CN112113936A - 一种铀酰离子的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于熵驱动的催化反应诱导DNA分子发夹转换成DNA酶结构，开发了一种超灵敏的“开启”策略用于铀酰离子的检测。具体而言，铀酰离子特异性DNA酶可以在铀酰离子存在下被切割并产生DNA片段。释放的DNA片段可以启动熵驱动的催化反应以产生大量序列R，序列R可以打开DNA分子发夹的环状结构并转换为Mg2+特异性DNA酶结构，在Mg2+存在下DNA酶剪切反应导致FAM标记物离开金纳米表面，引起强烈的荧光强度恢复。检测限可达4pM。该策略在实际水样中的实际应用中表现出令人满意的结果。该方法可用于水中铀酰离子浓度的现场分析。

Description

一种铀酰离子的检测方法
技术领域
本发明涉及铀酰离子的检测领域，特别是基于熵驱动的催化反应诱导发夹对DNA酶结构转换的铀酰离子检测方法领域。
背景技术
铀具有较高的放射性和遗传毒性，可能对人类健康和环境保护造成严重问题。铀可以进入和沉积在植物和动物体内，通过食物链导致人体内铀的积累。已经发现，即使在痕量浓度下，铀也可能引起长期和严重的疾病，包括肾病，泌尿系统损害和肺癌。铀酰离子(UO2 2+)是人体中最稳定的铀物种，由于其良好的生物利用度，它具有很高的人类健康风险。因此，有必要探索一种灵敏，有选择性的方法来检测UO2 2+的公共安全和环境保护。
目前，铀酰主要通过原子吸收光谱法，原子发射光谱法和标准实验室的电感耦合等离子体质谱分析。然而，这些方法需要昂贵的设备和熟练的操作员。现有技术中已经有基于DNA酶联合荧光，比色法、电化学等用于UO2 2+的检测方法。DNA酶对金属离子具有高选择性和特异性。DNA酶的底物链(S-DNA)可以在特定金属离子存在下被酶链(E-DNA)催化剪切。然而，基于DNA酶的策略的敏感性限制了许多领域的应用和发展。
为了显着提高灵敏度，熵驱动扩增联合比色法，荧光，电化学，电化学发光已被广泛用于检测micro RNA，核酸和生物分子等的检测方法中。由熵增加驱动的熵驱动放大可以有效地避免电路泄漏和传统放大策略的高背景，例如由碱基对的自由能驱动的杂交链反应和发夹催化组装。
尚无基于熵驱动的催化反应以及DNA酶策略的铀酰离子检测方法的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于熵驱动的催化反应诱导发夹对DNA酶结构转换的铀酰离子检测方法。
本发明包括如下步骤：
(1)制备铀酰离子特异性DNA酶和DNA分子发夹修饰的金纳米粒子；
(2)将含铀酰离子的试样溶液加入步骤(1)制备的铀酰离子特异性DNA酶及其底物链的溶液中进行剪切反应；
(3)将步骤(2)所得溶液加入到DNA复合物和燃料链混合溶液中，并加入MgCl2；
(4)将步骤(3)所得溶液加入到步骤(1)制备的发夹修饰的金纳米粒子溶液中；
(5)检测步骤(4)所得溶液的荧光信号，并利用标准曲线得出试样溶液中铀酰离子的浓度。
其中，所述铀酰离子特异性DNA酶序列为：DNA酶链5’-CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT-3’；DNA底物链5’-CTTCTACAACT-CACTATrAGGAAGAGATGGACGTG-3’。
其中，所述DNA分子发夹序列为:5’-HS-TTGTGACAGCGAAGCAGGCCGAGCCTAGTTTTTTTTTCTGrATCGCATTTCTACAAAAAC-FAM-3’。
其中，所述DNA复合物序列为:R:5’-GGTAGAAATGGTCTGTCACAATTACGCAGCGA-3’；P:5’-TATTCGGCCGGCACCCATGTGAGAGAACTTCTACAACT-3’；Q：5’-ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCTTCGCTGCGTAATTGTGACA GACCA-3’。
其中，所述燃料链为序列为:5’-TGGTCTGTCACAATTACGCAGCGA-AGAA-CTTCTACAACT-3’。
优选的，步骤(2)具体为：将100nM铀酰离子特异性DNA酶的底物链和100nM铀酰离子特异性DNA酶加热至90℃并在含有300mM NaCl的10mM MES缓冲液(pH5.5)中缓慢冷却，然后加入含铀酰离子的试样溶液用于DNA酶剪切反应，室温下20分钟。
优选的，步骤(3)具体为：将步骤(2)所得溶液加入到50nM DNA混合物(DNA复合物和燃料链)中，在25℃，25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中加入0.1M NaCl 60分钟。
优选的，步骤(4)的孵育时间为5小时。
优选的，步骤(5)中荧光信号为500nm至600nm测量荧光信号。
本发明创造性地将熵驱动的催化反应以及DNA酶策略联用，不仅多级放大铀酰离子信号，提高了灵敏度，还使得检测过程容易操作，成本降低。
附图说明
图1为本发明的原理图。
图2为改变检测条件后的信号强度图。
图3为相同浓度的不同金属离子产生的荧光信号。
图4(A)为不同浓度标准溶液所得荧光信号图。图4(B)为标准曲线为。
具体实施方式
下面结合实施方式对本发明作进一步详细的说明。
如图1所示，本发明的原理为：在铀酰离子存在下，铀酰离子特异性DNA酶被剪切并释放DNA片段。然后它可以与DNA复合物的序列Q结合，并通过竞争反应置换序列P。在序列P离开后暴露序列Q上的新的立足点结构域。然后，燃料链可以在新形成的立足点结构域与序列Q结合。由于燃料链和序列Q之间的更多互补碱基对，燃料链可以通过竞争反应置换序列R和DNA酶的DNA片段。被替换的DNA片段可以与另一个DNA复合物结合用于下一个竞争反应循环。重要的是，该过程由熵增加驱动，因为在反应前后反应物和产物总碱基对数是恒定的。此外，序列R可以诱导金纳米粒子上的DNA分子发夹转换为Mg2+特异性DNA酶结构。随后，用Mg2+帮助剪切FAM标记的Mg2+特异性DNA酶的底物链。切割的FAM标记的DNA序列可以离开金纳米粒子的表面并引起荧光强度的增加。同时，序列R也可以被释放并与相邻的发夹重新结合以形成另一种Mg2+特异性DNA酶结构。因此，通过两级扩增策略显着增强荧光强度。铀酰的浓度可以通过荧光强度计算。
下列实验验证了本发明检测方法的可行性：将检测过程“将100nM铀酰离子特异性DNA酶的底物链和100nM铀酰离子特异性DNA酶链加热至90℃并在含有300mM NaCl的10mMMES缓冲液(pH5.5)中缓慢冷却。然后加入将适量含铀酰离子的样品溶液加入上述溶液用于DNA酶剪切反应，室温下20分钟。对于熵驱动的扩增反应，将上述溶液加入到50nM DNA混合物(DNA复合物和燃料链)中，在25℃，25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中加入0.1M NaCl 60分钟。然后，加入发夹修饰的金纳米粒子和5mM MgCl2和并孵育5小时，用于DNA分子发夹结构转换和Mg2+特异性DNA酶循环剪切反应。最后，通过石英比色皿从500nm至600nm测量荧光信号”命名为最佳检测过程。改变所述最佳检测过程中一些实验条件做了如下并列实验：样品1是空白样品，即，不含铀酰离子，其余过程同按照最佳监测过程，检测结果显示弱荧光信号，这是由于在不存在铀酰离子的情况下抑制了熵驱动的催化反应。样品2中R的序列变为R'(R序列:5’-GGTAGAAATGGTCTGTCACAATTACGCAGCGA-3’；和R’序列：5’-CCATCTTTTGGTCTGTCACAATTACGCAGCGA-3’)，其余过程同按照最佳监测过程，产生与空白样品一样强的弱荧光信号。这表明R'序列不能诱导发夹进行DNA酶结构转换。样品3中没有Mg2+其余过程同按照最佳监测过程，结果显示弱荧光强度。这归因于金纳米粒子上形成的Mg2+特异性DNA酶不能在不存在Mg2+的情况下剪切。样品4具有25nM(原浓度的一半)燃料链，其余过程同按照最佳监测过程，熵驱动的催化反应速率缓慢，只产生相对强的信号。样品5孵育时间为30分钟，其余过程同按照最佳监测过程，由于不完全熵驱动的催化反应，孵育时间为30分钟，样品5中的荧光强度也只是相对较强。样品6和所述最佳检测过程完全相同，显示出最佳信号强度。检测结果如图2所示。
特异性方面，将上述最佳检测过程中“含铀酰离子的样品溶液”改变为含相同浓度的Zn2+，Cu2+，Fe2+，Pb2+，Ca2+，Sn2+，Co2+或Mg2+的溶液，其余检测过程同所述最佳检测过程，所得荧光信号如图3所示。可见，其他金属离子的荧光强度远低于铀酰离子，表明即使浓度是铀酰离子的10倍，其他金属离子的干扰也可以忽略不计。该方法的良好选择性可归因于铀酰离子特异性DNA酶的强特异性。
绘制标准曲线：
配制梯度浓度的铀酰离子标准溶液，溶液浓度分别为：20pM，50pM，100pM，200pM，400pM，800pM。
将100nM铀酰离子特异性DNA酶的底物链和100nM铀酰离子特异性DNA酶加热至90℃并在含有300mM NaCl的10mM MES缓冲液(pH5.5)中缓慢冷却。然后加入将适量上述标准溶液分别加入6份上述溶液用于DNAzyme剪切反应，室温下20分钟。对于熵驱动的扩增反应，将上述溶液加入到50nM DNA混合物(DNA复合物和燃料链)中，在25℃，25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中加入5mM MgCl2和0.1M NaCl 60分钟。然后，加入加入发夹修饰的金纳米粒子和5mM MgCl2并孵育5小时，用于发夹结构转换和Mg2+特异性DNAzyme循环剪切反应。最后，通过石英比色皿从500nm至600nm测量荧光信号，如图4(A)。绘制荧光强度-浓度标准曲线，如图4(B)所示。
由图4(A)和图4(B)可以看出，518nm处的荧光响应随着UO2 2+的浓度而增加。良好的线性关系显示荧光强度和UO2 2+浓度之间的范围为20至800pM。检测限为4pM(3σ空白标准)，远低于美国环保署规定的最大污染水平130nM。此外，LOD具有可比性，甚至低于其他报道的方法。高灵敏度归因于熵驱动扩增和Mg2+特异性DNA酶的环状切割的两个水平的扩增反应。此外，该方法显示出令人满意的铀酰离子检测重现性。对于50nM，200nM和800nM，相对标准偏差(RSD)分别为8.5％，7.9％和6.7％。
检测实际样品中的铀酰离子：
通过不同的水样(饮用水，自来水和河水)评估了该方法检测铀酰离子的可行性和适用性。通过离心纯化水样并用0.22μm膜过滤。将上述样品的pH调节至5.5。然后根据所述最佳检测过程检测样品。加入不同浓度的铀酰离子的样品用于回收试验。如表1所示，UO2 2+的浓度为0.65,0.96和1.77nM。通过该策略获得了93.0-109.0％的良好回收结果，相对标准偏差(RSD)为5.2％至9.7％。该结果显示该方法在水样中实际检测铀酰的巨大潜力。
Table 1.检测实际样品中的铀酰离子结果
Figure BDA0002102511260000041
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种溶液中铀酰离子浓度的检测方法，包括如下步骤：
(1)制备铀酰离子特异性DNA酶和DNA分子发夹修饰的金纳米粒子；
(2)将含铀酰离子的试样溶液加入步骤(1)制备的铀酰离子特异性DNA酶链及其底物链的溶液中进行剪切反应；
(3)将步骤(2)所得溶液加入到DNA复合物和燃料链混合溶液中；
(4)将步骤(3)所得溶液加入到步骤(1)制备的发夹修饰的金纳米粒子溶液中，并加入5mM MgCl2；
(5)检测步骤(4)所得溶液的荧光信号，并利用标准曲线得出试样溶液中铀酰离子的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述铀酰离子特异性DNA酶序列为：DNA酶链5’-CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT-3’；DNA底物链:5’-CTTCTACAACT-CACTATrAGGAAGAGATGGACGTG-3’。
3.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于所述DNA分子发夹序列为:5’-HS-TTGTGACAGCGAAGCAGGCCGAGCCTAGTTTTTTTTTCTGrATCGCATTTCTACAAAAAC-FAM-3’。
4.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于所述DNA复合物序列为:R:5’-GGTAGAAATGGTCTGTCACAATTACGCAGCGA-3’；P:5’-TATTCGGCCGGCACCCATGTGAGAGAACTTCTACAACT-3’；Q：5’-ATAGTGAGTTGTAGAAGTTCTTCGCTGCGTAATTGTGACA GACCA-3’。
5.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于所述燃料链为序列为:5’-TGGTCTGTCACAATTACGCAGCGAAGAACTTCTACAACT-3’。
6.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(2)具体为：将100nM铀酰离子特异性DNA酶的底物链和100nM铀酰离子特异性DNA酶链加热至90℃并在含有300mM NaCl的10mM MES缓冲液(pH5.5)中缓慢冷却，然后加入含铀酰离子的试样溶液用于DNA酶剪切反应，室温下20分钟。
7.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(3)具体为：将步骤(2)所得溶液加入到50nM DNA混合物(DNA复合物和燃料链)中，在25℃，25mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.5)中加入0.1M NaCl60分钟。
8.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(4)的孵育时间为5小时。
9.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤(5)中荧光信号为500nm至600nm测量荧光信号。
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