CN111175266B - 一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法,涉及分析化学和纳米材料技术领域。首先合成稀土掺杂的UCNPs,将与靶标分子有特异性亲和的DNA1修饰在UCNPs上,采用与DNA1序列部分互补的核酸DNA2连接上荧光猝灭基团;通过碱基互补配对原则,使UCNPs与荧光猝灭基团之间的距离拉近,从而发生荧光能量共振转移诱导UCNPs发生荧光猝灭;加入检测样品后,检测样品中靶标分子优先与DNA1结合导致双链解离,使UCNPs与荧光猝灭基团距离增加,从而发生荧光恢复;通过检测UCNPs在980nm近红外光激发下的发光强度的变化,对照相应荧光强度标准线性图,定量检测样品中靶标分子的含量。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学和纳米材料技术领域,尤其是涉及基于上转换纳米颗粒(UCNPs)与荧光猝灭基团的一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法。
背景技术
生物传感器是一种以生物活性物质(如细胞、抗体、抗原、核酸、蛋白质等)作为敏感基元,来进行目标分析物灵敏选择性检测的分析装置。作为一种交叉融合的新兴技术,生物传感器具有灵敏度高、易于微型化集成化、分析速度快等优点,因而近年来在分析化学领域得到了飞速的发展,并成为广大科研工作者们的热点问题。
与传统的分析方法相比,生物传感器作为一种基于学科交叉发展起来的新型分析技术,具有快速、准确、灵敏、简单等众多特点,因而在抗生素与蛋白质肿瘤标志物的检测方面具有十分重要的发展前景。同时,随着精准医疗、基因测试、法医鉴定、环境检测等研究领域的发展,实现对生物分子的快速、灵敏、简单的痕量分析检测也越来越重要,由此对生物传感分析方法的构建提出了更高的要求,从而促使科研工作者们致力于提高生物传感器的灵敏度,以实现对低丰度目标分析物的准确检测。
UCNPs是一种能吸收低能量的近红外光而发射高能量的可见光光子的新型发光材料,其具有荧光发射峰窄、荧光寿命长,化学和光稳定性高等优点(Qiu P,Zhou N,Chen H,Zhang C,Gao G,Cui D.Nanoscale,2013,5(23):11512-11525;Chen H,Fang A,Zhang Y,Yao S.Talanta,2017,174:148-155),相对于传统的荧光染料不存在光漂白、光降解,以及在生物体中自身背景荧光等问题,在生物成像及检测领域有着广泛的应用(Zhou J,Liu Z,Li F.Upconversion nanophosphors for small-animal imaging[J].Chemical SocietyReviews,2012,41(3):1323-1349;Xu S,Xu S,Zhu Y,et al.A novel upconversion,fluorescence resonance energy transfer biosensor(FRET)for sensitive detectionof lead ions in human serum[J].Nanoscale,2014,6(21):12573-12579;Ye W W,TsangM K,Liu X,et al.Upconversion Luminescence Resonance Energy Transfer(LRET)-Based Biosensor for Rapid and Ultrasensitive Detection of Avian InfluenzaVirus H7 Subtype[J].Small,2014,10(12):2390-2397)。UCNPs通过不同的离子参杂可以改变其发射光的波长(Deng R,Qin F,Chen R,et al.Temporal full-colour tuningthrough non-steady-state upconversion[J].Nature nanotechnology,2015,10(3):237-242),通过选择对应波长范围的猝灭基团,可实现荧光能量共振转移诱导UCNPs产生荧光猝灭。
发明内容
本发明的目的在于提供基于上转换纳米颗粒(UCNPs)与荧光猝灭基团的一种近红外荧光生物传感器的构建方法。
本发明的另一目的在于提供可减少检测误差的一种近红外荧光生物传感器的检测方法。
所述近红外荧光生物传感器的构建方法,包括以下步骤:
1)制备上转换纳米颗粒(UCNPs);
2)将上转换纳米颗粒(UCNPs)分散在含有盐酸的乙醇溶液中,超声去除UCNPs表面的油酸分子,对UCNPs进行表面改性;
3)在改性后的UCNPs表面修饰与靶标分子有特异性亲和的DNA1,制备UCNPs-DNA1;
4)构建UCNPs-DNA1与荧光猝灭基团的近红外荧光纳米生物传感器。
在步骤1)中,所述制备上转换纳米颗粒(UCNPs)的具体方法可为:将0.5mmol的YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O与TmCl3·6H2O混合物加入1~5mL油酸(Oleic acid,OA)和5~10mL1-十八烯(1-Octadecene,ODE)中,在50~100mL容器中搅拌均匀,在真空环境下加热反应,自然冷却至室温,再加入5mL含有NH4F和NaOH的甲醇溶液,搅拌加热以除去溶液中的甲醇,然后抽真空通氮气,梯度升温,并在氮气氛围下保温;待升温反应结束后自然冷却,离心,收集产物,重新分散在5~10mL环己烷溶剂中,加入2~5mL水/乙醇混合溶液,震荡后静置分层过夜,收集上层溶液,即得UCNPs,再分散于5~10mL环己烷溶剂中于4℃下保存备用;
所述YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O的配比可为0.3635︰0.135︰0.15;YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O混合物中n(Y3+):n(Yb3+):n(Tm3+)=72.7︰27︰0.3;所述加热反应的温度可为120~130℃,加热反应的时间可为1~2h;所述甲醇溶液中NH4F和NaOH的配比可为(1~4)︰(0.0625~0.25);所述搅拌加热的温度可为80℃;所述梯度升温可升至280~310℃;所述在氮气氛围下保温的时间可为0.5~2h;所述离心可以8000~12000r/min离心10~30min;所述水/乙醇混合溶液中水和乙醇的体积比可为1︰1;所述震荡可震荡至少2次。
在步骤2)中,所述对UCNPs进行表面改性的具体方法可为:取1~10mg油酸分子包裹的UCNPs,第一次离心后将离心产物分散于1~10mL含有盐酸的乙醇溶液中,超声去除UCNPs表面的油酸分子,然后第二次离心,弃去上清液,再将离心产物分散于3~10mL含有盐酸水乙醇溶液中纯化,再第三次离心后弃上清,将产物分散在1~10mL水中备用。
所述第一次离心的速率可为8000~12000r/min,第一次离心的时间可为10~30min;所述含有盐酸的乙醇溶液的pH可为2~5;所述超声的时间可为0.5~1h;所述第二次离心的速率可为8000~13000r/min,第二次离心的时间可为10~20min;所述第三次离心的速率可为8000~13000r/min,第三次离心的时间可为10~20min;所述水可采用超纯水;所述产物分散在水中的最终浓度1mg/mL。
在步骤3)中,所述制备UCNPs-DNA1的具体方法可为:取步骤2)所得的1mL水溶性UCNPs,加入不同浓度的DNA1水溶液,搅拌后离心,离心产物重分散在5~10mL的水或Tris-HCL缓冲液中;
所述不同浓度的DNA1水溶液的浓度可为0.1~100μM;所述搅拌可400~600rpm搅拌6~24h;所述离心的速率可为8000~13000r/min,离心的时间可为10~20min;所述水可采用超纯水;所述Tris-HCL缓冲液可为20~50mM,5~50mM MgCl2,50~100mM NaCl,pH 7.4~8;Tris-HCL缓冲液优选20mM,5mM MgCl2,50mM NaCl,pH 7.4;
所述DNA1通过5’末端官能化基团与稀土离子强配位作用修饰在UCNPs表面,所述DNA1的5’末端官能化基团包括但不局限于羧酸基团、磷酸基团、磺酸基团等中的一种;
所述DNA1序列为:5’-TTTTTTTTTCTTGCCTACGCCACTAGCTC-3’或
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
在步骤4)中,所述构建UCNPs-DNA1与荧光猝灭基团的近红外荧光纳米生物传感器的具体方法可为:将UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液以不同比例在Tris-HCL缓冲液中混合,总体积为200μL,然后置于37℃恒温摇床中反应,反应结束后,将溶液离心,将近红外荧光纳米生物传感器分散在1~5mL Tris-HCL缓冲液中。
所述UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液的摩尔比可为1︰(0.1~10),优选1︰1;所述反应的时间可为1~3h;所述离心的速率可为8000~12000r/min,离心的时间可为10~20min;所述Tris-HCL缓冲液可为20~50mM,5~50mM MgCl2,50~100mM NaCl,pH 7.4~8,优选20mM,5mM MgCl2,50mM NaCl,pH 7.4。
所述荧光猝灭基团包括但不局限于BHQ1、BHQ2、TAMRA、金纳米颗粒、氧化石墨烯等中的一种;所述荧光猝灭基团修饰有与DNA1部分互补的DNA2;所述DNA2序列为:5’-GTGGCGTAGGCAAGTTTTTTTTT-3’或5’-AGACAACACGTGCCCAAC-3’。
所述近红外荧光生物传感器的检测方法,包括以下步骤:
1)绘制荧光强度标准线性图:
配置5~50μL不同梯度浓度的靶标分子标准溶液加入100~200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中,震荡孵育形成检测溶液,在980nm近红外激光激发下测量检测上述不同梯度浓度的靶标分子标准溶液在特定波长处的荧光强度值,将其标准浓度与检测时荧光强度一一对应绘制成荧光强度标准线性图。
2)对样品进行检测:
将检测样品分散在200μL Tris-HCL缓冲液中,然后将5~50μL检测样品加入100~200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中,震荡孵育形成检测溶液,在980nm近红外激光激发下测量检测溶液在特定波长处的荧光强度值,再对照相应的荧光强度标准线性图,定量计算样品中靶标分子的含量。
在步骤1)或2)中,所述震荡孵育的时间可为30~60min;所述特定波长可选择波长540nm和806nm。
在步骤2)中,所述Tris-HCL缓冲液可为20mM,5mM MgCl2,50mMNaCl,pH 7.4。
本发明首先合成稀土掺杂的UCNPs。特别的,避开复杂的化学修饰步骤,通过最简单直接的方式将与靶标分子有特异性亲和的DNA1修饰在UCNPs上。采用与DNA1序列部分互补的核酸DNA2连接上荧光猝灭基团。通过碱基互补配对原则,使得UCNPs与荧光猝灭基团之间的距离拉近,从而发生荧光能量共振转移诱导UCNPs发生荧光猝灭。加入检测样品后,检测样品中靶标分子优先与DNA1结合导致双链解离,使得UCNPs与荧光猝灭基团距离增加,从而发生荧光恢复。通过检测UCNPs在980nm近红外光激发下的发光强度的变化,对照相应的荧光强度标准线性图。定量检测样品中靶标分子的含量。
与现有技术相比,本发明的具有以下突出的优点:
1)稀土离子掺杂的UCNPs具有荧光发射峰窄,反Stokes位移大,荧光寿命长化学和光稳定性高的优点,可以最大限度地减少荧光材料本身光漂白等问题带来的检测误差。
2)采用DNA作为UCNPs与荧光猝灭基团之间的连接桥梁,相比其他化学连接的步骤有很大程度的简化,而且DNA作为近红外荧光纳米传感器的识别器件,具有较高的特异性与响应能力。
3)通过不同稀土离子掺杂的UCNPs,改变其发射光的波长,进一步的可以选择相应波长吸收的荧光猝灭基团,从而大大增大近红外荧光生物传感器的适用范围。
4)基于UCNPs与荧光猝灭基团的近红外荧光生物传感器,UCNPs与荧光猝灭基团形成荧光共振能量转移体系,可以有效避免在紫外-可见的激光下带来的生物分子的背景荧光干扰。
5)UCNPs与荧光猝灭基团形成荧光共振能量转移体系,可以有效避免在紫外-可见的激光下带来的生物分子的背景荧光干扰。
6)本发明可广泛应用于核酸、毒素、金属离子、农药等外源性小分子污染物的检测。
附图说明
图1为基于上转换纳米颗粒(UCNPs)与荧光猝灭基团金纳米笼(AuNCs)的近红外荧光生物传感器检测肿瘤循环DNA(ctDNA)的方法的原理图。
图2为UCNPs与近红外荧光纳米生物传感器的TEM图。
图3为UCNPs修饰DNA1前后的紫外吸收表征对比图。
图4为不同浓度ctDNA加入含有近红外荧光纳米生物传感器的溶液后的荧光光谱变化图。
图5为加入ctDNA之后的近红外荧光纳米生物传感器溶液在806nm处的荧光强度与ctDNA浓度的对数之间的荧光强度标准线性图。同一浓度分别进行3次独立的单样测试。
图6为基于上转换纳米颗粒(UCNPs)和猝灭基团BHQ1的近红外荧光生物传感器检测黄曲霉毒素B1的方法的原理图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
所述近红外荧光生物传感器的构建方法,包括以下步骤:
1)制备上转换纳米颗粒(UCNPs):将0.3635mmol的YCl3·6H2O,0.135mmol的YbCl3·6H2O和0.15mmol的TmCl3·6H2O(n(Y3+):n(Yb3+):n(Tm3+)=72.7︰27︰0.3,YCl3·6H2O,YbCl3·6H2O和TmCl3·6H2O共0.5mmol)与1~5mL油酸(Oleic acid,OA)和5~10mL 1-十八烯(1-Octadecene,ODE)在50~100mL容器中搅拌均匀,在真空环境下加热至120~130℃,保持1~2h,自然冷却至室温,再加入含有1~4mmol NH4F和0.0625~0.25mmol NaOH的5mL甲醇溶液,搅拌加热至80℃以除去溶液中的甲醇,然后抽真空通氮气,梯度升温至280~310℃,并在氮气氛围下保温0.5~2h;待反应结束后自然冷却,以8000~12000r/min的速度离心10~30min,收集产物,重新分散在5~10mL环己烷溶剂中,再加入2~5mL水/乙醇混合溶液(VWater/VEthanol=1︰1),轻微震荡数次后静置分层过夜,收集上层溶液,即得UCNPs,分散于5~10mL的环己烷中于4℃下保存备用。
2)将上转换纳米颗粒(UCNPs)分散在含有盐酸的乙醇溶液中,超声去除UCNPs表面的油酸分子,对UCNPs进行表面改性:取1~10mg油酸分子包裹的UCNPs,以8000~120000r/min的速度离心10~30min,将离心产物分散于1~10mL含有盐酸的乙醇溶液中(pH2~5),超声0.5~1h去除UCNPs表面的油酸分子,然后以8000~13000r/min的速度离心10~20min后弃去上清液,再将离心产物分散到3~10mL含有盐酸水乙醇溶液中(pH2~5)纯化,最后以8000~13000r/min的速度离心10~20min后弃上清,将产物分散在1~10mL超纯水(最终浓度1mg/mL)中备用。所述含有盐酸的乙醇溶液是在乙醇溶液中配置0.1M的盐酸,含有盐酸水乙醇溶液是在V水︰V乙醇为1︰1溶液中配置0.1M的盐酸。
3)制备UCNPs-DNA1:取步骤2)所得的1mL水溶性UCNPs,加入不同浓度的DNA1水溶液(0.1~100μM),以400~600rpm搅拌6~24h;反应结束后,将溶液以8000~13000r/min的速度离心10~20min,离心产物重分散在5~10mL的Tris-HCL缓冲液中(20~50mM,5~50mMMgCl2,50~100mMNaCl,pH 7.4~8)中。所述Tris-HCL缓冲液优选20mM,5mM MgCl2,50mMNaCl,pH 7.4;
所述DNA1通过5’末端官能化基团与稀土离子强配位作用修饰在UCNPs表面,所述DNA1的5’末端官能化基团包括但不局限于羧酸基团、磷酸基团、磺酸基团等中的一种;
所述DNA1序列为:5’-TTTTTTTTTCTTGCCTACGCCACTAGCTC-3’或
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’。
4)构建UCNPs-DNA1与荧光猝灭基团的近红外荧光纳米生物传感器:将上述UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液以不同比例(1︰0.1~10,优选摩尔比1︰1),荧光猝灭基团修饰有与DNA1部分互补的DNA2,在Tris-HCL缓冲液(优选20mM,5mM MgCl2,50mMNaCl,pH 7.4)中混合,总体积为200μL,然后置于37℃恒温摇床中反应1~3h,反应结束后,将溶液以8000~12000r/min的速度离心10~20min。最后,将近红外荧光纳米生物传感器分散在1~5mLTris-HCL缓冲液(20~50mM,5~50mM MgCl2,50~100mMNaCl,pH 7.4~8)中;所述Tris-HCL缓冲液优选20mM,5mM MgCl2,50mMNaCl,pH 7.4。
所述DNA2序列为:5’-GTGGCGTAGGCAAGTTTTTTTTT-3’或
5’-AGACAACACGTGCCCAAC-3’。
所述荧光猝灭基团包括但不局限于BHQ1、BHQ2、TAMRA、金纳米颗粒、氧化石墨烯等中的一种。
所述近红外荧光生物传感器的检测方法,包括以下步骤:
1)绘制荧光强度标准线性图:
配置5~50μL不同梯度浓度的靶标分子标准溶液加入100~200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中,震荡孵育30~60min形成检测溶液,在980nm近红外激光激发下测量检测上述不同梯度浓度的靶标分子标准溶液在特定波长(540nm、806nm)处的荧光强度值,将其标准浓度与检测时荧光强度一一对应绘制成荧光强度标准线性图。
2)对样品进行检测:
将检测样品分散在200μL Tris-HCL缓冲液中(20mM,5mM MgCl2,50mMNaCl,pH7.4)中,然后将5~50μL检测样品加入100~200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中,震荡孵育30~60min形成检测溶液,在980nm近红外激光激发下测量检测溶液在特定波长(540nm、806nm)处的荧光强度值。再对照相应的荧光强度标准线性图,定量计算样品中靶标分子的含量。
以下给出具体实施例。
实施例1:
优选例,DNA1序列为5’-TTTTTTTTTCTTGCCTACGCCACTAGCTC-3’,5’端修饰磷酸基团。DNA2序列为5’-GTGGCGTAGGCAAGTTTTTTTTT-3’。5’端修饰AuNCs作为荧光猝灭基团。构建的近红外荧光生物传感器用于检测肿瘤循环DNA(ctDNA)的方法原理如图1所示。
根据权利要求1所述一种基于上转换纳米颗粒(UCNPs)与荧光猝灭基团的近红外荧光生物传感器的构建方法,其特征在于包括以下步骤:
1)采用高温溶剂热法合成稀土掺杂的UCNPs。
将YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O和TmCl3·6H2O(n(Y3+):n(Yb3+):n(Tm3+)=72.7︰27︰0.3,共0.5mmol与3.5mL OA和7.5mL ODE在100mL三口瓶中搅拌均匀,在真空环境下加热至130℃,保持2h,自然冷却至室温。将含有2mmol NH4F和0.125mmol NaOH的5mL甲醇溶液缓慢加入三口瓶中,搅拌加热至80℃以除去溶液中的甲醇,然后将溶液抽真空通氮气,梯度升温至290℃,并在氮气氛围下保温1h。待反应结束后自然冷却,并将溶液以12000r/min的速度离心20min,收集产物,重新分散在10mL环己烷溶剂中,再加入10mL水/乙醇混合溶液(VWater/VEthanol=1︰1),轻微震荡数次后静置分层过夜。收集上层溶液,将制备的UCNPs分散于10mL的环己烷中于4℃下保存备用。所制备的UCNPs的TEM图像如图2a所示。
2)利用酸性处理对UCNPs进行表面改性,将颗粒表面油酸分子剥离,所得产物为水溶性、无配体的UCNPs。
取10mg油酸分子包裹的UCNPs,以12000r/min的速度离心20min,将离心产物分散于10mL含有盐酸的乙醇溶液中(pH 4),超声1h去掉UCNPs表面的油酸分子,以13000r/min的速度离心15min后弃去上清液,再将离心产物分散到5mL含有盐酸水乙醇溶液中(pH 4)纯化,以13000r/min的速度离心15min后弃上清,将产物分散在10mL超纯水(最终浓度1mg/mL)中备用。
3)将步骤2)所得到的UCNPs与DNA1通过磷酸基团和稀土离子的强配位作用进行修饰,所得产物即为UCNPs-DNA1。
取上述1mL水溶性UCNPs,加入不同浓度的DNA1水溶液(1μM),以600rpm搅拌6h。反应结束后,将溶液以13000r/min的速度离心20min,离心产物重分散在1mL的Tris-HCL缓冲液中(优选20mM,100mMNaCL,pH 7.4)。UCNPs-DNA1的紫外吸收表征如图3所示。
4)将SH-DNA2通过巯基与金的点击反应修饰在AuNCs表面,所得产物即为AuNCs-DNA2。
向1mL AuNCs水溶液中加入4μL 10%(V/V)Tween-80水溶液。并使其在室温下缓慢搅拌反应0.5h。然后将溶液以8000r/min的速度离心8min,将离心产物重新分散在0.1M PBS溶液中,紧接着将SH-DNA加入上述溶液使得最终浓度为1μM,并使其在50℃下老化3h。反应结束后,将溶液以8000r/min的速度离心10min,离心产物重分散在1mL的Tris-HCL缓冲液中(优选20mM,100mMNaCL,pH 7.4)。
5)将步骤3)所得到的UCNPs-DNA1通过碱基互补配对原则与步骤4)所得到的AuNCs-DNA2连接,所得产物即为近红外荧光生物传感器。
将上述UCNPs-DNA1溶液与AuNCs-DNA2溶液以不同比例(优选molar ratio of 1︰1)在Tris-HCL缓冲液(优选20mM,5mM MgCl2,50mM NaCl,pH 7.4)中混合,总体积为200μL。然后置于37℃恒温摇床中反应1~3h。反应结束后,将溶液以8000r/min的速度离心10min。最后,将荧光纳米生物传感器分散在1mL Tris-HCL缓冲液(20mM,5mM MgCl2,50mM NaCl,pH7.4)中。所制备的荧光纳米生物传感器的TEM图像如图2b所示。
6)向步骤5)所得的近红外荧光生物传感器溶液中加入含有不同梯度标准浓度ctDNA溶液。温育后通过测量荧光强度值,绘制荧光强度标准线性图。
配置不同梯度浓度的ctDNA标准溶液在200μLTris-HCL缓冲液中(20mM,5mMMgCl2,50mMNaCl,pH 7.4)中。取上述溶液20uL分别加入200μL含有近红外荧光纳米生物传感器的溶液中温育1h。记录对应浓度ctDNA溶液的荧光强度,绘制荧光强度标准线性图。近红外荧光纳米生物传感器的荧光光谱变化图与荧光强度标准线性图分别为图4与图5。
7)向步骤5)所得的近红外荧光生物传感器加入实际样品进行检测。测量其荧光强度值,对比步骤6)所得标准曲线计算该样品中ctDNA的含量。
将小鼠血液分散在200μLTris-HCL缓冲液中(20mM,5mM MgCl2,50mMNaCl,pH 7.4)中,取上述溶液20μL加入200μL含有近红外荧光纳米生物传感器的溶液中温育1h。在980nm近红外光激发下测定溶液荧光强度的变化。对照荧光强度标准线性图,计算出小鼠血液中ctDNA的含量。
实施例2:
优选例,DNA1序列为5’-GTT GGG CAC GTG TTG TCTC TCT GTG TCT CGT GCC CTTCGC TAG GCC CACA-3’,5’端修饰磷酸基团。DNA2序列为5’-AGA CAA CAC GTG CCC AAC-3’,5’端修饰BHQ1作为荧光猝灭基团。构建的近红外荧光生物传感器用于检测AFB1的方法原理如图6所示。
1)采用高温溶剂热法合成稀土掺杂的UCNPs。
将YCl3·6H2O,YbCl3·6H2O和TmCl3·6H2O(n(Y3+):n(Yb3+):n(Tm3+)=72.7:27:0.3,共0.5mmol)与3.5mL OA和7.5mL ODE在100mL三口瓶中搅拌均匀,在真空环境下加热至130℃,保持2h,自然冷却至室温。将含有2mmol NH4F和0.125mmol NaOH的5mL甲醇溶液缓慢加入三口瓶中,搅拌加热至80℃以除去溶液中的甲醇,然后将溶液抽真空通氮气,梯度升温至290℃,并在氮气氛围下保温1h。待反应结束后自然冷却,并将溶液以12000r/min的速度离心20min,收集产物,重新分散在10mL环己烷溶剂中,再加入10mL水/乙醇混合溶液(VWater/VEthanol=1︰1),轻微震荡数次后静置分层过夜。收集上层溶液,将制备的UCNPs分散于10mL的环己烷中于4℃下保存备用。
2)利用酸性处理对UCNPs进行表面改性,将颗粒表面油酸分子剥离,所得产物为水溶性、无配体的UCNPs。
取10mg油酸分子包裹的UCNPs,以12000r/min的速度离心20min,将离心产物分散于10mL含有盐酸的乙醇溶液中(pH 4),超声1h去掉UCNPs表面的油酸分子,以13000r/min的速度离心15min后弃去上清液,再将离心产物分散到5mL含有盐酸水乙醇溶液中(pH 4)纯化,以13000r/min的速度离心15min后弃上清,将产物分散在10mL超纯水(最终浓度1mg/mL)中备用。
3)UCNPs-DNA-cDNA的制备
取UCNPs 0.05mg分散于1mL超纯水中,取1.5nmol p-DNA分散到上述溶液中,震荡30min,反应结束后,将溶液以13000r/min的速度离心20min,离心产物重分散在150μL的Tris-HCL缓冲液中(10mM,100mMNaCL,pH 7.4)。
4)UCNPs/q-DNA的制备
取1.5nmol cDNA加入到步骤4)所制备的溶液中,在Tris盐酸缓冲液体系中室温反应2h,利用碱基互补配对原则,使UCNPs与猝灭基团的距离拉近,实现荧光能量共振转移诱导UCNPs产生荧光猝灭。
5)对AFB1标准品进行检测
配置浓度为5、10、25、50、100、200ng/mL的AFB1溶液加入到步骤5)得到的溶液中,37℃孵育60min,在980nm近红外光激发下测试540nm处的荧光强度,以AFB1的浓度为横坐标,荧光强度值为纵坐标建立标准曲线。
6)对实际样品进行检测
将食用花生油作为实际样品进行检测,取2g花生于10mL离心管中,加入8mL正己烷,震荡5min,以4000r/min的速度离心5min,弃掉上清液,取500μL下清液并加入500μL超纯水混匀,取50μL进行测试。
本发明通过将UCNPs连接一段与靶标分子有特异性亲和的DNA1作为能量供体,采用与DNA1序列部分互补的DNA2连接荧光猝灭基团作为能量受体,再通过碱基互补配对原则使两者结合,从而发生荧光能量共振转移诱导UCNPs发生荧光猝灭。当检测样品中含有靶标分子时,其与DNA1的特异性结合能力大于DNA2,使得双链解离,UNCPs产生荧光信号。最终通过检测UCNPs在980nm近红外光激发下的发光强度的变化,对照相应的荧光强度标准线性图。定量检测样品中靶标分子的含量。本发明广泛应用于核酸、毒素、金属离子、农药等外源性小分子污染物的检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种近红外荧光生物传感器的构建方法和检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> human
<400> 1
tttttttttc ttgcctacgc cactagctc 29
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> human
<400> 2
gtggcgtagg caagtttttt ttt 23
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> human
<400> 3
gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggcccaca 50
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> human
<400> 4
agacaacacg tgcccaac 18
Claims (7)
1.一种近红外荧光生物传感器的构建方法,其特征在于包括以下步骤:
1)制备UCNPs,具体方法为:将0.5mmol的YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O与TmCl3·6H2O混合物加入1~5mL油酸和5~10mL 1-十八烯中,在50~100mL容器中搅拌均匀,在真空环境下加热反应,自然冷却至室温,再加入5mL含有NH4F和NaOH的甲醇溶液,搅拌加热以除去溶液中的甲醇,然后抽真空通氮气,梯度升温,并在氮气氛围下保温;待升温反应结束后自然冷却,离心,收集产物,重新分散在5~10mL环己烷溶剂中,加入2~5mL水/乙醇混合溶液,震荡后静置分层过夜,收集上层溶液,即得UCNPs,再分散于5~10mL环己烷溶剂中于4℃下保存备用;
2)将UCNPs分散在含有盐酸的乙醇溶液中,超声去除UCNPs表面的油酸分子,对UCNPs进行表面改性;
所述对UCNPs进行表面改性的具体方法为:取1~10mg油酸分子包裹的UCNPs,第一次离心后将离心产物分散于1~10mL含有盐酸的乙醇溶液中,超声去除UCNPs表面的油酸分子,然后第二次离心,弃去上清液,再将离心产物分散于3~10mL含有盐酸水乙醇溶液中纯化,再第三次离心后弃上清,将产物分散在1~10mL水中备用;
3)在改性后的UCNPs表面修饰与靶标分子有特异性亲和的DNA1,制备UCNPs-DNA1;
所述制备UCNPs-DNA1的具体方法为:取步骤2)所得的1mL水溶性UCNPs,加入不同浓度的DNA1水溶液,搅拌后离心,离心产物重分散在5~10mL的水或Tris-HCL缓冲液中;
所述不同浓度的DNA1水溶液的浓度为0.1~100μM;所述搅拌是在400~600rpm下搅拌6~24h;所述离心的速率为8000~13000r/min,离心的时间为10~20min;所述水采用超纯水;所述Tris-HCL缓冲液为20~50mM,5~50mM MgCl2,50~100mM NaCl,pH 7.4~8;
所述DNA1通过5’末端官能化基团与稀土离子强配位作用修饰在UCNPs表面,所述DNA1的5’末端官能化基团选自羧酸基团、磷酸基团、磺酸基团中的一种;
所述DNA1序列为:5’-TTTTTTTTTCTTGCCTACGCCACTAGCTC-3’或
5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3’;
4)构建UCNPs-DNA1与荧光猝灭基团的近红外荧光纳米生物传感器,具体方法为:将UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液以不同比例在Tris-HCL缓冲液中混合,总体积为200μL,然后置于37℃恒温摇床中反应,反应结束后,将溶液离心,将近红外荧光纳米生物传感器分散在1~5mL Tris-HCL缓冲液中;
所述UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液的摩尔比为1︰(0.1~10);所述反应的时间为1~3h;所述离心的速率为8000~12000r/min,离心的时间为10~20min;所述Tris-HCL缓冲液为20~50mM,5~50mM MgCl2,50~100mM NaCl,pH 7.4~8;
所述荧光猝灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、金纳米颗粒、氧化石墨烯中的一种;所述荧光猝灭基团修饰有与DNA1部分互补的DNA2;所述DNA2序列为:5’-GTGGCGTAGGCAAGTTTTTTTTT-3’或5’-AGACAACACGTGCCCAAC-3’。
2.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法,其特征在于在步骤1)中,所述YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O的配比为0.3635︰0.135︰0.15;YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O混合物中n(Y3+):n(Yb3+):n(Tm3+)=72.7︰27︰0.3;所述加热反应的温度为120~130℃,加热反应的时间为1~2h。
3.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法,其特征在于在步骤1)中,所述甲醇溶液中NH4F和NaOH的配比为(1~4)︰(0.0625~0.25);所述搅拌加热的温度为80℃;所述梯度升温是升至280~310℃;所述在氮气氛围下保温的时间为0.5~2h;所述离心是8000~12000r/min离心10~30min;所述水/乙醇混合溶液中水和乙醇的体积比为1︰1;所述震荡是震荡至少2次。
4.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法,其特征在于在步骤2)中,所述第一次离心的速率为8000~12000r/min,第一次离心的时间为10~30min;所述含有盐酸的乙醇溶液的pH为2~5;所述超声的时间为0.5~1h;所述第二次离心的速率为8000~13000r/min,第二次离心的时间为10~20min;所述第三次离心的速率为8000~13000r/min,第三次离心的时间为10~20min;所述水采用超纯水;所述产物分散在水中的最终浓度1mg/mL。
5.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法,其特征在于在步骤4)中,所述UCNPs-DNA1溶液与荧光猝灭基团溶液的摩尔比为1︰1;所述Tris-HCL缓冲液为20mM,5mM MgCl2,50mM NaCl,pH 7.4。
6.如权利要求1所述一种近红外荧光生物传感器的构建方法构制的近红外荧光生物传感器的检测方法,其特征在于包括以下步骤:
1)绘制荧光强度标准线性图:
配置5~50μL不同梯度浓度的靶标分子标准溶液加入100~200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中,震荡孵育形成检测溶液,在980nm近红外激光激发下测量检测上述不同梯度浓度的靶标分子标准溶液在特定波长处的荧光强度值,将其标准浓度与检测时荧光强度一一对应绘制成荧光强度标准线性图;
2)对样品进行检测:
将检测样品分散在200μL Tris-HCL缓冲液中,然后将5~50μL检测样品加入100~200μL含有近红外荧光生物传感器的溶液中,震荡孵育形成检测溶液,在980nm近红外激光激发下测量检测溶液在特定波长处的荧光强度值,再对照相应的荧光强度标准线性图,定量计算样品中靶标分子的含量。
7.如权利要求6所述检测方法,其特征在于在步骤1)或2)中,所述震荡孵育的时间为30~60min;所述特定波长选择波长540nm和806nm;
在步骤2)中,所述Tris-HCL缓冲液为20mM,5mM MgCl2,50mMNaCl,pH 7.4。
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CN109270037A (zh) * | 2018-09-05 | 2019-01-25 | 宁波海歌电器有限公司 | 一种工业品中重金属离散型生物传感检测方法 |
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