CN107012208A - 一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒。以铅离子特异性识别的脱氧核酶为分子识别元件，设计茎环结构核酸，结合核酸外切酶III的选择性切割作用，实现检测信号的循环放大。以G‑四聚体为信号报告分子，实现免标记分析。本发明具有较高的灵敏度，对铅离子的检测限为10 pM，检测具有很好的特异性，常见干扰物对检测不产生影响。检测过程无需检测仪器，结果直接肉眼可见，具有操作简单，成本低廉，响应迅速等优点，可用于环境或食品样品中铅离子含量的快速检测。

Description

一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒。

背景技术

铅离子（Pb²⁺）是一种有神经毒性的重金属元素，对人体危害严重，可对神经系统、血液系统、消化系统和肾脏等造成危害。美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量不得超过72 nM。

目前，常规的铅离子检测方法主要有原子吸收光谱，电感耦合等离子体质谱法，原子荧光光谱等方法。这些方法需要分离富集，操作繁琐费时或需配置大型仪器，不利于快速现场检测。近年来，利用对Pb²⁺敏感的脱氧核酶（17DS-17E DNAzyme）为分子识别元件检测Pb²⁺的方法备受关注（D. Mazumdar, J. Liu, G.Lu, J. Zhou and Y. Lu,Chem. Commun.,2010, 46, 1416-1418），已建立荧光、电化学以及胶体金比色法等分析技术，但大多需要进行标记， 或需要使用检测仪器获得数据，因而限制了这些技术的广泛应用。因此，迫切需要建立一种新型检测技术用于铅离子的检测，使检测过程无需使用检测仪器，检测结果直接肉眼可见，并使检测体系无需标记，从而节约成本。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明旨在利用铅离子特异性识别的脱氧核酶为识别元件，结合工具酶介导的信号扩增，以G-四聚体为信号报告分子，建立一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种免标记铅离子可视化检测试剂盒，包括DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系，氯高铁血红素，还包括下列成分：核酸序列17DS、17E、H1以及核酸外切酶III。

具体分析如下：

底物链核酸序列17DS：碱基数为40-48个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列（铅离子（Pb²⁺）特异性识别的脱氧核酶）；其中rA为切割位点，rA-G左右两旁的5个碱基与17E互补；17DS的3'端有至少6个碱基不与17E互补，在17E的3'端有至少6个碱基不与17DS互补（防止17DS-17E被核酸外切酶III切掉）；当有铅离子存在时，催化链切割底物链，切割位点为rA，切割后的底物链分割为两部分，其中靠近17DS的5'端部分记名为A区，用于启动下一步反应；如果没有铅离子存在，那么催化链和底物链还是继续互补结合在一起。

催化链核酸序列17E：碱基数为36-42个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列（铅离子（Pb²⁺）特异性识别的脱氧核酶），其中TCCGAGCCGGTCGAAA构成一个凸起部分，凸起部分左右两旁的5个碱基与17DS互补；17E的3'端至少有6个碱基不与17DS互补；其反应原理见上说明。

核酸序列H1；从3'端开始依次为B区域、C区域和D区域，其中C区和部分D区互补，构成茎环结构的茎部分，B凸起于茎结构外；H1的B与17DS切割后的A区的5'端互补，A的3'端凸起；B与A的部分互补后，B的3'端凸起变成平末端；加入核酸外切酶III，核酸外切酶III可以从平末端的双链DNA中的3'端开始切割核酸，从而把H1的B切掉成单个核苷酸；当B被切掉后，H1的C又变成平末端，核酸外切酶III又可以切割C，从而打开茎环H1，释放H1上的D序列；C的碱基数为5-10个，过短或过长都不利于形成茎环结构，优选的碱基数为7个。同时A由于其3'端凸起，无法被切割，因此，A又可以循环进入下一轮信号扩增，不断切割H1，最后释放大量的核酸序列D。

其中，D是富含G碱基的核酸序列，加入氯高铁血红素（Hemin）后，会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H₂O₂（四甲基联苯胺-双氧水）、OPD-H₂O₂（邻苯二胺-双氧水）或ABTS-H₂O₂（2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水）检测体系，产生有色底物，结果肉眼可见，从而达到检测铅离子的目的。

此外，还包括核酸外切酶III。

优选的，H1的D区域的核酸序列包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。

优选的，H1的D区域的核酸序列为GGGTAGGGCGGGTTGGG。

优选的，H1的C区碱基数为5-10个，过短或过长都不利于形成茎环结构。

优选的，H1的C区碱基数为7个。

优选的，杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，20 mM，pH为7.4，含有200 mM NaCl以及50mM KCl。

优选的，显色缓冲液体系由显色缓冲液、底物以及双氧水构成，包括四甲基联苯胺-双氧水缓冲液体系、邻苯二胺-双氧水缓冲液体系或2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水缓冲液体系。

优选的，底物链核酸序列17DS， 催化链核酸序列17E，核酸序列 H1，其序列如下所示：

17DS：5'-CGACATCTACCTAGCACTC-ACTAT（A）-rA-G-GAAGA-GATGAAAAAA-3'（SEQ ID NO：1）；

17E: 5'-CATC-TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG-AGTAAAAAA-3'（SEQ ID NO：2）；

H1: 5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG（D）-CCTACCC（C）-AGTGCTAGGTAGATGTCG（B）-3'（SEQ IDNO：3）。

一种免标记铅离子可视化检测方法，包括下列步骤：

1)先用杂交缓冲液分别溶解17DS、17E以及H1，将等量的17DS与17E混合，室温反应30分钟，形成17DS-17E混合物；

2)将待测溶液加入到17DS-17E混合物中，室温反应45分钟，完成切割反应；

3)加入H1和核酸外切酶III，室温反应90分钟；

4)加入适量氯高铁血红素，室温反应30分钟，取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液体系中，室温反应15分钟，观察颜色变化；当有铅离子时，溶液显色，当没有铅离子时，溶液无色；

其中，17DS、17E、H1以及DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系如上述任意一项所示。

本发明的有益效果是：

本发明以铅离子特异性识别的脱氧核酶为分子识别元件，通过设计茎环结构核酸，结合核酸外切酶III选择性切割作用，实现检测信号的放大。以G-四聚体为信号报告分子，可现实免标记检测，简化了操作，节约了成本。同时检测结果直接肉眼可见，无需检测仪器。整个检测过程响应迅速，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。本发明所述的检测方法和检测试剂盒对环境或食品中铅离子的快速检测具有重要意义。

附图说明

图1为本发明所述的检测方法的原理图；

图2为对不同浓度的铅离子检测的结果图；

图3为特异性实验结果图。

具体实施方式

一种免标记铅离子可视化检测试剂盒，包括DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系，氯高铁血红素，还包括下列成分：核酸序列17DS、17E、H1以及核酸外切酶III。

具体分析如下：

底物链核酸序列17DS：碱基数为40-48个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列（铅离子（Pb²⁺）特异性识别的脱氧核酶）；其中rA为切割位点，rA-G左右两旁的5个碱基与17E互补；17DS的3'端有至少6个碱基不与17E互补，在17E的3'端有至少6个碱基不与17DS互补（防止17DS-17E被核酸外切酶III切掉）；当有铅离子存在时，催化链切割底物链，切割位点为rA，切割后的底物链分割为两部分，其中靠近17DS的5'端部分记名为A区，用于启动下一步反应；如果没有铅离子存在，那么催化链和底物链还是继续互补结合在一起。

催化链核酸序列17E：碱基数为36-42个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列（铅离子（Pb²⁺）特异性识别的脱氧核酶），其中TCCGAGCCGGTCGAAA构成一个凸起部分，凸起部分左右两旁的5个碱基与17DS互补；17E的3'端至少有6个碱基不与17DS互补；其反应原理见上说明。

核酸序列H1；从3'端开始依次为B区域、C区域和D区域，其中C区和部分D区互补，构成茎环结构的茎部分，B凸起于茎结构外；H1的B与17DS切割后的A区的5'端互补，A的3'端凸起；B与A的部分互补后，B的3'端凸起变成平末端；加入核酸外切酶III，核酸外切酶III可以从平末端的双链DNA中的3'端开始切割核酸，从而把H1的B切掉成单个核苷酸；当B被切掉后，H1的C又变成平末端，核酸外切酶III又可以切割C，从而打开茎环H1，释放H1上的D序列；C的碱基数为5-10个，过短或过长都不利于形成茎环结构，优选的碱基数为7个。同时A由于其3'端凸起，无法被切割，因此，A又可以循环进入下一轮信号扩增，不断切割H1，最后释放大量的核酸序列D。

其中，D是富含G碱基的核酸序列，加入氯高铁血红素（Hemin）后，会形成具有催化活性的G四聚体结构。它们能催化氧化TMB-H₂O₂（四甲基联苯胺-双氧水）、OPD-H₂O₂（邻苯二胺-双氧水）或ABTS-H₂O₂（2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水）检测体系，产生有色底物，结果肉眼可见，从而达到检测铅离子的目的（反应原理见图1）。

此外，还包括核酸外切酶III。

优选的，H1的D区域的核酸序列包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。

优选的，H1的D区域的核酸序列为GGGTAGGGCGGGTTGGG，但不限于此。

优选的，H1的C区碱基数为5-10个，过短或过长都不利于形成茎环结构。

优选的，H1的C区碱基数为7个。

优选的，杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，20 mM，pH为7.4，含有200 mM NaCl以及50mM KCl。

优选的，显色缓冲液体系由显色缓冲液、底物以及双氧水构成，包括四甲基联苯胺-双氧水缓冲液体系、邻苯二胺-双氧水缓冲液体系或2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水缓冲液体系。

优选的，底物链核酸序列17DS， 催化链核酸序列17E，核酸序列 H1，其序列如下所示：

17DS：5'-CGACATCTACCTAGCACTC-ACTAT-rA-G-GAAGA-GATGAAAAAA-3'（SEQ ID NO：1）；

17E: 5'-CATC-TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG-AGTAAAAAA-3'（SEQ ID NO：2）；

H1: 5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTACCC-AGTGCTAGGTAGATGTCG-3'（SEQ ID NO：3）。

一种免标记铅离子可视化检测方法，包括下列步骤：

1)先用杂交缓冲液分别溶解17DS、17E以及H1，将等量的17DS与17E混合，室温反应30分钟，形成17DS-17E混合物；

2)将待测溶液加入到17DS-17E混合物中，室温反应45分钟，完成切割反应；

3)加入H1和核酸外切酶III，室温反应90分钟；

4)加入适量氯高铁血红素，室温反应30分钟，取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液体系中，室温反应15分钟，观察颜色变化；当有铅离子时，溶液显色，当没有铅离子时，溶液无色；

其中，17DS、17E、H1以及DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系如上述任意一项所示。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

一种免标记铅离子可视化检测方法按照如下步骤进行：

（1）先用Tris-HCl缓冲液（20 mM，pH为7.4，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl）分别溶解17DS、17E以及H1。300 nM的17DS与300 nM的17E混合，室温反应30分钟，形成17DS-17E混合物。

（2）把不同浓度的铅离子加入到17DS-17E混合物中，室温反应45分钟，完成切割反应。

（3）加入1 M的H1和25U的核酸外切酶III，室温反应90分钟。

（4）加入0.3 M 的hemin（氯高铁血红素），室温反应30分钟。取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液中（含有26.6 mM 柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 L 0.5%的TMB，20 L 30%的H₂O₂，pH=5.0），室温反应15分钟，观察颜色变化。当有铅离子时，溶液变蓝，当没有铅离子时，溶液无色。

实施例2

一种免标记铅离子可视化检测试剂盒包括以下成分：

（1）核酸序列17DS， 17E， H1，它们的序列如下：

17DS：5'-CGACATCTACCTAGCACTCACTAT（A）rA-G-GAAGAGATGAAAAAA-3'（SEQ ID NO：1）；

17E: 5'-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTGAGTAAAAAA-3'（SEQ ID NO：2）；

H1: 5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG（D）-CCTACCC（C）-AGTGCTAGGTAGATGTCG（B）-3'（SEQ IDNO：3）；

（2）Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl；

（3）氯高铁血红素；

（4）显色缓冲液体系，包含有26.6 mM 柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 uL0.5%的TMB，20 uL 30%的H₂O₂，pH=5.0。

实施例3

对不同浓度铅离子的检测：

配制铅离子标准溶液，浓度分别为10 pM、100 pM、1 nM、10 nM和100 nM，室温保存。

将不同浓度的铅离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图2所示，10 pM的铅离子可产生明显的蓝色变化，说明其检测限为10 pM。随着铅离子浓度增加，颜色也增加，并逐渐趋于饱和。

实施例4

特异性实验：

配制100 nM不同离子的标准溶液，它们分别是Hg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Ag⁺和Cd^{2 +}。

将100 nM的不同干扰物标准溶液和100 pM 铅离子溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，100 nM 的Hg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Co²⁺、Ag⁺和Cd²⁺没有产生颜色变化，对检测不产生影响。只有当加入铅离子后才会产生蓝色，这证明该方法对铅离子的检测具有很好的特异性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省生态环境技术研究所

<120> 一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgacatctac ctagcactca ctatraggaa gagatgaaaa aa 42

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catctcttct ccgagccggt cgaaatagtg agtaaaaaa 39

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggtagggcg ggttgggcct acccagtgct aggtagatgt cg 42

Claims (9)

1.一种免标记铅离子可视化检测试剂盒，包括DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系，氯高铁血红素，其特征在于，还包括下列成分：

底物链核酸序列17DS：碱基数为40-48个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段ACTAT-rA-G-GAAGA的序列；其中rA为切割位点，rA-G左右两旁的5个碱基与17E互补；17DS的3'端有至少6个碱基不与17E互补；当有铅离子存在时，催化链切割底物链，切割位点为rA，切割后的底物链分割为两部分，其中靠近17DS的5'端部分记名为A区，用于启动下一步反应；

催化链核酸序列17E：碱基数为36-42个，从5'端开始向3'端延伸过程中，包含有一段TCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTG的序列，其中TCCGAGCCGGTCGAAA构成一个凸起部分，凸起部分左右两旁的5个碱基与17DS互补；17E的3'端至少有6个碱基不与17DS互补；

核酸序列H1；从3'端开始依次为B区域、C区域和D区域，其中C区和部分D区互补，构成茎环结构的茎部分，B凸起于茎结构外；H1的B与17DS切割后的A区的5'端互补，A的3'端凸起；D区为富含G碱基的核酸序列，加入氯高铁血红素后，会形成具有催化活性的G四聚体结构；

以及核酸外切酶III。

2.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的D区域的核酸序列包含有四组GGG序列，各组GGG序列中间隔1-3个非G碱基。

3.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的D区域的核酸序列为GGGTAGGGCGGGTTGGG。

4.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的C区碱基数为5-10个。

5.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：H1的C区碱基数为7个。

6.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，20 mM，pH为7.4，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl。

7.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：显色缓冲液体系由显色缓冲液、底物以及双氧水构成，包括四甲基联苯胺-双氧水缓冲液体系、邻苯二胺-双氧水缓冲液体系或2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐-双氧水缓冲液体系。

8.根据权利要求1所述的铅离子可视化检测试剂盒，其特征在于：底物链核酸序列17DS， 催化链核酸序列17E，核酸序列 H1，其序列如下所示：

17DS：5'-CGACATCTACCTAGCACTCACTAT-rA-G-GAAGAGATGAAAAAA-3'；

17E: 5'-CATCTCTTC-TCCGAGCCGGTCGAAA-TAGTGAGTAAAAAA-3'；

H1: 5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-CCTACCC-AGTGCTAGGTAGATGTCG-3'。

9.一种免标记铅离子可视化检测方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)先用杂交缓冲液分别溶解17DS、17E以及H1，将等量的17DS与17E混合，室温反应30分钟，形成17DS-17E混合物；

2)将待测溶液加入到17DS-17E混合物中，室温反应45分钟，完成切割反应；

3)加入H1和核酸外切酶III，室温反应90分钟；

4)加入适量氯高铁血红素，室温反应30分钟，取出50 L反应液，加入到950 L显色缓冲液体系中，室温反应15分钟，观察颜色变化；当有铅离子时，溶液显色，当没有铅离子时，溶液无色；

其中，17DS、17E、H1以及DNA杂交缓冲液，显色缓冲液体系如权利要求1～8任意一项所示。