CN107841527A - 一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶(thrombin)的荧光检测方法，提供了一种基于核酸适配体和PEI‑Fe₃O₄检测凝血酶浓度的新型生物传感器，其中寡核苷酸带负电荷，PEI‑Fe₃O₄富含氨基而带正电，在缓冲液中，荧光标记的核酸适配体与PEI‑Fe₃O₄因静电引力而吸附到Fe₃O₄的表面而使荧光猝灭。在核酸适配体/PEI‑Fe₃O₄复合物体系中加入凝血酶，凝血酶与适配体结合从而使其远离PEI‑Fe₃O₄的表面，荧光得以恢复。所以，通过荧光值的变化，可以检测出凝血酶的浓度，本发现只需要改变核酸适配体的序列，就可以实现对其他底物分子的检测，在凝血酶检测领域具有重大的研究和应用意义。

Description

一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及纳米技术，尤其是一种利用核酸适配体和磁 性材料检测凝血酶的荧光检测方法。

背景技术

凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在血液凝固、炎症、贫血、创伤愈合等 生理及病理过程中发挥着重要作用，其含量是凝血机制的重要指标。同时，凝血 酶还可以作为相关疾病诊断的生物标识物。因此，建立简单、快速、高灵敏度检 测凝血酶的方法对临床疾病的早期诊断、病程发展、疗效的监测和评估等都具有 非常重要的意义。

传统检测凝血酶的方法有高效液相色谱、生物质谱法、蛋白印迹法、酶联免 疫吸附分析等方法。基于色谱以及质谱技术的定量分析方法由于所用仪器昂贵、 对操作者技术要求高从而缩小了其应用范围。基于免疫反应的分析方法是应用比 较广泛的技术，但也存在着一些局限性，如抗体本身稳定性差(高温易失活)、 抗体标记难以精确化等缺点限制了该类检测方法的应用。

核酸适配体是一类新的具有与抗体类似的识别功能的分子，它的出现为蛋白 质分析带来了新的机遇和希望。近年来利用适配体作为识别分子用来建立凝血酶 的检测方法逐渐被发现。利用适配体检测凝血酶的主要围绕在以光学、电化学、 以及与纳米材料的作用等方面开展。适配体在光学和电化学方面的应用对靶分子 虽然具有良好的线性范围，但是其检测存在灵敏度不高以及需要复杂的组装等缺 点。而随着纳米材料的发展，适配体结合纳米材料成为一门新的交叉学科。采用 适配体作为识别分子，利用纳米材料(碳纳米管，石墨烯等)转导放大信号，为 特异、灵敏的分子识别提供了新的传感体系。本发明利用纳米材料PEI-Fe₃O₄作 为载体固定适配体可以实现对靶分子的高选择性、高灵敏度、简便快速的检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用核酸适配体和磁 性材料检测凝血酶的荧光检测方法，通过荧光值的变化，检测thrombin浓度， 从而只需改变核酸适配体的序列，即可以实现对其他底物分子的检测。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于： 包括如下方法步骤：

(1)PEI-Fe₃O₄的制备：所述PEI-Fe₃O₄由共沉淀方法制得；

(2)以荧光标记的寡核苷酸与PEI-Fe₃O₄形成的复合物作为检测器，具体 操作步骤如下：

步骤1，选择三种不同荧光(FAM、TAMRA、HEX)标记的三条随机寡核 苷酸链和6-FAM，分别为Random 1、Random 2、Random 3和Free FAM dye， 其中，Free FAM dye为没有连接DNA的FAM荧光基团，分别将以上三条随机 链和同浓度的6-FAM加入到缓冲液中，进行荧光检测并记录荧光；

步骤2，将PEI-Fe₃O₄加入到步骤1溶液中，PEI-Fe₃O₄作为固相载体因静电 作用吸附自由卷曲状态的寡核苷酸链；

步骤3，选择FAM标记的凝血酶适配体(简称TB aptamer)，在凝血酶适 配体/PEI-Fe₃O₄复合物中加入凝血酶待测物进行反应；

步骤4，在含有50nM凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄的复合物中加入凝血酶，并 检测加入前后荧光值的变化，加入300nM的凝血酶检测荧光值的变化；

(3)核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin的选择性试验及对thrombin 和lysozyme的双通道检测试验，其中所用thrombin和lysozyme的浓度均为100 nM。

而且，所述PEI-Fe₃O₄的制备采用经纯化和去氧的1.3M的FeCl₃﹒6H₂O和 0.65M的FeCl₂﹒4H₂O在搅拌的条件下溶解在水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调 节pH，配制的pH 10的月桂酸用于包被，在N₂保护下，将溶解在50％甲醇中的 8％的PEI加入其中，80℃搅拌1.5h，所得修饰过的Fe₃O₄溶液分别用无水乙醇 和超纯水清洗3次，最后将其溶解在20mM的pH 7.4的Tris-HCl中放于4℃保 存。

而且，所制备的PEI-Fe₃O₄纳米粒子进行TEM、DLS、XRD以及磁化强度 表征，纳米粒子的粒径为10nm，水和粒径为77.9±0.18nm，Zeta电位为20.5± 1.21mV。

而且，三条随机DNA链序列：

Randon 1：5’-FAM-AAAAATTATACGCGATGCGATGCGAATTAACTCAC-3’

Random 2：5’-TAMRA-TTAATTTCGCTTTTTGCGCGCAAAATTTTT-3’

Radom 3：5’-HEX-CTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3’。

而且，缓冲液终浓度如下：

将缓冲液配成1.5×的溶液。

而且，FAM标记的凝血酶适配体或50nM凝血酶适配体与不同浓度的 PEI-Fe₃O₄适配孵育条件如下：

将以上各组分混匀，于30℃水浴20min，自然冷却至室温，使得单链DNA 吸附到PEI-Fe₃O₄的表面，从而使荧光值减小。

而且，FAM标记的凝血酶适配体或50nM凝血酶适配体复合物中加入凝血 酶待测物进行反应，核酸适配体序列如下:

TB aptamer 5’-FAM-CTCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’

按以上体系将各组分依次加入EP管中，共10份，混匀，30℃水浴20min， 自然冷却至室温，使得DNA链吸附到PEI-Fe₃O₄表面，记录加入PEI-Fe₃O₄之后 的荧光值，而后向其中分别加入不同浓度的凝血酶，终浓度为0nM-300nM，30℃ 水浴30min，自然冷却至室温，用荧光分光光度计分别测定荧光值，将测得的数 据整理绘图。

而且，核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin的选择性试验，孵育条件如 下：

将BSA和溶菌酶分别溶于ddH₂O配制成相应的蛋白溶液，终浓度为10μM， 分别将这三种蛋白及其与凝血酶的混合物加入到凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄复合物 中，绘制图表。

而且，核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin和lysozyme的双通道检测 试验，序列如下：

将按以上体系将各组分依次加入EP管中，共4份，混匀，30℃水浴20min， 自然冷却至室温，使得DNA链吸附到PEI-Fe₃O₄表面，记录加入PEI-Fe₃O₄之后 的荧光值，而后分别将100nM的thrombin、lysozyme以及两者的混合物加入到 上述体系中，30℃水浴30min，自然冷却至室温，用荧光分光光度计分别测定荧 光值，将测得的数据整理绘图。

本发明专利的优点及有益效果：

1、本发明采用现存材料拥有最高阳离子密度的聚乙烯亚胺作为四氧化铁的 改性剂，此改性剂不仅提高了四氧化三铁的分散性，还能使四氧化三铁表面带有 丰富的正电荷。我们有效的利用了正电荷磁珠与负电荷DNA链之间的静电作用 去检测凝血酶，从而拓宽了纳米磁珠在检测方面的应用。

2、本发明充分利用PEI-Fe₃O₄能猝灭单链DNA末端标记的荧光，当靶分子 结合单链DNA后荧光能恢复的特点，能快速、特异性、高灵敏度对thrombin进 行检测。

3、核酸适配体具有靶分子范围广、高亲和力、强特异性、稳定性好、易于 修饰等特点而优于传统的抗体。本发明基于核酸适配体与PEI-Fe₃O₄相互作用而 建立了一个新型的检测凝血酶的传感系统。

4、本发明提供了一种基于核酸适配体和PEI-Fe₃O₄检测凝血酶浓度的新型 生物传感器，其中寡核苷酸带负电荷，PEI-Fe₃O₄富含氨基而带正电，在缓冲液 中，荧光标记的核酸适配体与PEI-Fe₃O₄因静电引力而吸附到Fe₃O₄的表面而使 荧光猝灭。在核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物体系中加入凝血酶，凝血酶与适配体 结合从而使其远离PEI-Fe₃O₄的表面，荧光得以恢复。所以，通过荧光值的变化， 可以检测出thrombin的浓度。本发现只需要改变核酸适配体的序列，可以实现 对其他底物分子的检测，在凝血酶检测领域具有重大的研究和应用意义。

附图说明

图1为基于寡核苷酸链/PEI-Fe₃O₄复合物检测凝血酶的原理图；

图2为PEI-Fe₃O₄的表征结果图，其中2-1为TEM结果，2-2为DLS结果， 2-3为XRD结果，2-4为磁化强度表征；

图3为在不同浓度PEI-Fe₃O₄下对三种不同荧光标记的随机链的猝灭作用结 果图；

图4为不同浓度凝血酶下核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物的荧光发射光谱图；

图5为凝血酶浓度与荧光强度之间的线性关系示意；

图6为检测体系的选择性，加入核酸适配体浓度为50nM，PEI-Fe₃O₄浓度 为0.8μg/mL，所有蛋白类的浓度为100nM。其中TB＝thrombin为凝血酶，LY＝ lysozyme为溶菌酶；

图7为双通道检测thrombin和lysozyme的图表。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不 是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

近年来，纳米粒子拓宽了化学、生物学以及医学问题的解决方式。其中，四 氧化三铁(Fe₃O₄)磁性纳米颗粒(Magnetic Nanoparticles)是20世纪70年代 后发展起来的前景广阔的新型磁性材料之一。因其具有良好的生物相容性、超顺 磁性和表面易功能化等特殊的化学、物理学以及生理学性能使其广泛应用于核磁 共振成像、药物和基因的传递、细胞标记、生物分离、生物催化、污染物的吸附 和生物传感器等方面。

Fe₃O₄纳米粒子在生物传感器方面的应用促使我们做了更进一步的研究，在 研究中我们发现聚乙烯亚胺修饰的Fe₃O₄可以与单链DNA组装成一个复合物从 而用于蛋白的检测。PEI是一类富含阳离子的氨基聚合物，常被用于运载siRNA 和shRNA。将聚乙烯亚胺修饰到Fe₃O₄的表面，PEI-Fe₃O₄因富含氨基而带正电 荷，由于静电作用，带负电荷且荧光标记的寡核苷酸链被吸附到PEI-Fe₃O₄的表 面，形成寡核苷酸/PEI-Fe₃O₄复合物，使荧光猝灭。核酸适配体是通过指数富集 配体的系统进化(systematic evolution of ligands byexpontential enrichment， SELEX)技术从体外筛选得到的寡聚核苷酸片段，能与蛋白质、多糖、有机小 分子甚至是金属离子等靶物质特异性结合并对目标分子具有高度亲和力和专一 性的识别能力。如果选择一条荧光标记的单链核酸适配体序列与PEI-Fe₃O₄混合， 荧光会被猝灭，加入靶分子后，靶分子会与其适配体特异性结合，使荧光适配体 探针从PEI-Fe₃O₄表面脱离并且游离在溶液中从而使荧光得以恢复。通过记录这 种有无靶分子而引起的荧光值的变化可以用于我们所要检测的物质。

本发明是以荧光标记的寡核苷酸与PEI-Fe₃O₄形成的复合物作为检测器，提 供一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，具体操作方法步 骤如下：

步骤1，选择三种不同荧光(FAM、TAMRA、HEX)标记的三条随机寡核 苷酸链和6-FAM，分别为Random 1、Random 2、Random 3、和Free FAM dye(即 没有连接DNA的FAM荧光基团)，分别将以上三条随机链和同浓度的6-FAM 加入到缓冲液中，进行荧光检测并记录荧光。

步骤2，将PEI-Fe₃O₄加入到步骤1溶液中，PEI-Fe₃O₄作为固相载体因静电 作用吸附自由卷曲状态的寡核苷酸链，此时分别标记三种不同荧光的三条随机链 的荧光均被猝灭而6-FAM的荧光值基本保持不变，因此验证了PEI-Fe₃O₄对荧光 标记寡核苷酸链的荧光猝灭是因为对单链DNA的吸附而导致的并且对单链 DNA具有普遍的吸附作用。

步骤3，选择FAM标记的凝血酶适配体(简称TB aptamer)应用于步骤2 中，在凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄复合物中加入凝血酶待测物进行反应。凝血酶与 适配体特异性结合使其适配体脱离PEI-Fe₃O₄的表面，FAM荧光值得以恢复， FAM荧光值的变化与凝血酶的浓度存在线性关系，通过荧光值的变化，可以检 测出凝血酶的浓度，具体原理图见图1。

步骤4，在含有50nM凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄的复合物中加入凝血酶，并 检测加入前后荧光值的变化，当加入300nM的凝血酶可以观测到荧光强度得到 很大程度的增强。此结果表明该方法可以实现对凝血酶的检测。在此试验中我们 选择了BSA和溶菌酶进行了选择性实验。

对于生物样品，多通道检测是很必要的。因此，对我们所提出的传感系进行 了双通道检测实验。我们选择了FAM标记的凝血酶适配体和Cy5标记的溶菌酶 的适配体(简称LYaptamer)以便区分它们。很明显，每种物质的加入只能引起 相应的适配体的荧光增强，而不会相互影响。也证明了我们所建立的传感器可以 用于蛋白类的双通道检测。

(1)PEI-Fe₃O₄的制备及表征

PEI-Fe₃O₄是依据之前报道的共沉淀方法制得，实验中所用的水都是提前经 纯化和去氧的1.3M的FeCl₃﹒6H₂O和0.65M的FeCl₂﹒4H₂O在搅拌的条件下 溶解在水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调节pH，配制的pH 10的月桂酸用于包 被，在N₂保护下，将溶解在50％甲醇中的8％的PEI加入其中，80℃搅拌1.5h。 所得修饰过的Fe₃O溶液分别用无水乙醇和超纯水清洗3次，最后将其溶解在20 mM的pH 7.4的Tris-HCl中放于4℃保存。

我们对所制得的纳米粒子做了TEM、DLS、XRD、以及磁化强度表征，如 图2，由TEM结果可以看出纳米粒子的粒径为10nm左右，同时DLS也显示出 其水和粒径为77.9±0.18nm。XRD的出峰位置说明了所制得的纳米粒子是Fe₃O₄纳米颗粒，磁化强度实验验证了所制得的纳米粒子具有磁性。另外，我们测得此 纳米的Zeta电位为20.5±1.21mV。以上表征结果说明聚乙烯亚胺成功修饰到了 磁性纳米粒子Fe₃O₄的表面，制得的纳米粒子为PEI-Fe₃O₄。

(2)寡核苷酸链/PEI-Fe₃O₄复合物的形成

三条随机DNA链序列：

Randon 1：5’-FAM-AAAAATTATACGCGATGCGATGCGAATTAACTCAC-3’

Random 2：5’-TAMRA-TTAATTTCGCTTTTTGCGCGCAAAATTTTT-3’

Radom 3:5’-HEX-CTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3’

(3)缓冲液终浓度如下：

将缓冲液配成1.5×的溶液。

(4)50nM DNA荧光探针或6-FAM与不同浓度的PEI-Fe₃O₄孵育条件如下：

将以上各组分混匀，30℃水浴20min，自然冷却至室温。使得单链DNA吸 附到PEI-Fe₃O₄的表面，从而使荧光值减小。测得结果绘制成图，如图3，其中 F₀为荧光标记的寡核苷酸的荧光值，F为加入PEI-Fe3O4后荧光标记的寡核苷酸 的荧光值。

(5)核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对凝血酶的检测

核酸适配体序列如下:

按以上体系将各组分依次加入EP管中，共10份，混匀，30℃水浴20min， 自然冷却至室温，使得DNA链吸附到PEI-Fe₃O₄表面，记录加入PEI-Fe₃O₄之后 的荧光值，而后向其中分别加入不同浓度的凝血酶，终浓度为0nM-300nM，30℃ 水浴30min，自然冷却至室温，用荧光分光光度计分别测定荧光值，将测得的数 据整理绘图，如图4，得出荧光探针与PEI-Fe₃O₄组装后，加入不同浓度的凝血 酶可使荧光探针的荧光值恢复，随着凝血酶浓度的增大，荧光值逐渐增强，在凝 血酶浓度达到300nM时，荧光值的变化趋于平稳，由此可根据凝血酶浓度1 nM-300nM这一范围做出能定量检测凝血酶的标准曲线，如图5，y＝96.36ln(x) +49.16，R²为0.980，线性良好，能够准确定量凝血酶的浓度。

(6)核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin的选择性

将BSA和溶菌酶分别溶于ddH₂O配制成相应的蛋白溶液，终浓度为10μM， 分别将这三种蛋白及其与凝血酶的混合物加入到凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄复合物 中。将实验结果整理绘制图表，如图6，在所加入的蛋白类中只有凝血酶存在能 够导致明显的荧光强度增强，其他蛋白类对传感体系的荧光影响不大，这个结果 证明该测凝血酶体系对其他干扰蛋白具有良好的选择性。

(7)核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin和lysozyme的双通道检测

将按以上体系将各组分依次加入EP管中，共4份，混匀，30℃水浴20min， 自然冷却至室温，使得DNA链吸附到PEI-Fe₃O₄表面，记录加入PEI-Fe₃O₄之后 的荧光值，而后分别将100nM的thrombin、lysozyme以及两者的混合物加入到 上述体系中，30℃水浴30min，自然冷却至室温，用荧光分光光度计分别测定荧 光值，将测得的数据整理绘图，如图7，由图表可以看出，两者的检测互不影响。

Claims (9)

1.一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：包括如下方法步骤：

(1)PEI-Fe₃O₄的制备：所述PEI-Fe₃O₄由共沉淀方法制得；

(2)以荧光标记的寡核苷酸与PEI-Fe₃O₄形成的复合物作为生物检测器，具体操作步骤如下：

步骤1：选择三种不同荧光FAM、TAMRA、HEX标记的三条随机寡核苷酸链和6-FAM，分别为Random 1、Random 2、Random 3和Free FAM dye，其中，Free FAM dye为没有连接DNA的FAM荧光基团，分别将以上三条随机链和同浓度的6-FAM加入到缓冲液中，进行荧光检测并记录；

步骤2：将PEI-Fe₃O₄加入到步骤1溶液中，PEI-Fe₃O₄作为固相载体因静电作用吸附自由卷曲状态的寡核苷酸链；

步骤3：选择FAM标记的凝血酶适配体，在凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄复合物中加入凝血酶待测物进行反应；

步骤4：在含有50nM凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄的复合物中加入凝血酶，并检测加入前后荧光值的变化，再加入300nM的凝血酶检测荧光值变化；

(3)核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin的选择性试验及对凝血酶(thrombin)和溶菌酶(lysozyme)的双通道检测试验，其中所用thrombin和lysozyme的浓度均为100nM。

2.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：所述PEI-Fe₃O₄的制备采用经纯化和去氧的1.3M的FeCl₃﹒6H₂O和0.65M的FeCl₂﹒4H₂O在搅拌的条件下溶解在水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调节pH，配制pH 10的月桂酸用于包被，在N₂保护下，将溶解在50％甲醇中的8％的PEI加入其中，80℃搅拌1.5h，所得修饰过的Fe₃O₄溶液分别用无水乙醇和超纯水清洗3次，最后将其溶解在20mM的pH 7.4的Tris-HCl中放于4℃保存。

3.根据权利要求2所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：所制备的PEI-Fe₃O₄纳米粒子进行TEM、DLS、XRD以及磁化强度表征，纳米粒子的粒径为10nm，水和粒径为77.9±0.18nm，Zeta电位为20.5±1.21mV。

4.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：三条随机DNA链序列：

Randon 1：5’-FAM-AAAAATTATACGCGATGCGATGCGAATTAACTCAC-3’

Random 2：5’-TAMRA-TTAATTTCGCTTTTTGCGCGCAAAATTTTT-3’

Radom 3：5’-HEX-CTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3’。

5.根据权利要求1所述的一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：缓冲液终浓度如下：

将缓冲液配成1.5×的溶液。

6.根据权利要求1所述的一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：FAM标记的凝血酶适配体或50nM凝血酶适配体与不同浓度的PEI-Fe₃O₄适配孵育条件如下：

将以上各组分混匀，于30℃水浴20min，自然冷却至室温，使得单链DNA吸附到PEI-Fe₃O₄的表面，从而使荧光值减小。

7.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：FAM标记的凝血酶适配体或50nM凝血酶适配体复合物中加入凝血酶待测物进行反应，核酸适配体序列如下:

TB aptamer 5’-FAM-CTCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’

按以上体系将各组分依次加入EP管中，共10份，混匀，30℃水浴20min，自然冷却至室温，使得DNA链吸附到PEI-Fe₃O₄表面，记录加入PEI-Fe₃O₄之后的荧光值，而后向其中分别加入不同浓度的凝血酶，终浓度为0nM-300nM，30℃水浴30min，自然冷却至室温，用荧光分光光度计分别测定荧光值，将测得的数据整理绘图。

8.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin的选择性试验，序列如下：

将牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶(lysozyme)分别溶于ddH₂O配制成相应的蛋白溶液，终浓度为10μM，分别将这三种蛋白及其与凝血酶的混合物加入到凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄复合物中，绘制图表。

9.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对thrombin和lysozyme的双通道检测试验，序列如下：

TB aptamer：5’-FAM-CTCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’

LY aptamer：5’-Cy5-ATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACTTAG-3’

将按以上体系将各组分依次加入EP管中，共4份，混匀，30℃水浴20min，自然冷却至室温，使得DNA链吸附到PEI-Fe₃O₄表面，记录加入PEI-Fe₃O₄之后的荧光值，而后分别将100nM的thrombin、lysozyme以及两者的混合物加入到上述体系中，30℃水浴30min，自然冷却至室温，用荧光分光光度计分别测定荧光值，将测得的数据整理绘图。