@apt是在除油酸配体后UCNPs表面用PEI功能化，得到PEI包覆的UCNPs，再将PEI包覆的UCNPs与适配体结合构成；所述猝灭剂为MnO2纳米片或/和纳米氧化石墨烯。
优选地，所述MnO2纳米片的尺寸为300～800nm，所述纳米氧化石墨烯的尺寸为500～2000nm。
优选地，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核结构的NaReF4、核-壳结构的NaReF4@NaReF4、核-壳-壳结构的NaReF4@NaReF4@NaReF4，所述Re为Gd、Nd、Y、La、Lu、Yb、Er、Tm、Ho、Tb、Eu、Dy、Sm中的一种以上；所述适配体为恩诺沙星适配体、妥布霉素适配体、环丙沙星适配体、马波沙星适配体、依诺沙星适配体、诺氟沙星适配体、卡布霉素适配体、卡马西平适配体、玉米赤霉烯酮适配体、金霉素适配体、青霉素G适配体、氧化乐果适配体、草甘膦适配体、四环素适配体、庆大霉素适配体中的一种以上。
更为优选地，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核结构的NaReF4时，所述Re为Yb:Gd:La:Y:Lu:Er或Tm或Ho的摩尔百分比＝(10～100％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)；
所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核-壳结构的NaReF4@NaReF4时，所述Re为(Yb:Gd:La:Y:Lu:Er或Tm或Ho)@(Gd或Y或La或Lu)的摩尔百分比＝(10～100％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@Gd或Y或La或Lu中任意一种或两种以上混合＝100％；所述Re为(Yb:Gd:Y:La:Lu:Tm)@(Gd:Y:La:Lu:Tb或Eu或Dy或Sm)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(1～20％)；所述Re为(Nd:Yb:Gd:Y:La:Lu)@(Yb:Gd:Y:La:Lu:Er或Tm或Ho)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～50％):(0～50％):(0～50％):(0～50％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)；
所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核-壳-壳结构的NaReF4@NaReF4@NaReF4时，所述Re为(Yb:Gd:Y:La:Lu:Tm)@(Gd:Y:La:Lu:Tb或Eu或Dy或Sm)@(Gd或Y或La或Lu)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(1～20％)@Gd或Y或La或Lu中任意一种或两种以上混合＝100％；
所述Re为(Nd:Yb:Gd:Y:La:Lu)@(Yb:Gd:Y:La:Lu:Tm)@(Gd:Y:La:Lu:Tb或Eu或Dy或Sm)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～50％):(0～50％):(0～50％):(0～50％)@(10～90％):(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(1～20％)；
所述Re为(Nd:Yb:Gd:Y:La:Lu)@(Yb:Gd:Y:La:Lu:Er或Ho)@(Gd或Y或La或Lu)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～50％):(0～50％):(0～50％):(0～50％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1％～3％)@Gd或Y或La或Lu中任意一种或两种以上混合＝100％。
所述的上转换生物传感器的制备方法，包括以下具体步骤：
S1.在油酸包覆的UCNPs的环己烷溶液中加入无水醇振荡均匀，离心后将油酸包覆的UCNPs从环己烷中分离出来；将上述所得油酸包覆的UCNPs分散于盐酸溶液中，在20～50℃下超声，经离心，得到除油酸配体的UCNPs；
S2.将聚乙烯亚胺分散于超纯水中，逐滴加入除油酸配体的UCNPs搅拌，加入二乙二醇在100～110℃搅拌，然后在160～180℃水热反应，得到聚乙烯亚胺包覆的UCNPs，简写为UCNPs-PEI；
S3.将UCNPs-PEI分散于中性液中，加入戊二醛在黑暗环境中振荡，使UCNPs-PEI与戊二醛连接，用中性液洗去未反应的戊二醛后，重新分散于中性液中，再加入适配体振荡，得到适配体修饰的稀土掺杂上转换纳米颗粒溶液，简写为UCNPs@apt溶液；
S4.将猝灭剂加入超纯水中，超声、离心、保留上清液，制得猝灭剂溶液；
S5.在UCNPs@apt溶液中加入猝灭剂溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器。
优选地，步骤S1中所述无水醇为乙醇或甲醇；所述的油酸包覆的UCNPs和盐酸的物质的量比为0.1mmol:(0.1～0.3)mmol；所述油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒的粒径为15～60nm。
优选地，步骤S2中所述聚乙烯亚胺的物质的量、除油酸配体的UCNPs的物质的量和二乙二醇的体积的比为(0.006～0.018)mmol:(0.05～0.25)mmol:(6～12)mL，所述聚乙烯亚胺的物质的量和超纯水的体积比为(0.006～0.018)mmol:(8～12)mL；所述水热反应的时间为90～180min。
优选地，步骤S3中所述UCNPs-PEI、戊二醛和适配体的物质的量比为(0.05～0.2)mmol:(1～4)mmol:(12～24)nmol；所述中性液为超纯水或磷酸缓冲液；所述UCNPs-PEI的物质的量和中性液的体积比为(0.05～0.2)mmol:(5～15)mL
优选地，步骤S4中所述猝灭剂溶液的浓度为11.5～17.5mmol/L。
优选地，步骤S5中UCNPs@apt和猝灭剂材料的物质的量比为(0.05～0.2)mmol:(0.23～0.35)mmol；所述UCNPs@apt溶液的浓度为5～20mmol/L。
所述的上转换生物传感器在食品安全检测领域中的应用。
本发明上转换生物传感器由适配体修饰的上转换荧光探针和猝灭剂(MnO2纳米片或纳米氧化石墨烯中的一种以上)构成。适配体是由SELEX法进行富集和筛选、具有抗体功能的单链寡肽核苷酸，即一种单链DNA或RNA碱基序列，其特殊的立体结构能辨别特定的蛋白质，对目标检测物具有专一识别能力，用适配体修饰的上转换纳米颗粒可以实现对目标物质的定向检测；采用在200-800nm之间具有强且宽吸收峰的猝灭剂作为能量受体；由于猝灭剂通过特定作用力自发吸引适配体碱基序列，从而猝灭上转换荧光；在加入目标检测物质后，适配体定向识别目标检测物质，猝灭剂从生物传感器表面脱落，使得纳米探针的上转换荧光恢复。镧系离子掺杂上转换纳米颗粒(UCNPs)具有独特的光学性质，在近红外980nm激光照射，可有效避免背景荧光的干扰，同时UCNPs发出较低波长的光。与传统荧光试剂相比，UCNPs具有化学稳定性高、毒性低、量子产率高、发射峰窄、荧光寿命长、无背景干扰等优势，因此，基于上转换发光纳米探针构建的荧光传感器具有良好的潜在用途。该荧光传感器具有高选择性、高灵敏度、操作简单、价格低廉等优点，能够用于水相体系的检测，在食品安全生物检测领域具有良好的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明上转换生物传感器是由适配体修饰的上转换纳米荧光探针和猝灭剂组装而成，能够用于水相体系的检测。在近红外(如980nm)激光激发下，上转换荧光强度随着猝灭剂的浓度增加而降低；向体系中加入能够与上转换生物传感器中的适配体特异性结合的目标检测物质后，猝灭剂从上转换生物传感器表面脱落，使得荧光探针的上转换荧光得到恢复，在20min内即可实现对浓度在10～3000ng/mL目标检测物的定向检测，表明该上转换生物传感器可实现对目标待测物质的快速检测。
2.本发明采用共沉淀法合成油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒，对油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒表面去油酸并进行功能化，使其具有良好的水溶性；随后用适配体修饰该功能化的稀土掺杂上转换纳米颗粒，制得上转换荧光探针，并将上转换荧光探针与猝灭剂连接，组装成检测目标物质的上转换生物传感器。
3.本发明利用稀土掺杂上转换纳米颗粒的良好发光性能，近红外激发光穿透能力强，无背景干扰，使上转换生物传感器对目标物的检测具有高灵敏度；并且对油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒表面进行PEI功能化和适配体修饰，实现稀土掺杂上转换纳米颗粒良好的水溶性，使上转换生物传感器对目标检测物具有定向识别能力；同时猝灭剂具有成本低、吸收峰宽(200～800nm)、猝灭能力强的特点。
4.本发明的上转换生物传感器中由于猝灭剂的宽吸收峰和优异的吸收能力，与荧光材料(如稀土掺杂上转换、碳量子点等)的发射光谱重叠，可以猝灭稀土掺杂上转换纳米颗粒的荧光。本发明方法具有高选择性，高灵敏度，检测浓度线性范围宽，操作简单，成本低廉等优点。
附图说明
图1为实施例1中步骤1的结晶温度为300℃，NH4F:NaOH＝1.52:1(摩尔比)时核UCNPs样品的TEM照片。
图2为实施例2中各步骤制得的产物的TEM照片。
图3为实施例2中步骤1的油酸包覆的核-壳结构的上转换发光纳米颗粒以及实施例2中步骤3中聚乙烯亚胺包覆的核-壳结构的上转换发光纳米颗粒(UCNPs-PEI)的FT-IR图。
图4为实施例2中步骤3的水热反应合成PEI包覆的核-壳结构UCNPs，以及实施例2中步骤4的适配体修饰的UCNPs的Zeta电位分析谱图。
图5为实施例2中步骤6的在980nm激光激发，功率4W，积分时间800ms下的UCNPs@apt，UCNPs@apt@MnO2、UCNPs@apt@MnO2中加入ENR后的荧光谱图、以及实施例2中步骤5的二氧化锰在300-700nm的吸收谱。
图6为实施例2中步骤6的在980nm激光激发，功率4W，积分时间800ms下，UCNPs@apt(0.5g/L)中加入二氧化锰纳米片水溶液(0.06g/L)组装得到UCNPs@apt@MnO2传感器，并加入恩诺沙星浓度(10～3000ng/mL)响应的上转换发射荧光光谱。
图7为实施例2中步骤6上转换发射荧光强度与恩诺沙星浓度(10～3000ng/mL)的线性响应关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明专利采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明实施例使用日本HT7700透射电子显微镜对样品进行透射电镜表征，工作电压为100kV。使用美国Thermo-Filsher-Nicolet 6700，用溴化钾压片的方法，扫描范围4000～500cm-1，分辨率为2cm-1，扫描次数32。使用美国珀金埃尔默Lambda 950紫外-可见-近红外分光光度计对得到的样品进行检测，扫描波长范围185～800nm。使用英国ZetasizerNANOZS纳米粒度及Zeta电位分析仪进行Zeta电位分析。使用海洋光学USB2000+荧光光谱仪，对实施案例8～10得到的样品进行检测，积分时间800ms，扫描范围为300～700nm；以980nm的红外半导体激光器作为激发光源，激发功率为4W。
实施例1
1.(a)醋酸钇(1.6mL,0.2mol/L)、醋酸镱(0.36mL,0.2mol/L)、醋酸铒(0.08mL,0.1mol/L)、油酸(4mL)和1-十八烷烯(6mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(b)在含稀土-油酸配合物前驱体的反应液中加入NH4F(1.52mmol，0.4mol/L)和NaOH(1mmol，1mol/L)，将混合液升温至50℃反应30min；升温至110℃反应25min，除去甲醇；抽真空10min后升温至300℃，在氩气氛围下反应1h，得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na：(Y,Yb,Er)F4，简写为UCNPs-OA，其中核结构UCNPs-OA中Y：Yb：Er的摩尔百分比为80％：18％：2％。
(c)反应结束冷却至室温，将油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒反应液转移至离心管中，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，悬振均匀，6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(8mL,99.5％,)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，甲醇(4mL,99.5％)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体，得到处理的油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒；将UCNPs-OA分散在环己烷(6.5mL,99.5％)中，密封低温保存，得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒的环己烷分散液，标记为样品A1。
2.取样品A1(2mL)加入无水乙醇(2mL,99.5％)，振荡均匀后，6000rpm转速离心5min，将油酸包覆的UCNPs从乙醇中沉淀出来，除去上层液体；将所得油酸包覆的UCNPs分散于盐酸的水溶液(2mL,0.1M)中，28℃超声1h，15000rpm离心45min后收集所得颗粒；用超纯水洗涤2-3次后，将颗粒分散在2mL超纯水中，密封低温保存，得到除油酸配体的UCNPs，标记为样品A2。
3.称量聚乙烯亚胺(PEI)0.1g，分散于10mL超纯水中，逐滴加入样品A2(1.5mL)搅拌2h；加入二乙二醇(10mL)，将混合液升温至105℃，保温搅拌1h；冷却后转移至聚四氟乙烯内衬高压釜，于烘箱中160℃反应2h；将上述反应液以15000rpm，30min离心3次，用无水乙醇(0.5mL,99.5％)和超纯水洗涤2次，60℃烘干12h，得到PEI包覆的稀土掺杂上转换发光纳米颗粒，简写为UCNPs-PEI，标记为样品A3，密封低温保存。
4.称取30mg UCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol的恩诺沙星适配体(其序列为5'NH2-C6-CCCATCAGGGGGCTAGGCTAACACGGTTCGGCTCTCTGAGCCCGGGTTATTTCAGGGGGA-biotin-3'，由生工生物工程上海股份有限公司合成)，室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤2次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
5.使用二氧化锰纳米片作为猝灭剂来实施此方案，以下为二氧化锰纳米片的常规合成方法：取50mL烧杯放入磁子，加13.7mL超纯水，随后在搅拌的情况下，快速加入4.3mL，25％的四甲基氢氧化铵水溶液和2mL，30wt％双氧水溶液搅拌，得到20mL，0.6M的四甲基氢氧化铵与3wt％的H2O2混合溶液；将上述混合溶液中溶在15s内加入配制好的10mL,0.3M硝酸锰水溶液，剧烈搅拌12h，以2000rpm离心20min收集制备的固体二氧化锰，用甲醇和超纯水洗涤3次，60℃烘干24h，得到二氧化锰；称取25mg上述二氧化锰，溶于20mL超纯水中超声10h；2000rpm离心30min，上清液为二氧化锰纳米片溶液。
离心后的底部二氧化锰烘干称重，用总称取的二氧化锰的质量(25mg)减去未分散的二氧化锰的量，可知上清液内分散的二氧化锰的质量，二氧化锰纳米片溶液的浓度为0.926g/L。移取2.16mL，0.926g/L的二氧化锰纳米片溶液，加入7.84mL超纯水稀释至10mL,0.2g/L；
6.在步骤4中浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入步骤5所得二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用生物传感器上转换荧光强度的变化对目标检测物质恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为800，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为3000。结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
图1为实施例1中步骤1制得的结晶温度为300℃，NH4F:NaOH＝1.52:1(摩尔比)时核结构的UCNPs(样品A1)的TEM照片，从图1中可知，油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒的平均尺寸20nm。
实施例2
与实施例1不同的在于：步骤1中所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核-壳结构。
1.(a)醋酸钇(1.06mL,0.2mol/L)、醋酸镱(0.4mL,0.2mol/L)、醋酸钆(0.5mL,0.2mol/L)、醋酸铒(0.08mL,0.1mol/L)、油酸(4mL)及1-十八烷烯(6mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(b)在含稀土-油酸配合物前驱体的反应液中加入NH4F(1.52mmol，0.4mol/L)和NaOH(1mmol，1mol/L)，将混合液升温至50℃反应30min；升温至110℃反应25min，除去甲醇；抽真空10min后升温至300℃，在氩气氛围下反应1h，得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na:(Y,Yb,Gd,Er)F4，简写为“核UCNPs-OA”，其中“核UCNPs-OA”中Y:Yb:Gd:Er的摩尔百分比为53％:20％:25％:2％；所述油酸包覆的核结构的稀土掺杂上转换纳米颗粒的粒径为18～24nm。
(c)将油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒反应液转移至离心管中，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，悬振均匀，6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(8mL,99.5％,)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，甲醇(4mL,99.5％)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体，得到处理的油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒；将“核UCNPs-OA”分散在环己烷(6.5mL,99.5％)中，密封低温保存，得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒的环己烷分散液，标记为样品B1；
(d)醋酸钆(2mL,0.2mol/L)、油酸(3mL)和1-十八烷烯(7mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(e)将(c)中得到的油酸包覆的“核-UCNPs”的环己烷分散液B1(3mL)，NH4F(1.52mmol,0.4mol/L)和NaOH(1mmol,1mol/L)加入至含稀土-油酸配合物前驱体的反应液中；将混合液升温至50℃反应30min；升温至110℃反应25min，除去甲醇；抽真空10min后升温至300℃，在氩气的氛围下反应1h，得到油酸包覆的核-壳结构的稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na:(Y,Yb,Gd,Er)F4@NaGdF4，简写为核-壳结构UCNPs-OA，其中核结构中Y:Yb:Gd:Er的摩尔百分比为53％:20％:25％:2％，壳结构中Gd＝100mol％。所述油酸包覆的核-壳结构的稀土掺杂上转换纳米颗粒的粒径为28～32nm。
(f)将油酸包覆的核-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒反应液转移至离心管中，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，悬振均匀，6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(8mL,99.5％,)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，甲醇(4mL,99.5％)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体，得到处理的油酸包覆的核-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒；将核-壳结构UCNPs-OA分散于环己烷(3mL,99.5％)中，标记为样品B2。
其余步骤与实施例1中步骤一致，利用该生物传感器上转换荧光强度的变化对目标检测物质恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为1500，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为6500。结果表明，结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
图2为实施例2中各步骤制得的产物的TEM照片。其中，(a)为步骤1(c)制得的样品B1的核结构的UCNPs；(b)为步骤1(f)制得的样品B2的核-壳结构UCNPs；(c)为步骤3的PEI包覆核-壳结构UCNPs(UCNPs-PEI)，(d)为步骤4的适配体修饰的核-壳结构UCNPs(UCNPs@apt)。(e)为步骤5合成的MnO2纳米片，(f)为步骤6适配体修饰的核-壳结构UCNPs与MnO2纳米片组装的传感器(UCNPs@apt@MnO2)。从图2(a)中可知，油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒的平均尺寸16nm。从图2中(b)可知，油酸包覆的核-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒的平均尺寸25nm。由图2(c)可以看出，包覆上PEI后，上转换发光纳米颗粒的平均尺寸25nm；从图2(d)中可知，PEI包覆和适配体表面修饰后，对核-壳结构UCNPs表面形貌基本无影响，核-壳结构UCNPs平均尺寸25nm。由图2(e)可知，二氧化锰纳米片粒径约为300nm。由图2(f)可知可以看出在二氧化锰纳米片表面吸附大量的适配体修饰的核-壳结构上转换纳米颗粒。
图3为实施例2中步骤1制备的“油酸包覆的核-壳结构UCNPs”和实施例2中步骤3制备的PEI包覆的核-壳结构上转换纳米颗粒(UCNPs-PEI)的FT-IR光谱图。如图3所示，PEI包覆的核-壳结构纳米颗粒(UCNPs-PEI)在1635cm-1(N-H的弯曲振动)和1384cm-1(C-N键的拉伸振动)有明显的吸收带，说明“油酸包覆的核-壳结构UCNPs”表面油酸配体除去后，PEI配体成功包覆到颗粒表面。
图4为实施例2步骤4中PEI包覆的核-壳结构上转换纳米颗粒以及步骤6中适配体修饰的核-壳结构上转换纳米颗粒的Zeta电位，PEI包覆的核-壳结构上转换纳米颗粒的Zeta电位为正，其值为37.1mV。PEI包覆的核-壳结构上转换纳米颗粒修饰适配体后，由于DNA适配体带负电荷，其值为-17.3mV，这个结果表明适配体成功修饰到上转换纳米探针上。
图5为实施例2步骤5中二氧化锰纳米片的吸收光谱，和实施例2步骤6适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)、适配体修饰的UCNPs与二氧化锰纳米片组装成的生物传感器(UCNPs@apt@MnO2)、体系上转换荧光强度对恩诺沙星浓度响应(UCNPs@apt@MnO2+ENR)的980nm激光激发的上转换发射光谱。从图5中可知，二氧化锰纳米片在300～700nm有强且宽的吸收峰，与上转换纳米颗粒的荧光光谱重叠，上转换纳米颗粒与二氧化锰之间的发生频率共振能量传递，二氧化锰可以猝灭上转换荧光；向生物传感器溶液体系中加入恩诺沙星以后，适配体特异性识别恩诺沙星，使得二氧化锰纳米片从传感器表面脱落，使得生物传感器溶液体系荧光恢复。
图6为实施例2中步骤6在适配体修饰的UCNPs(0.5g/L)、二氧化锰纳米片(0.06g/L)组装形成的传感器溶液中，随着恩诺沙星浓度(10～3000ng/mL)的增加，体系的980nm激光激发的上转换荧光逐渐增强。
图7为本实施例中步骤6恩诺沙星(ENR)在10～3000ng/mL浓度范围内，Log[c(ENR)]与980nm激光激发的上转换荧光强度(光谱积分范围500.23～570.03nm)之间的线性曲线。从图7中可知，回归线性方程为y＝24543.5x-3482.7，具有良好的线性相关，表明该上转换生物传感器能够对恩诺沙星的浓度进行检测，证明该生物传感器的应用成功。
实施例3
与实施例1不同的在于：步骤1中所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核-壳-壳结构：
(a)醋酸镱(1mL,0.2mol/L)、醋酸钕(1mL,0.2mol/L)、油酸(4mL)及1-十八烷烯(6mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(b)在含稀土-油酸配合物前驱体的反应液中加入NH4F(1.52mmol，0.4mol/L)和NaOH(1mmol，1mol/L)，将混合液升温至50℃反应30min；升温至110℃反应25min，除去甲醇；抽真空10min后升温至300℃，在氩气氛围下反应1h，得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na：(Yb,Nd)F4，简写为“核UCNPs-OA”，其中“核UCNPs-OA”中Yb:Nd的摩尔百分比为50％:50％。
(c)反应结束冷却至室温，将油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒反应液转移至离心管中，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，悬振均匀，6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(8mL,99.5％,)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，甲醇(4mL,99.5％)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体，得到处理的油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒；将“核UCNPs-OA”分散在环己烷(6.5mL,99.5％)中，密封低温保存，得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒的环己烷分散液，标记为样品C1。
(d)醋酸镱(1mL,0.2mol/L)、醋酸钆(0.96mL,0.2mol/L)、醋酸铒(0.08mL,0.1mol/L)、油酸(4mL)和1-十八烷烯(6mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(e)将(c)中得到的油酸包覆的“核-UCNPs”的环己烷分散液(3mL)样品C1、NH4F(1.52mmol,0.4mol/L)和NaOH(1mmol,1mol/L)加入至含稀土-油酸配合物前驱体的反应液中；将混合液升温至50℃反应30min；升温至110℃反应25min，除去甲醇；抽真空10min后升温至300℃，在氩气的氛围下反应1h，得到油酸包覆的核-壳结构的稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na：(Yb,Nd)F4@Na：(Yb,Gd,Er)F4，简写为核-壳结构UCNPs-OA，其中核结构中Yb:Nd的摩尔百分比为50％:50％。壳结构中Yb:Gd:Er的摩尔百分比为50％:48％:2％。
(f)将油酸包覆的核-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒反应液转移至离心管中，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，悬振均匀，6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(8mL,99.5％,)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，甲醇(4mL,99.5％)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体，得到处理的油酸包覆的核-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒；将核-壳结构UCNPs-OA分散于环己烷(3mL,99.5％)中，标记为样品C2。
(g)醋酸钆(2mL,0.2mol/L)、油酸(4mL)和1-十八烷烯(6mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(h)将(f)中得到的油酸包覆的核-壳结构UCNPs-OA的环己烷分散液(3mL)样品C2、NH4F(1.52mmol,0.4mol/L)和NaOH(1mmol,1mol/L)加入至含稀土-油酸配合物前驱体的反应液中；将混合液升温至50℃反应30min；升温至110℃反应25min，除去甲醇；抽真空10min后升温至300℃，在氩气的氛围下反应1h，得到油酸包覆的核-壳-壳结构的稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na：(Yb,Nd)F4@Na：(Yb,Gd,Er)F4@NaGdF4，简写为核-壳-壳结构UCNPs-OA，其中核结构中Yb:Nd的摩尔百分比为50％:50％，内层壳结构中Yb:Gd:Er的摩尔百分比为50％:48％:2％，外层壳结构中Gd的摩尔百分比为100％。
(i)将油酸包覆的核-壳-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒反应液转移至离心管中，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，悬振均匀，6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(8mL,99.5％,)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体；加入环己烷(4mL,99.5％)，悬振均匀，加入无水乙醇(4mL,99.5％)，甲醇(4mL,99.5％)，混合均匀，以6000rpm离心3min，倒去上层液体，得到处理的油酸包覆的核-壳-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒；将核-壳-壳结构UCNPs-OA分散于环己烷(3mL,99.5％)中，标记为样品C3。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片(300～800nm)溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器上转换荧光强度的变化对目标检测物质恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为2000，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为10000。结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
实施例4
与实施例1不同的在于：步骤1中所述核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒中稀土为钇、镱、铥。(a)醋酸钇(1.6mL,0.2mol/L)、醋酸镱(0.36mL,0.2mol/L)、醋酸铥(0.08mL,0.1mol/L)、油酸(4mL)和1-十八烷烯(6mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(b)在含稀土-油酸配合物前驱体的反应液中加入NH4F(1.52mmol，0.4mol/L)和NaOH(1mmol，1mol/L)，将混合液升温至50℃反应30min；升温至110℃反应25min，除去甲醇；抽真空10min后升温至300℃，在氩气氛围下反应1h，得到油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na:(Y,Yb,Tm)F4，简写为核UCNPs-OA，其中核结构中Y:Yb:Tm的摩尔百分比为80％：18％：2％。
(c)方法同实施例1中步骤1(c)，将核结构UCNPs-OA分散于环己烷(6.5mL,99.5％)中，标记为样品D1。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器上转换荧光强度的变化对目标检测物质恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为800，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为3000。结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
实施例5
与实施例2不同的在于：步骤1中所述核-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒中核UCNPs-OA”中Y：Gd：Tm的摩尔百分比为80％：18％：2％，壳结构中Gd＝100mol％。具体地，步骤1中(a)醋酸钇(1.6mL,0.2mol/L)、醋酸钆(0.36mL,0.2mol/L)、醋酸铥(0.08mL,0.1mol/L)、油酸(4mL)及1-十八烷烯(6mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(b)得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na：(Y,Gd,Tm)F4，简写为“核UCNPs-OA”，其中“核UCNPs-OA”中Y:Gd:Tm的摩尔百分比为80％:18％:2％。
(c)将“核UCNPs-OA”分散在环己烷(6.5mL,99.5％)中，密封低温保存，得到油酸包覆的核结构稀土掺杂上转换纳米颗粒的环己烷分散液，标记为样品E1。
(d)醋酸钆(2mL,0.2M)、油酸(3mL)和1-十八烷烯(7mL)加入至二口烧瓶中；在加热套中加热至160℃反应30min，除去反应体系中的水，冷却至室温，得到含稀土-油酸配合物前驱体的反应液；
(e)得到油酸包覆的核-壳结构的稀土掺杂上转换纳米颗粒，其组成为Na：(Y,Gd,Tm)F4@NaGdF4，简写为核-壳结构UCNPs-OA，其中核结构中Y:Gd:Tm的摩尔百分比为80％:18％:2％，壳结构中Gd＝100mol％。
(f)得到油酸包覆的核-壳结构稀土掺杂上转换纳米颗粒；将核-壳结构UCNPs-OA分散于环己烷(3mL,99.5％)中，标记为样品E2。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器上转换荧光强度的变化对目标检测物质恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为1500，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为6500。结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
实施例6
与实施例1不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol妥布霉素的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤2次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物妥布霉素进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为800，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为3000。结果表明，在妥布霉素浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与妥布霉素的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对妥布霉素的检测。
实施例7
与实施例2不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol妥布霉素的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤两次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物妥布霉素的浓度进行检测。当在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为1500，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为6500。结果表明，在妥布霉素浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与妥布霉素的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对妥布霉素的检测。
实施例8
与实施例3不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol妥布霉素的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤两次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物妥布霉素的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为2000，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为10000。结果表明，在妥布霉素浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与妥布霉素的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对妥布霉素的检测。
实施例9
与实施例1不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol氧化乐果的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤2次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物氧化乐果的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为800，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为3000。结果表明，在氧化乐果浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与氧化乐果的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对氧化乐果的检测。
实施例10
与实施例2不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol氧化乐果的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤两次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物氧化乐果的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为1500，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为6500。结果表明，在氧化乐果浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与氧化乐果的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对氧化乐果的检测。
实施例11
与实施例3不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol氧化乐果的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤两次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物氧化乐果的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为2000，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为10000。结果表明，在氧化乐果浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与氧化乐果的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对氧化乐果的检测。
实施例12
与实施例1不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol卡那霉素的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤两次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物卡那霉素的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为800，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为3000。结果表明，在卡那霉素浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与卡那霉素的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对卡那霉素的检测。
实施例13
与实施例2不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol卡那霉素的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤两次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物卡那霉素的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为1500，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为6500。结果表明，在卡那霉素浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与卡那霉素的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对卡那霉素的检测。
实施例14
与实施例3不同的在于：步骤4中称取30mgUCNPs-PEI分散在5mL超纯水中，加入1.25mL,25％的戊二醛溶液，转移至棕色瓶中振荡2h，使UCNPs-PEI表面氨基与戊二醛连接；将上述溶液以8500rpm离心10min，收集纳米颗粒，用超纯水洗涤2次，分散在10mL超纯水中；加入17.7nmol卡那霉素的适配体(由生工生物工程上海股份有限公司合成)，再室温振荡12h，随后8500rpm离心10min，用超纯水洗涤两次，所得适配体修饰的UCNPs(UCNPs@apt)分散在10mL超纯水中，所得UCNPs@apt溶液的浓度为3g/L并在4℃保存。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入二氧化锰纳米片溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物卡那霉素的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为2000，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为10000。结果表明，在卡那霉素浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与卡那霉素的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对卡那霉素的检测。
实施例15
与实施例1不同的在于：步骤5中使用的猝灭剂为纳米氧化石墨烯(500～2000nm)，称取25mg氧化石墨烯，溶于20mL超纯水中超声10h；2000rpm离心30min，上清液为纳米氧化石墨烯溶液。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入纳米氧化石墨烯溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为800，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为3000。结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
实施例16
与实施例2不同的在于：步骤5中使用的猝灭剂为纳米氧化石墨烯(500～2000nm)，称取25mg氧化石墨烯，溶于20mL超纯水中超声10h；2000rpm离心30min，上清液为氧化石墨烯溶液。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入纳米氧化石墨烯溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为1500，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为6500。结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
实施例17
与实施例3不同的在于：步骤5中使用的猝灭剂为纳米氧化石墨烯(500～2000nm)，称取25mg氧化石墨烯，溶于20mL超纯水中超声10h；2000rpm离心30min，上清液为氧化石墨烯溶液。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入纳米氧化石墨烯溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物恩诺沙星的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为2000，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为10000。结果表明，在恩诺沙星浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与恩诺沙星的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对恩诺沙星的检测。
实施例18
与实施例9不同的在于：步骤5中使用的猝灭剂为纳米氧化石墨烯(500～2000nm)来实施此方案，称取25mg氧化石墨烯，溶于20mL超纯水中超声10h；2000rpm离心30min，上清液为氧化石墨烯溶液。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入纳米氧化石墨烯溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物氧化乐果的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为800，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为3000。结果表明，在氧化乐果浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与氧化乐果的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对氧化乐果的检测。
实施例19
与实施例8不同的在于：步骤5中使用的猝灭剂为纳米氧化石墨烯(500～2000nm)来实施此方案，称取25mg氧化石墨烯，溶于20mL超纯水中超声10h；2000rpm离心30min，上清液为氧化石墨烯溶液。
步骤6中在浓度为3g/L的UCNPs@apt溶液中加入纳米氧化石墨烯溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器，利用该生物传感器对目标检测物妥布霉素的浓度进行检测。在浓度为10ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为2000，当浓度为3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度为10000。结果表明，在妥布霉素浓度为10～3000ng/mL时，上转换生物传感器的荧光强度与妥布霉素的浓度对数成线性响应，说明该上转换生物传感器能够用于对妥布霉素的检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种上转换生物传感器，其特征在于，所述上转换生物传感器是由上转换荧光探针和猝灭剂组成，所述上转换荧光探针为适配体修饰的稀土掺杂上转换纳米颗粒，简写为UCNPs@apt；其中，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为NaReF4，简写为UCNPs，所述UCNPs@apt是在除油酸配体后UCNPs表面用PEI功能化，得到PEI包覆的UCNPs，再将PEI包覆的UCNPs与适配体结合构成；所述猝灭剂为MnO2纳米片或纳米氧化石墨烯。
2.根据权利要求1所述的上转换生物传感器，其特征在于，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核结构的NaReF4、核-壳结构的NaReF4@NaReF4、核-壳-壳结构的NaReF4@NaReF4@NaReF4，所述Re为Gd、Nd、Y、La、Lu、Yb、Er、Tm、Ho、Tb、Eu、Dy、Sm中的一种以上；所述适配体为恩诺沙星适配体、妥布霉素适配体、环丙沙星适配体、马波沙星适配体、依诺沙星适配体、诺氟沙星适配体、卡布霉素适配体、卡马西平适配体、玉米赤霉烯酮适配体、金霉素适配体、青霉素G适配体、氧化乐果适配体、草甘膦适配体、四环素适配体、庆大霉素适配体中的一种以上。
3.根据权利要求2所述的上转换生物传感器，其特征在于，所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核结构的NaReF4时，所述Re为Yb:Gd:La:Y:Lu:Er或Tm或Ho的摩尔百分比＝(10～100％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)；
所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核-壳结构的NaReF4@NaReF4时，所述Re为(Yb:Gd:La:Y:Lu:Er或Tm或Ho)@(Gd或Y或La或Lu)的摩尔百分比＝(10～100％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@Gd或Y或La或Lu中任意一种或两种以上混合＝100％；所述Re为(Yb:Gd:Y:La:Lu:Tm)@(Gd:Y:La:Lu:Tb或Eu或Dy或Sm)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(1～20％)；所述Re为(Nd:Yb:Gd:Y:La:Lu)@(Yb:Gd:Y:La:Lu:Er或Tm或Ho)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～50％):(0～50％):(0～50％):(0～50％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)；
所述稀土掺杂上转换纳米颗粒为核-壳-壳结构的NaReF4@NaReF4@NaReF4时，所述Re为(Yb:Gd:Y:La:Lu:Tm)@(Gd:Y:La:Lu:Tb或Eu或Dy或Sm)@(Gd或Y或La或Lu)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(1～20％)@Gd或Y或La或Lu中任意一种或两种以上混合＝100％；
所述Re为(Nd:Yb:Gd:Y:La:Lu)@(Yb:Gd:Y:La:Lu:Tm)@(Gd:Y:La:Lu:Tb或Eu或Dy或Sm)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～50％):(0～50％):(0～50％):(0～50％)@(10～90％):(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1～3％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(1～20％)；
所述Re为(Nd:Yb:Gd:Y:La:Lu)@(Yb:Gd:Y:La:Lu:Er或Ho)@(Gd或Y或La或Lu)的摩尔百分比＝(10～90％):(10～90％):(0～50％):(0～50％):(0～50％):(0～50％)@(10～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0～90％):(0.1％～3％)@Gd或Y或La或Lu中任意一种或两种以上混合＝100％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的上转换生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1.在油酸包覆的UCNPs的环己烷溶液中加入无水醇振荡均匀，离心后将油酸包覆的UCNPs从环己烷中分离出来；将上述所得油酸包覆的UCNPs分散于盐酸溶液中，在20～50℃下超声，经离心，得到除油酸配体的UCNPs；
S2.将聚乙烯亚胺分散于超纯水中，逐滴加入除油酸配体的UCNPs搅拌，加入二乙二醇在100～110℃搅拌，然后在160～180℃水热反应，得到聚乙烯亚胺包覆的UCNPs，简写为UCNPs-PEI；
S3.将UCNPs-PEI分散于中性液中，加入戊二醛在黑暗环境中振荡，使UCNPs-PEI与戊二醛连接，用中性液洗去未反应的戊二醛后，重新分散于中性液中，再加入适配体振荡，得到适配体修饰的稀土掺杂上转换纳米颗粒溶液，简写为UCNPs@apt溶液；
S4.将猝灭剂加入超纯水中，超声、离心、保留上清液，制得猝灭剂溶液；
S5.在UCNPs@apt溶液中加入猝灭剂溶液，室温孵育10～20min，组装得到上转换生物传感器。
5.根据权利要求4所述的上转换生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述无水醇为乙醇或甲醇；所述的油酸包覆的UCNPs和盐酸的物质的量比为0.1mmol:(0.1～0.3)mmol；所述油酸包覆的稀土掺杂上转换纳米颗粒的粒径为15～60nm。
6.根据权利要求4所述的上转换生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述聚乙烯亚胺的物质的量、除油酸配体的UCNPs的物质的量和二乙二醇的体积的比为(0.006～0.018)mmol:(0.05～0.25)mmol:(6～12)mL，所述聚乙烯亚胺的物质的量和超纯水的体积比为(0.006～0.018)mmol:(8～12)mL；所述水热反应的时间为90～180min。
7.根据权利要求4所述的上转换生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述UCNPs-PEI、戊二醛和适配体的物质的量比为(0.05～0.2)mmol:(1～4)mmol:(12～24)nmol；所述中性液为超纯水或磷酸缓冲液；所述UCNPs-PEI的物质的量和中性液的体积比为(0.05～0.2)mmol:(5～15)mL。
8.根据权利要求4所述的上转换生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述猝灭剂溶液的浓度为11.5～17.5mmol/L。
9.根据权利要求4所述的上转换生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤S5中UCNPs@apt和猝灭剂材料的物质的量比为(0.05～0.2)mmol:(0.23～0.35)mmol；所述UCNPs@apt溶液的浓度为5～20mmol/L。
10.权利要求1-3任一项所述的上转换生物传感器在食品安全检测领域中的应用。
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