CN109444097A - 一种凝血酶的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种凝血酶检测方法。其基于邻位连接技术，即“proximity ligation assay”，简称PLA，诱导核酸分子发夹转换成DNA酶，即DNAzyme结构，进行熵驱动放大检测。在存在凝血酶的情况下，PLA可以诱导发夹的解锁，然后形成活性DNA酶。随后，DNA酶可以剪切底物链S‑DNA并诱导熵驱动的放大反应，通过将猝灭剂分子与羧基荧光素FAM分离，显著恢复荧光强度。荧光强度和凝血酶浓度之间存在良好的线性关系，范围为5pM至1nM，检测限度计算为1pM，提供了高可靠性和灵敏度。

Description

一种凝血酶的检测方法
技术领域
本发明涉及凝血酶的检测领域，特别是无酶信号放大的凝血酶检测技术。
背景技术
凝血酶是通过凝血酶原的蛋白水解活化产生的丝氨酸蛋白酶。它可以将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白链，以及催化许多其他凝血相关反应。由于激素样特性，凝血酶参与血栓形成和血小板活化过程。此外，凝血酶被用作诊断肺转移的肿瘤标志物。血液中皮摩尔范围的凝血酶检测在相关疾病的临床诊断中具有重要意义。
适体是通过称为“通过指数富集(SELEX)配体的系统进化”的特定过程分离的单链寡核苷酸。适体的目标显示出很大的多样性，例如小分子，肽，蛋白质，甚至细胞。适体可以很容易地进行化学合成和修饰，这使其成为生物传感器设计的一种有前景的识别探针。已经开发了各种基于适体的分析技术用于凝血酶检测，包括比色法，荧光，电化学和表面增强拉曼散射。
PLA(邻位连接技术，即“proximity ligation assay”，简称PLA)是Fredriksson(Fredriksson S,Gullberg M,Jarvius J,et al.Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.[J].Nature Biotechnology,2002,20(5):473-477.)提出的一种高效的蛋白质分析方法。PLA的机制基于通过具有高亲和力的一对探针同时识别蛋白质，导致表面探针的局部浓度增加。探针的高局部浓度提供了相邻DNA序列的高杂交效率。最近，PLA策略在蛋白质组学，代谢组学，生物传感和单细胞成像方面展示了巨大的潜力。此外，通过各种无酶放大策略显着提高了PLA的灵敏度(Koos B,O.Designingand Applying Proximity‐Dependent Hybridization Chain Reaction[M]//CurrentProtocols in Protein Science.John Wiley&Sons,Inc.2016:19.28.1.)。然而，这些由碱基自由能驱动的典型放大策略可能导致相对高的背景和假阳性结果。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种PLA(邻位连接技术，即“proximity ligationassay”，简称PLA)诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构的熵驱动的放大反应，用于凝血酶的检测。
本发明的检测原理为：当不存在凝血酶时，DNA酶的酶链(E-DNA)和底物链(S-DNA)通过分子内杂交锁定在核酸分子发夹结构中，同时抑制了DNA酶的催化活性。在存在凝血酶的情况下，PLA反应导致核酸分子发夹的解锁，形成具有活性DNA酶。DNA酶的催化核心可以在Mg2+的辅助下，将S-DNA在rA位点处裂解。被剪切的DNA部分稳定变差，然后离开DNA酶结构。随后，它可以诱导熵驱动信号放大反应，通过将猝灭剂分子与羧基荧光素(FAM)分离，使得荧光强度显著恢复。
具体而言，DNA酶催化活性受到分子内杂交的发夹结构的抑制。在凝血酶存在下，适体和凝血酶之间的PLA反应使得适体1的核酸分子发夹和适体2的互补部分紧密接近以打开发夹结构。随后形成具有活性二级结构的DNA酶结构。通过DNA酶在Mg2+的辅助下在rA位点剪切S-DNA。然后，由于较低的稳定性，裂解的DNA片段从DNA酶结构释放。释放的DNA片段可以与DNA复合物上DNA序列Q的前端(在图1中表示为结构域4*)结合，然后序列R被链置换反应取代。之后，燃料链序列F可以容易地与序列Q的在图1中表示为暴露出来的结构域2*结合，并通过随后的链置换反应导致羧基荧光素(FAM)与猝灭剂4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(Dabcyl)分离。最后，裂解的DNA片段进入下一个反应循环，引起显着的信号放大。因为碱基对数在整个过程中没有变化，所以放大反应由熵增加而不是来自碱基对形成的自由能提供动力。
本发明包括如下步骤：
(1)核酸分子发夹结构溶液的制备，将适体1制备形成发夹结构，其中，适体1序列为5’-GGTTGGTGTGGTTGGCCCCCCTGTGACAGCGAAGCAGGCCGAGCCTAGTTTTTTTTTCTGrATCGCATTTCTCAAAAAC-3’；
(2)邻位连接技术诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构，将适量待测凝血酶溶液加入到适量步骤(1)所得溶液和适量适体2的混合溶液中，进行PLA诱导发夹转换为DNA酶结构反应，其中，适体2序列为5’-GAGAAATGGTCTGTCACACCCCCCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’；
(3)DNA酶结构的剪切，将步骤(2)所得溶液与10mM MgCl2一起温育30分钟，进行剪切反应；
(4)熵驱动的放大反应，将适量步骤(3)反应所得溶液加入到50nM DNA复合物与50nM燃料链序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应，其中，DNA复合物由序列R，序列S和序列Q杂交后得到，
序列R:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTCGCATTTCTC-3’，
序列S:5’-FAM-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3’，FAM代表羧基荧光素。
序列Q:5’-GTTTTTGAGAAATGCGAAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGG-Dabcyl-3’，Dabcyl代表猝灭剂4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸。
燃料链序列F:5’-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTTCGCATTTCTC-3’；
(5)荧光光谱检测，用荧光光谱仪获取步骤(4)所得溶液的荧光光谱；
(6)计算凝血酶浓度，用标准曲线法，通过荧光强度计算凝血酶浓度。
优选的，待测凝血酶溶液为Tris-HCl稀释的人血清。
优选的，步骤(1)具体为：将含有0.1M NaCl的25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)中的适体1加热至95℃并保持5分钟，然后将其冷却至室温至少2小时以形成核酸分子发夹结构。
优选的，步骤(2)具体为：将10μL待测凝血酶溶液加入到50nM步骤(1)所得溶液和50nM适体2的25mM Tris-HCl溶液中，用0.1M NaCl(pH7.5)在37℃下进行5小时PLA诱导的发夹至DNA酶结构转换反应。
优选的，步骤(4)具体为：将适量步骤(2)反应所得溶液加入到具有5mM MgCl 2和0.1M NaCl的25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)的50nM DNA复合物和50nM序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应。
优选的，步骤(5)具体为：用荧光光谱仪获取步骤(4)所得溶液的500nm至600nm荧光光谱。
优选的，步骤(6)中荧光强度是指520nm处的荧光强度。
本发明创造性地改进现有的PLA技术，提出了PLA诱导发夹转换为DNA酶结构的新构思，并进一步创造性地将其与熵驱动的放大反应结合，用于凝血酶的检测。使得荧光强度和凝血酶浓度之间存在良好的线性关系，范围为5pM至1nM。检测限度计算为1pM。
附图说明
图1为本发明检测过程示意图
图2为空白信号与不同检测方法的信号的强度对比图
具体实施例
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
提供一种PLA诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构的熵驱动的放大反应，用于凝血酶的检测。具体步骤为：
1)核酸分子发夹结构溶液的制备，将含有0.1M NaCl的25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)中的适体1加热至95℃并保持5分钟，然后将其冷却至室温至少2小时以形成发夹结构。其中，适体1序列为5’-GGTTGGTGTGGTTGGCCCCCCTGTGACAGCGAAGCAGGCCGAGCCTAGTTTTTTTTTCTGrATCGCATTTCTCAAAAAC-3’；
2)PLA诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构，将10μL待测凝血酶溶液加入到50nM步骤1)所得溶液和50nM适体2的25mM Tris-HCl溶液中，用0.1M NaCl(pH7.5)在37℃下进行5小时PLA诱导的核酸分子发夹至DNA酶结构转换反应，其中，适体1序列为5’-GAGAAATGGTCTGTCACACCCCCCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’；
3)DNA酶结构的剪切，将上述DNA酶结构与10mM MgCl2一起温育30分钟，进行剪切反应；
熵驱动的信号放大反应，将适量步骤3)反应所得溶液加入到具有5mM MgCl2和0.1M NaCl的25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)的50nM DNA复合物和50nM燃料链序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应。其中，DNA复合物由序列R，序列S和序列Q杂交后得到，
序列R:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTCGCATTTCTC-3’，
序列S:5’-FAM-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3’，FAM代表羧基荧光素。
序列Q:5’-GTTTTTGAGAAATGCGAAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGG-Dabcyl-3’，Dabcyl代表猝灭剂4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸。
燃料链序列F:5’-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTTCGCATTTCTC-3’；
4)荧光光谱检测，用荧光光谱仪获取步骤4)所得溶液的500nm至600nm荧光光谱。；
5)计算凝血酶浓度，用标准曲线法，通过520nm处的荧光强度计算凝血酶浓度。
对比例
为体现上述实施例的技术效果，特提供以下对比例：对比例1：空白样品，即待测凝血酶溶液中凝血酶浓度为零，其余测试过程和上述实施例相同；对比例2：舍去适体2，其余测试过程和上述实施例相同；对比例3：舍去燃料链，即，不含燃料链序列F，其余测试过程和上述实施例相同；对比例4：燃料链的浓度为实施例中燃料链的浓度的一半，即，序列F浓度为25nM，其余测试过程和上述实施例相同；对比例5：熵驱动的放大反应时间为实施例1时间的一半，即，熵驱动放大的孵育时间为30分钟，其余测试过程和上述实施例相同。
结果显示在图1中，1号为对比例1的荧光强度信号，由于在没有凝血酶的情况下没有PLA反应，空白样品的荧光强度很弱。2号为对比例2的荧光强度信号，由于没有适体2，显示出与空白样品相似的荧光强度，这意味着DNA酶仍然被核酸分子发夹结构锁定，并且PLA不会在没有适体2的情况下发生。3号为对比例3的荧光强度信号，由于没有燃料链，也显示出弱的荧光强度，表明在没有燃料链的情况下不启动熵驱动的放大反应。4号为对比例4的荧光强度信号，由于燃料链的浓度为实施例中燃料链的浓度的一半，不能完全完成熵驱动的放大反应。5号为为实施例1的荧光强度信号，PLA，DNA酶剪切和熵驱动的放大反应确实如我们预期的那样起作用。6号为对比例5的荧光强度信号，放大反应时间仅一半时表现出相对强的荧光信号，表明熵驱动的放大反应未完全完成。
可见，本发明的测试过程中每个步骤相互关联形成一个整体，缺一不可。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种凝血酶检测方法，包括如下步骤：
(1)核酸分子发夹结构溶液的制备，将适体1制备形成核酸分子发夹结构，其中，适体1序列为5’-GGTTGGTGTGGTTGGCCCCCCTGTGACAGCGAAGCAGGCCGAGCCTAGTTTTTTTTTCTGrATCGCATTTCTCAAAAAC-3’；
(2)邻位连接技术诱导核酸分子发夹转换为DNA酶结构，将适量待测凝血酶溶液加入到适量步骤(1)所得溶液和适量适体2的混合溶液中，进行PLA诱导发夹转换为DNA酶结构反应，其中，适体2序列为5’-GAGAAATGGTCTGTCACACCCCCCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’；
(3)DNA酶结构的剪切，将步骤(2)所得溶液与10mM MgCl 2一起温育30分钟，进行剪切反应；
(4)熵驱动的放大反应，将适量步骤(3)反应所得溶液加入到50nM DNA复合物与50nM燃料链序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应，其中，DNA复合物由序列R，序列S和序列Q杂交后得到，
序列R:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTCCCTTCGCATTTCTC-3’，
序列S:5’-FAM-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGG-3’，FAM代表羧基荧光素。
序列Q:5’-GTTTTTGAGAAATGCGAAGGGCCGTAAGTTAGTTGGAGACGTAGG-Dabcyl-3’，Dabcyl代表猝灭剂4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸。
燃料链序列F:5’-CCTACGTCTCCAACTAACTTACGGCCCTTCGCATTTCTC-3’；
(5)荧光光谱检测，用荧光光谱仪获取步骤(4)所得溶液的荧光光谱；
(6)计算凝血酶浓度，用标准曲线法，通过荧光强度计算凝血酶浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于待测凝血酶溶液为Tris-HCl稀释的人血清。
3.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(1)具体为：将含有0.1M NaCl的25mM Tris-HCl溶液(pH7.5)中的适体1加热至95℃并保持5分钟，然后将其冷却至室温至少2小时以形成发夹结构。
4.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(2)具体为：将10μL待测凝血酶溶液加入到50nM步骤(1)所得溶液和50nM适体2的25mM Tris-HCl溶液中，用0.1M NaCl(pH7.5)在37℃下进行5小时PLA诱导的核酸分子发夹至DNA酶结构转换反应。
5.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(4)具体为：将适量步骤(2)反应所得溶液加入到具有5mM MgCl2和0.1M NaCl的25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)的50nMDNA复合物和50nM序列F溶液中，孵育60分钟，进行熵驱动的放大反应。
6.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(5)具体为：用荧光光谱仪获取步骤(3)所得溶液的500nm至600nm荧光光谱。
7.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(6)中荧光强度是指520nm处的荧光强度。
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