CN108827921A - 一种溶菌酶的室温磷光检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种溶菌酶的室温磷光检测方法及应用，属于溶菌酶的检测技术领域，可解决现有溶菌酶的检测过程复杂，成本高以及干扰大的问题，本发明利用制备的β‑环糊精修饰的Mn:ZnS室温磷光量子点为磷光探针，溶菌酶核酸适配体为分子识别单元，通过检测加入溶菌酶后体系的室温磷光强度实现对溶菌酶的分析检测。该磷光检测体系对溶菌酶的响应范围为5.5nM‑44.4nM，检出限为0.54nM。可用于血清、尿样、蜂蜜及葡萄酒中溶菌酶的检测，且在测定时无需复杂的样品预处理过程。室温磷光的产生也不需要加入除氧剂和诱导剂，并能够避免实际样品本底荧光和散射光的干扰。
Description
技术领域
本发明属于溶菌酶的检测技术领域，具体涉及一种溶菌酶的室温磷光检测方法及应用。
背景技术
溶菌酶广泛存在于动物体液、禽类蛋白、植物以及微生物中。溶菌酶能够水解致病菌中的黏多糖，还具有抗菌、消炎、抗病毒、增强免疫力等诸多药理作用。由于其本身易消化、易吸收且无毒副作用已经被广泛地应用于医药、食品、生物工程等方面。在临床上，溶菌酶已经被应用于治疗慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、中耳炎、口腔溃疡等多种疾病，它还被广泛的应用于制造牙膏和漱口液，可以有效的防止龋齿的发生，此外，人的体液中溶菌酶含量的高低可以作为诊断疾病时的指标；在食品行业，它不仅可以代替传统的化学防腐剂起到食品保鲜的作用，在一定程度上还能强化食品营养，提高食品的安全性；基于溶菌酶能够破坏细胞壁的功能，它被作为细胞工程、基因工程中重要的工具酶。因此，溶菌酶的准确、灵敏检测具有重要的现实意义。
目前，对于复杂样品中溶菌酶的分析检测方法主要有毛细管电泳质谱技术、表面增强拉曼光谱法、表面等离子体共振法等，这些方法虽然灵敏度高，但检测过程复杂、成本较高，同时，需要较强的实验技能。电化学法虽操作简便，但需对电极进行修饰，同时，修饰电极往往导致电化学方法的重现性较差，限制了其在复杂样品中溶菌酶检测的分析应用。因此，开发高选择性、高灵敏度、操作简便、成本低、快速检出溶菌酶含量的实验方法是十分必要的。荧光光谱法具有准确、简便、快速、灵敏等优点，遗憾的是其很难避免复杂样品尤其是生物体液本底荧光和散射光的干扰。与荧光相比，磷光具有发射寿命长、选择性好等优点，尤其对于复杂样品的测试中，其较长的激发光谱和发射光谱之间的间隙进一步降低了样品自体荧光和散射光的干扰，提高分析检测的选择性。尤其对于Mn:ZnS量子点的磷光测试中，不需要加入除氧剂和诱导剂，大大简化了磷光分析的操作。
“基于Mn掺杂ZnS量子点室温磷光法测定生物体液中的磺胺嘧啶钠（分析试验室，2015，34 (11):1246-1250）”，其研究内容是以3-巯基丙酸修饰的Mn:ZnS量子点为磷光探针，磺胺嘧啶钠通过静电作用吸附于量子点表面引起体系磷光的猝灭实现血液与尿液中磺胺嘧啶钠的分析检测。其中，作为修饰剂的3-巯基丙酸具有生物毒性，同时，该分析体系是基于磷光猝灭实现的分析检测，其分析检测的灵敏度不高，只有0.78μM，在其对生物体液的分析检测中需对尿液与血清样品稀释100倍实现检测。此外，静电吸附作用也使得体系的选择性受限。
“Mn掺杂ZnS量子点-室温磷光法检测生物体液中的依诺沙星（中国化学会第26届学术年会分析化学分会场论文集，09-I-016，2008-7）”与专利“Mn掺杂ZnS量子点室温磷光检测生物体液中依诺沙星的方法（ZL200810053242.1）”，其研究内容是以L-半胱氨酸修饰的Mn:ZnS量子点为磷光探针，依据依诺沙星引起其磷光猝灭建立的磷光分析方法用于血清与尿样中依诺沙星的分析检测。同样，该分析体系是也是基于磷光猝灭实现的分析检测，其分析检测的灵敏度是58.6 nM。小分子L-半胱氨酸只起到稳定量子点的作用，对样品没有富集作用。此外，基于分子碰撞引起的磷光猝灭，其分析检测的选择性也需要提高。
发明内容
本发明针对现有溶菌酶的检测过程复杂，成本高以及干扰大的问题，提供一种溶菌酶的室温磷光检测方法及应用。
本发明采用如下技术方案：
一种溶菌酶的室温磷光检测方法，包括如下步骤：
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.03-0.05的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应20-40min；再将溶液加热至50-70℃，空气中陈化2-3h，得到6-SH-β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与6-SH-β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50 mg Mn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10 mmol/L的磷酸缓冲液中配成浓度为100 μM的溶菌酶核酸适配体溶液，在90℃下加热10 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至1.0 μM；
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准溶液：分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液；
第五步，检测标准曲线：分别取1mL的Mn:ZnS量子点母液、50μL的溶菌酶核酸适配体溶液和500μL不同浓度梯度的溶菌酶标准溶液，用磷酸缓冲溶液定容至5mL，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长316nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线590nm处的磷光强度P对溶菌酶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第六步，待测样品溶菌酶及其加标回收率的检测：
待测样品溶菌酶的检测，用10 mmol/L的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm；
待测样品溶菌酶加标回收率的检测，用10 mmol/L的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液，再分别加入500μL不同浓度的溶菌酶标准溶液样品，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置15min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的磷光强度测量值和标准曲线方程，计算出溶菌酶浓度值，得出溶菌酶在待测样品中的加标回收率。
一种溶菌酶的室温磷光检测方法应用于尿液、血清、蜂蜜和葡萄酒的溶菌酶的检测。
本发明的原理如下：
溶菌酶核酸适配体通过超分子作用自组装在在量子点表面将其磷光猝灭，加入溶菌酶后，由于溶菌酶核酸适配体与溶菌酶之间强烈的亲和作用使得核酸适配体从量子点表面脱落，从而使得量子点的磷光得以恢复。
本发明的有益效果如下：
本发明的检测方法简单、高效、经济、环保。除了具备以往Mn:ZnS量子点磷光检测的优势，如：避免生物样品自体荧光和散射光的干扰，免除繁琐的样品预处理过程，不需要加入除氧剂和诱导剂等，本发明的检测方法还具备如下优势：
1. 本发明中Mn:ZnS量子点以β-环糊精为修饰剂，溶菌酶核酸适配体通过与环糊精的超分子相互作用自组装在在量子点表面将其磷光猝灭，加入溶菌酶后，由于溶菌酶核酸适配体与溶菌酶之间强烈的亲和作用使得核酸适配体从量子点表面脱落，从而使得量子点的磷光得以恢复。
2. 本发明中Mn:ZnS量子点制备步骤简单，合成条件温和，不需要有机溶剂，得到的磷光量子点材料具有很好生物溶性和分散性，且室温磷光性能优良。
3. 溶菌酶核酸适配体与环糊精的超分子相互作用及溶菌酶核酸适配体与溶菌酶之间强烈的亲和作用使得本方法具有较好的选择性。
4. 本发明提出的磷光增强型分析体系同时协同环糊精的预富集作用使得本方法的灵敏度较高，分析检测溶菌酶的检出限为0.54 nM，高于其它Mn:ZnS量子点磷光分析体系2-3个数量级，该磷光检测体系对溶菌酶的响应范围为5.5nM-44.4nM。
5. 本发明方法可应用于尿样、血清、蜂蜜、葡萄酒等实际样品中溶菌酶的检测，其应用范围更广。
6. 本发明中作为识别单元的溶菌酶核酸适配体无需进行荧光标记，检测更加经济、简便。
附图说明
图1为6-SH-β-环糊精修饰的锰掺杂硫化锌室温磷光量子点透射电镜图；
图2为不同浓度溶菌酶存在时体系的磷光光谱图；
图3为室温磷光量子点检测溶菌酶的标准曲线。
具体实施方式
实施例1，室温磷光检测尿液中的溶菌酶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.03的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应40min；再将溶液加热至60℃，空气中陈化3h，得到6-SH-β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50mgMn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100mL的容量瓶中。
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10mmol/L的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的溶菌酶核酸适配体溶液，在90℃下加热10min，迅速冷却至室温，储存于-20℃环境中备用。使用时用10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至1.0 μM。
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准品：
分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点母液、50 μL的溶菌酶适配体溶液及500μL的不同浓度梯度的溶菌酶标准溶液，用磷酸缓冲溶液定容至5mL，转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长316nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；通过加入一定量的不同浓度梯度的溶菌酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/溶菌酶核酸适配体体系对它的响应情况。将每条曲线590nm处的磷光强度P对溶菌酶浓度c作图，获得工作曲线。
第六步，实际样品的处理：
取尿样10mL，加入10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，尿样中溶菌酶的检测：
在比色管中，依次加入1mL的Mn:ZnS量子点母液，50 μL的溶菌酶适配体溶液，最后加入稀释后的尿样定容在5mL的容量瓶中。然后将样品倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm，因为含有溶菌酶样本的磷光强度会高于无溶菌酶样本的磷光强度，据此判断样品中是否含有溶菌酶。
实施例2，室温磷光检测尿液中的溶菌酶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.04的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应20min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到6-SH-β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50mgMn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100mL的容量瓶中。
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10mmol/L的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的溶菌酶核酸适配体溶液，在90℃下加热10min，迅速冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至1.0μM。
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准品：
分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50 μL的适配体溶液及500μL的不同浓度梯度的溶菌酶标准品溶液，用磷酸缓冲溶液定容至5mL，转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长316nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度，通过加入一定量的不同浓度梯度的溶菌酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/溶菌酶核酸适配体体系对它的响应情况。将每条曲线590nm处的磷光强度P对溶菌酶浓度c作图，获得工作曲线。
第六步，实际样品的处理：
取尿样10mL，加入10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，尿样中溶菌酶的检测：
在比色管中，依次加入1mL的Mn:ZnS量子点母液，50 μL的溶菌酶适配体溶液，最后加入稀释后的尿样定容在5mL的容量瓶中。然后将样品倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为 316nm，发射波长为590nm，因为含有溶菌酶样本的磷光强度会高于无溶菌酶样本的磷光强度，据此判断样品中是否含有溶菌酶。
实施例3，室温磷光检测尿样中的溶菌酶
第一步，制备Mn掺杂ZnS量子点
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.03的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应20min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到6-SH-β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到所需的量子点固体粉末。通过透射电子显微镜对制备6-SH-β-CD包覆的Mn掺杂ZnS量子点的形貌、粒径和分散情况进行观察分析，如图1所示，量子点呈球形均匀分散，至少有80%的粒子直径位于2.5±0.2nm。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50mgMn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100mL的容量瓶中。
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的核酸适配体溶解于10mmol/L的磷酸缓冲液中配成浓度为100μM的核酸适配体溶液，在90℃下加热10min，迅速冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用10mmol/L的磷酸缓冲液稀释至1.0μM。
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准品：
分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50 μL的适配体溶液及500μL的不同浓度梯度的溶菌酶标准品溶液，用磷酸缓冲溶液定容至5mL，转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长316nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度，通过加入一定量的不同浓度梯度的溶菌酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/溶菌酶核酸适配体体系对它的响应情况。溶菌酶浓度增加时，体系的磷光强度随之而增强（图2）。将每条曲线590nm处的磷光强度P对溶菌酶浓度c作图，工作曲线见图3所示。当溶菌酶浓度在5.50nM-44.4nM范围内时，体系的磷光强度P与其浓度c呈现较好的线性关系，回归方程为（R2=0.998）P=3.96c+50.13，以S/N=3为标准计算得检出限为0.54nM。
第六步，实际样品的处理：
取尿样10mL，加入10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，检测溶菌酶在人尿中的加标回收率：
在比色管中，依次加入2mL的Mn:ZnS量子点母液，100 μL的适配体溶液，分别加入500μL的不同浓度的溶菌酶标准样品，最后加入稀释后的尿样定容在10 mL的容量瓶中，定容后溶菌酶的浓度分别为6.6、11.1、33.3nM，同时做空白样，室温静置15min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出溶菌酶浓度值，并计算溶菌酶在人尿样中的加标回收率，见表1，溶菌酶在人尿样中的加标回收率为101.5-102.7%。
表1人尿样中溶菌酶加标回收实验
实施例4，室温磷光检测血清液中的溶菌酶
第一步，制备Mn掺杂ZnS量子点
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.05的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应40min；再将溶液加热至70℃，空气中陈化2.5h，得到6-SH-β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50mgMn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100mL的容量瓶中。
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10mmol/L的PBS缓冲液中配成浓度为100μM的核酸适配体溶液，在90℃下加热10min，迅速冷却至室温，储存于-20℃环境中备用。使用时用10 mmol/L的PBS缓冲液稀释至1.0μM。
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准品：
分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50 μL的适配体溶液及500μL的不同浓度梯度的溶菌酶标准品溶液，用磷酸缓冲溶液定容至5 mL，转入10 mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长316 nm，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为10 nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度。将每条曲线590 nm处的磷光强度对溶菌酶浓度作图，获得工作曲线。
第六步，实际样品的处理：
血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清12.5mL，加入10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，血清样品中溶菌酶的检测：
在比色管中，依次加入2mL的Mn:ZnS量子点母液，100 μL的适配体溶液，最后加入稀释后的血清样定容在10 mL的容量瓶中。静置15min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm，因为含有溶菌酶样本的磷光强度会高于无溶菌酶样本的磷光强度，据此判断样品中是否含有溶菌酶。
实施例5，室温磷光检测血清中的溶菌酶
第一步，制备Mn掺杂ZnS量子点：
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.03的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应20min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到6-SH-β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50mgMn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100mL的容量瓶中。
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10mmol/L的PBS缓冲液中配成浓度为100μM的核酸适配体溶液，在90℃下加热约10min，迅速冷却至室温，储存于-20℃环境中备用。使用时用10 mmol/L的PBS缓冲液稀释至1.0 μM。
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准品
分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50 μL的溶菌酶核酸适配体溶液及500μL的不同浓度梯度的溶菌酶标准品溶液，用磷酸缓冲溶液定容至5mL，转入10mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长316nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；通过加入一定量的不同浓度梯度的溶菌酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/溶菌酶核酸适配体体系对它的响应情况。溶菌酶浓度增加时，体系的磷光强度随之而增强。将每条曲线590nm处的磷光强度P对溶菌酶浓度c作图，获得工作曲线。当溶菌酶浓度在5.50nM-44.4nM范围内时，体系的磷光强度P与其浓度c呈现较好的线性关系，回归方程为（R2=0.998）P=3.96c+50.13，以S/N=3为标准计算得检出限为0.54nM。
第六步，实际样品的处理：
血液样品由某医院提供，3000rpm，离心5min，取上清液。取血清12.5mL，加入10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第八步，检测溶菌酶在血清中的加标回收率
在比色管中，依次加入2mL的Mn掺杂ZnS量子点母液，100μL的溶菌酶适配体溶液，分别加入500μL的不同浓度的溶菌酶标准样品，最后加入稀释后的血清样定容在10 mL的容量瓶中，定容后溶菌酶素的浓度分别为6.6、11.1、33.3nM，同时做空白样，室温静置15min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出溶菌酶浓度值。计算溶菌酶在血清中的加标回收率，见表2，溶菌酶在人血清中的加标回收率为97.3-105.7%。
表2人血清中溶菌酶加标回收实验
实施例6，室温磷光检测蜂蜜中的溶菌酶
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.04的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30 min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应20 min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到6-SH-β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50 mg Mn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中。
第三步，核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10 mmol/L的PBS缓冲液中配成浓度为100 μM的核酸适配体溶液，在90℃下加热10 min，迅速冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用10 mmol/L的PBS缓冲液稀释至1.0 μM。
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准品
分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50 μL的适配体溶液及500μL的的不同浓度梯度的溶菌酶标准品溶液，用PBS缓冲溶液定容至5 mL，转入10 mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长316 nm，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度，通过加入一定量的不同浓度梯度的溶菌酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/溶菌酶核酸适配体体系对它的响应情况。将每条曲线590 nm处的磷光强度P对溶菌酶浓度c作图，获得工作曲线。当溶菌酶浓度在5.50 nM-44.4nM范围内时，体系的磷光强度P与其浓度c呈现较好的线性关系，回归方程为（R2=0.998）P=3.96c+50.13，以S/N=3为标准计算得检出限为0.54 nM。
第六步，实际样品的处理：
蜂蜜由超市购得，取蜂蜜5mL，加入10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至500mL，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，蜂蜜中溶菌酶的检测：
在比色管中，依次加入2 mL的Mn:ZnS量子点母液，100 μL的溶菌酶适配体溶液，最后加入稀释后的蜂蜜样定容在10 mL的容量瓶中。然后将样品倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为 316 nm，发射波长为590 nm，检测样品的磷光强度，计算样品中溶菌酶的含量。结果显示蜂蜜中溶菌酶的含量为3.12μM。
第八步，检测溶菌酶在蜂蜜中的加标回收率：
在比色管中，依次加入2mL的Mn掺杂ZnS量子点母液，100 μL的溶菌酶适配体溶液，分别加入500μL的不同浓度的溶菌酶标准样品，最后加入稀释后的蜂蜜样定容在10 mL的容量瓶中，定容后溶菌酶素的浓度分别为6.6、11.1、33.3nM，同时做空白样，室温静置15min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出溶菌酶浓度值，扣除蜂蜜中本身的溶菌酶浓度后，计算溶菌酶在蜂蜜中的加标回收率，见表3，溶菌酶在蜂蜜中的加标回收率为95.5-103.9%。
表3蜂蜜中溶菌酶加标回收实验
实施例7，室温磷光检测葡萄酒中的溶菌酶
第一步，制备Mn掺杂ZnS量子点：
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.03的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应20 min；再将溶液加热至50℃，空气中陈化2h，得到6-SH-β-CD包覆的Mn:ZnS量子点粗产品。以相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24h，即可得到所需的量子点固体粉末。
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50 mg Mn:ZnS量子点，用二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中。
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10 mmol/L的PBS缓冲液中配成浓度为100 μM的核酸适配体溶液，在90℃下加热10min，迅速冷却至室温，储存于-20℃环境中备用。使用时用10 mmol/L的PBS缓冲液稀释至1.0 μM。
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准品
分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液。
第五步，移取1mL的Mn:ZnS量子点溶液、50 μL的适配体溶液及500μL的的不同浓度梯度的溶菌酶标准品溶液，用PBS缓冲溶液定容至5 mL，转入10 mm的石英比色皿中，并将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长316 nm，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为10 nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度，通过加入一定量的不同浓度梯度的溶菌酶溶液以考察Mn:ZnS量子点/溶菌酶核酸适配体体系对它的响应情况。溶菌酶浓度增加时，体系的磷光强度随之而增强。将每条曲线590nm处的磷光强度P对溶菌酶浓度c作图，获得工作曲线。当溶菌酶浓度在5.50 nM-44.4nM范围内时，体系的磷光强度P与其浓度c呈现较好的线性关系，回归方程为（R2=0.998）P=3.96c+50.13，以S/N=3为标准计算得检出限为0.54 nM。
第六步，实际样品的处理：
葡萄酒由超市购得，取葡萄酒10 mL，加入10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至500mL，过滤，不需要进一步复杂的样品预处理过程。
第七步，检测溶菌酶在葡萄酒中的加标回收率
在比色管中，分别依次加入2mL的Mn掺杂ZnS量子点母液，100 μL的溶菌酶适配体溶液，分别加入500μL的不同浓度的溶菌酶标准样品，最后加入稀释后的葡萄酒样定容在10 mL的容量瓶中，定容后溶菌酶素的浓度分别为6.6、11.1、33.3nM，同时做空白样，室温静置15min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm。以上实验，每个浓度水平上重复3次。根据检测的磷光强度测量值，代入标准曲线方程，计算出溶菌酶浓度值。计算溶菌酶在葡萄酒中的加标回收率，见表4，溶菌酶在葡萄酒中的加标回收率为97.0-103.9%。
表4葡萄酒中溶菌酶加标回收实验
Claims (2)
1.一种溶菌酶的室温磷光检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，制备Mn:ZnS量子点：
将6-SH-β-环糊精、ZnSO4和Mn(Ac)2按摩尔比为3:1:0.03-0.05的比例混合，用NaOH调节体系的pH值至11，通氮气保护，室温下磁力搅拌30min；随后用注射器在隔绝空气的条件下快速加入与ZnSO4等摩尔的Na2S，室温下继续反应20-40min；再将溶液加热至50-70℃，空气中陈化2-3h，得到6-SH-β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品，以与6-SH-β-环糊精包覆的Mn掺杂ZnS量子点粗产品相同体积的无水乙醇使量子点沉降，高速离心，倾去上层清液，于室温真空干燥24 h，即可得到Mn:ZnS量子点固体粉末；
第二步，配制Mn:ZnS量子点母液：
称量50 mg Mn:ZnS量子点，二次去离子水定容在100 mL的容量瓶中；
第三步，溶菌酶核酸适配体溶液的配制：
先将溶菌酶核酸适配体离心5-10min，将经离心的适配体溶解于10 mmol/L的磷酸缓冲液中配成浓度为100 μM的溶菌酶核酸适配体溶液，在90℃下加热10 min，冷却至室温，储存于-20℃环境中备用，使用时用10 mmol/L的磷酸缓冲液稀释至1.0 μM；
第四步，配制不同浓度梯度的溶菌酶标准溶液：分别配制浓度为5.5、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3、38.9、44.4nM的溶菌酶标准溶液；
第五步，检测标准曲线：分别取1mL的Mn:ZnS量子点母液、50 μL的溶菌酶核酸适配体溶液和500μL的不同浓度梯度的溶菌酶标准溶液，用磷酸缓冲溶液定容至5mL，转入10mm的石英比色皿中，置于荧光光谱仪中，设定激发波长316nm，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，扫描体系的磷光光谱图并记录其磷光发射强度；将每条曲线590nm处的磷光强度P对溶菌酶标准溶液的浓度c作图，获得标准曲线，拟合得出标准曲线方程；
第六步，待测样品溶菌酶及其加标回收率的检测：
待测样品溶菌酶的检测，用10 mmol/L的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，倒入石英比色皿中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm；
待测样品溶菌酶加标回收率的检测，用10 mmol/L的磷酸缓冲液将待测样品稀释至40-100倍，在比色管中，按照Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液的体积比为1mL:50μL的比例，分别加入Mn:ZnS量子点母液和溶菌酶核酸适配体溶液，再分别加入500μL不同浓度的溶菌酶标准溶液样品，按照Mn:ZnS量子点母液的体积和整个待测体系的体积比为1:5的比例，用稀释后的待测样品定容，室温静置15min，然后将样品倒入比色池中，进行磷光检测，选取的磷光的激发波长为316nm，发射波长为590nm，每个浓度水平上重复3次，同时做空白样，根据检测的磷光强度测量值和标准曲线方程，计算出溶菌酶浓度值，得出溶菌酶在待测样品中的加标回收率。
2.一种如权利要求1所述的溶菌酶的室温磷光检测方法应用于尿液、血清、蜂蜜和葡萄酒的溶菌酶的检测。
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