CN104726573A - 一种基于核酸外切酶和g四聚体的分子检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

一种基于核酸外切酶和g四聚体的分子检测方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。分子与核酸适体相互作用，启动链置换反应，打开茎环结构DNA，再与核酸外切酶介导的信号放大技术结合，从而可以产生大量的具有活性的G四聚体结构。G四聚体与hemin结合，从而具有HRP的催化活性，催化氧化TMB，产生蓝色底物，结果肉眼可见，分子的浓度与蓝色深浅直接相关。本发明操作简单，可在室温下完成整个反应，具有较高的灵敏度，对17b-雌二醇的检测限为1 pM，具有很好的特异性，检测结果直接肉眼可见，无需检测仪器，可用于分子的实地现场快速检测。

Description

一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种分子检测方法，特别涉及一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。
背景技术
环境中存在多种对人体有害的分子，快速、低成本地检测出这些有害小分子具有非常实际的意义。
17b-雌二醇被认为是作用最强烈、最具潜在影响的一类内分泌干扰物，广泛存在于河流、土壤、大气以及农产品中。它主要来源于杀虫剂、废气、食品添加剂、人畜排泄物及生活污水，即使在极低的浓度下也会对生物体产生明显的影响，其含量水平与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌以及男性生殖障碍具有显著相关性。传统的17b-雌二醇检测方法主要有高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等，这些方法需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器，检测成本高、费时耗力，需要经验丰富的操作人员，而且难以实现大批量样本的现场快速分析。另一种方法是以抗体来检测17b-雌二醇，但是抗体的制备过程繁琐，保存麻烦，而且要涉及多次洗涤与分离过程，因而限制了它们的广泛应用。
G四聚体序列是由富含G碱基的一段单链DNA组成，在缓冲体系和hemin（氯高铁血红素）存在的情况下，可折叠成G四聚体二级结构。G四聚体具有类似HRP（辣根过氧化物酶）的催化活性，可催化氧化TMB（四甲基联苯胺）产生蓝色底物，使反应溶液肉眼可见。以G四聚体来检测分子具有操作简单，方便现场快速分析等优点。但是基于G四聚体的比色法检测灵敏度低，需要进一步提高灵敏度。传统的信号放大技术主要是PCR以及一系列依赖工具酶的信号扩增技术，但是酶的使用不仅增加了成本和操作步骤，而且酶的存储也比较麻烦，因此需要研发一种无需工具酶信号扩增技术来提高检测灵敏度。
核酸适体（aptamer，源于拉丁语）指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括核酸外切酶和如下核酸序列：
DNA1：待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸中，靠近核酸适体一端的为1*区，其余部分记为2*区；
DNA2：DNA2与DNA1的1*区和核酸适体的部分核酸连续互补配对，DNA2的另一端至少有4个碱基不与DNA1互补配对；
DNA3：具有茎环结构，其一端为1区，中间依次为2区和连接序列，另一端为G四聚体序列，G四聚体至少有6个碱基的核酸序列位于茎环结构的茎上，DNA3的1区与DNA1的1*区完全互补配对，2区与2*区靠近1*区核酸至少部分连续互补配对。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，1*区至少具有6个碱基，2*区至少具有24个碱基。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，DNA2中至少有6个碱基与待测分子核酸适体连续互补配对。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，待测分子为17b-雌二醇，核酸序列如下：
DNA1：5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-GCAGAT-GGGTTGGGATTACGATAGATAATA-3'（SEQ ID NO：1）；
DNA2：5'-ATCTGCGCTTCCGCGCTTATAATA-3'（SEQ ID NO：2）；
DNA3：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-ATTACGATAGTCCAATCACAACCTATCGTAATCCCAACCC-ATCTGC-3'（SEQ ID NO：3）；
DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl；
TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 μL 0.5%的TMB，20 μL 30%的H2O2，pH=5.0。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，核酸外切酶为核酸外切酶Ⅲ。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，对DNA1的1*、2*区，DNA2和DNA3核酸序列中至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基互补配对原则的情况下，提高核酸序列之间的亲和力。
一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法，包括如下步骤：
1)      将DNA1和过量DNA2于DNA杂交缓冲液中混合反应，形成DNA1-DNA2复合体；
2)      将DNA1-DNA2复合体、待测样品混合反应完全；
3)      加入DNA3、核酸外切酶，混合反应完全；
4)      加入氯高铁血红素，反应完全后与TMB显色缓冲液混合反应，根据反应液的颜色变化确定检测结果，反应液变蓝说明待测样品中存在待测分子；
其中，DNA1～DNA3如上所述。
作为上述分子检测方法的进一步改进，DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl。
作为上述分子检测方法的进一步改进，TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 μL 0.5%的TMB，20 μL 30%的H2O2，pH=5.0。
本发明的有益效果是：
本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度，对17b-雌二醇的检测限为1 pM，检测结果肉眼可见，适于现场快速分析。
本发明所述的分子检测方法应用核酸适体实现待测分子的捕捉，具有很好的特异性，其他常见的干扰物对检测不产生影响。
以G四聚体作为信号报告分子，与核酸外切酶介导的信号放大技术结合，可产生大量的具有催化活性的G四聚体，整个操作简单，经济便宜，不需要使用任何检测仪器，不需要专业技术人员，无须培训即可推广使用。
附图说明
图1是本发明检测方法的原理示意图；
图2为不同浓度17b-雌二醇检测的结果图；
图3为特异性实验结果图。
具体实施方式
一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，还包括核酸外切酶和如下核酸序列：
DNA1：待测分子核酸适体的一端适当延伸（3'端和5'端均可），形成DNA1，延伸的核酸中，靠近核酸适体一端的为1*区，其余部分记为2*区；
DNA2：DNA2与DNA1的1*区和核酸适体的部分核酸连续互补配对，以确保DNA1-DNA2复合物的稳定性；DNA2的另一端至少有4个碱基不与DNA1互补配对，防止被核酸外切酶切割；
DNA3：具有茎环结构，其一端为1区，中间依次为2区和连接序列，另一端为G四聚体序列；G四聚体至少有6个碱基的核酸序列位于茎环结构的茎上，此时的G四聚体没有催化活性；DNA3的1区与DNA1的1*区完全互补配对，2区与2*区靠近1*区核酸至少部分连续互补配对，以确保DNA1-DNA3复合物的稳定性。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，1*区至少具有6个碱基，以确保结合的稳定性。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，2*区至少具有24个碱基，其中2*区与DNA3的2区部分结合，以确保DNA1-DNA3复合物的稳定性。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，DNA2中至少有6个碱基与待测分子核酸适体连续互补配对，以确保结合的稳定性。同时DNA2与待测分子核酸适体的碱基互补配对数也不宜过多，一般不超过20个碱基互补配对，以免影响待测分子与DNA1中的核酸适体竞争性结合从而把DNA2置换下来。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，核酸外切酶优选为核酸外切酶Ⅲ。因为核酸外切酶Ⅲ能从平末端的3'端到5'端切割双链DNA，核酸外切酶Ⅲ不能切割凸出来的3'端也不能切割平末端的5'端。
作为上述分子检测试剂盒的进一步改进，对DNA1的1*、2*区，DNA2和DNA3核酸序列中至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基互补配对原则的情况下，提高核酸序列之间的亲和力。如通过锁核酸修饰以提高碱基之间的亲和力，使用较短的序列实现本发明的技术方案。
下面结合附图，以17b-雌二醇的检测为例，进一步说明本发明的检测原理：
如图1所示，17b-雌二醇的核酸适体的3'端适当延伸，形成DNA1，将DNA1和DNA2在缓冲体系中反应一段时间，DNA2与DNA1的1*区以及核酸适体3'端的至少6个碱基连续互补配对，形成DNA1-DNA2复合物。其中DNA2的3'端至少有4个碱基不与DNA1互补（防止被核酸外切酶Ⅲ切割）。在DNA1-DNA2复合物中，DNA1中的1*区域被DNA2封闭。
当DNA1-DNA2反应体系中存在17b-雌二醇时，17b-雌二醇将与核酸适体相互作用，从而把DNA1-DNA2复合物中的DNA2置换下来，使DNA1中的1*区域暴露出来。如无17b-雌二醇的存在，DNA1-DNA2复合物稳定存在，DNA1中的1*区域无法暴露。
在茎环结构DNA3中，3'端有凸出的1区域（该区域能与DNA1中的1*区域互补，同时该区域凸出又能防止被核酸外切酶Ⅲ切割），中间依次为2区和连接序列，5'端有G四聚体序列，该G四聚体至少有6个碱基的核酸序列位于茎环结构DNA3中的茎部分，一部分在茎以外。没有打开的茎环结构DNA3中由于G四聚体部分处于茎部分，因此该G四聚体没有催化活性。
DNA1中的暴露的1*区域与茎环结构DNA3中1区域互补，从而启动DNA链置换反应，打开茎环结构DNA3。同时加入核酸外切酶Ⅲ。此时DNA3的茎环结构被打开，核酸外切酶Ⅲ从3'端开始切割打开后的茎环结构DNA3，释放茎环结构DNA3中具有HRP催化活性的G四聚体和DNA1，释放的DNA1又可以进入下一轮循环，不断打开茎环结构DNA3，从而形成大量的G四聚体，实现了信号的放大。
释放的G四聚体与氯高铁血红素相互作用，能够催化氧化TMB-H2O2（四甲基联苯胺-双氧水）检测体系，产生蓝色的底物，结果肉眼可见，从而达到检测17b-雌二醇的目的。
类似的，使用其他分子的核酸适体时，可以实现其他分子的检测。
下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
雌二醇检测试剂盒：
试剂盒包括如下成分：
（1）核酸序列如下：
DNA1：5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-GCAGAT-GGGTTGGGATTACGATAGATAATA-3'（SEQ ID NO：1）；（其中，黑色加粗部分为1*区，斜体部分为2*区）
DNA2：5'-ATCTGCGCTTCCGCGCTTATAATA-3'（SEQ ID NO：2）；
DNA3：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-ATTACGATAGTCCAATCACAACCTATCGTAATCCCAACCC-ATCTGC-3'（SEQ ID NO：3）；（其中，黑色加粗部分为G四聚体序列，斜体部分为1区，下划线部分为2区，2区和G四聚体之间的序列为连接序列）
（2）DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl；
（3）TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 μL 0.5%的TMB，20μL 30%的H2O2，pH=5.0；
（4）氯高铁血红素；
（5）核酸外切酶Ⅲ。
雌二醇的检测：
1)      先用Tris-HCl缓冲液（20 mM，pH为7.4，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl）分别溶解DNA1、DNA2以及茎环结构DNA3。100 nM的DNA1与400 nM的DNA2混合，室温反应20分钟，形成DNA1-DNA2混合物；其中DNA2过量就是为了保证封闭全部DNA1；
2)      将待测样品与DNA1-DNA2混合物混合，室温反应45分钟；
3)      再加入1 mM的茎环结构DNA3，室温反应1个小时，同时加入30 U的核酸外切酶Ⅲ，再反应45分钟；
4)      加入0.3 mM 的hemin（氯高铁血红素），室温反应30分钟
5)      取出50 mL反应液，加入到950 mL显色缓冲液中（含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 mL 0.5%的TMB，20 mL 30%的H2O2，pH=5.0），室温反应15分钟，即可观察颜色变化。
最低检测限的确定：
配制17b-雌二醇标准溶液，浓度分别为1 pM，10 pM，100 pM，1 nM和10 nM，室温保存。
将不同浓度的17b-雌二醇溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察实验结果，如图2所示，1 pM的17b-雌二醇可产生明显的蓝色变化，说明其检测限为1 pM。随着17b-雌二醇浓度的增加，颜色也增加，并逐渐趋于饱和。
特异性实验：
配制浓度为10 nM的不同干扰物标准溶液，分别是雌三醇、双酚A、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素。
将10 nM的不同干扰物标准溶液和10 pM 17b-雌二醇标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中，充分反应后观察颜色变化，如图3所示，10 nM的雌三醇、双酚A、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素没有产生颜色变化，对检测不产生影响。只有当加入17b-雌二醇后才会产生蓝色，这证明该方法对17b-雌二醇的检测具有很好的特异性。
<110>  广东省生态环境与土壤研究所
 
<120>  一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒
 
<130> 
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  106
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gcttccagct tattgaatta cacgcagagg gtagcggctc tgcgcattca attgctgcgc       60
 
gctgaagcgc ggaagcgcag atgggttggg attacgatag ataata                     106
 
 
<210>  2
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
atctgcgctt ccgcgcttat aata                                              24
 
 
<210>  3
<211>  63
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
gggtagggcg ggttgggatt acgatagtcc aatcacaacc tatcgtaatc ccaacccatc       60
 
tgc                                                                     63

Claims (9)

1.一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测试剂盒，包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液，其特征在于：所述试剂盒还包括核酸外切酶和如下核酸序列：
DNA1：待测分子核酸适体的一端适当延伸，形成DNA1，延伸的核酸中，靠近核酸适体一端的为1*区，其余部分记为2*区；
DNA2：DNA2与DNA1的1*区和核酸适体的部分核酸连续互补配对，DNA2的另一端至少有4个碱基不与DNA1互补配对；
DNA3：具有茎环结构，其一端为1区，中间依次为2区和连接序列，另一端为G四聚体序列，G四聚体至少有6个碱基的核酸序列位于茎环结构的茎上，DNA3的1区与DNA1的1*区完全互补配对，2区与2*区靠近1*区核酸至少部分连续互补配对。
2.根据权利要求1所述的分子检测试剂盒，其特征在于：1*区至少具有6个碱基，2*区至少具有24个碱基。
3.根据权利要求1所述的分子检测试剂盒，其特征在于：DNA2中至少有6个碱基与待测分子核酸适体连续互补配对。
4.根据权利要求1所述的分子检测试剂盒，其特征在于：待测分子为17b-雌二醇，核酸序列如下：
DNA1：5'-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCGCATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGC-GCAGAT-GGGTTGGGATTACGATAGATAATA-3'；
DNA2：5'-ATCTGCGCTTCCGCGCTTATAATA-3'；
DNA3：5'-GGGTAGGGCGGGTTGGG-ATTACGATAGTCCAATCACAACCTATCGTAATCCCAACCC-ATCTGC-3'；
DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl；
TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 μL 0.5%的TMB，20 μL 30%的H2O2，pH=5.0。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的分子检测试剂盒，其特征在于：所述核酸外切酶为核酸外切酶Ⅲ。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的分子检测试剂盒，其特征在于：对DNA1的1*、2*区，DNA2和DNA3核酸序列中至少一个核苷酸进行修饰，以在不改变碱基互补配对原则的情况下，提高核酸序列之间的亲和力。
7.一种基于核酸外切酶和G四聚体的分子检测方法，包括如下步骤：
1）将DNA1和过量DNA2于DNA杂交缓冲液中混合反应，形成DNA1-DNA2复合体；
2）将DNA1-DNA2复合体、待测样品混合反应完全；
3）加入DNA3、核酸外切酶，混合反应完全；
4）加入氯高铁血红素，反应完全后与TMB显色缓冲液混合反应，根据反应液的颜色变化确定检测结果，反应液变蓝说明待测样品中存在待测分子；
其中，DNA1～DNA3如权利要求1～6任意一项权利要求所述。
8.根据权利要求7所述的分子检测方法，其特征在于：DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液，含有200 mM NaCl以及50 mM KCl。
9.根据权利要求7或8所述的分子检测方法，其特征在于：TMB显色缓冲液，含有26.6 mM柠檬酸，51.4 mM磷酸氢二钠，25 mM KCl，10 μL 0.5%的TMB，20 μL 30%的H2O2，pH=5.0。
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