一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基于核酶的分子检测方法,特别涉及基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及基于该方法的检测试剂盒。
背景技术
环境中存在多种对人体有害的分子,快速、低成本地检测出这些有害小分子具有非常实际的意义。
双酚A(Bisphenol A,BPA),化学名为2,2-二(4-羟基苯基)丙烷,主要用于合成环氧树脂,聚碳酸酯等多种高分子材料,被广泛用于生产各种塑料制品。双酚A主要通过食品包装材料、饮水杯、供水管、奶瓶以及塑料薄膜等渗入食品而进入体内,并能在生物体内富集,并且不易被降解。即使极低的浓度的双酚A也会对内分泌系统、免疫系统、生殖系统产生一系列的不良影响。传统的双酚A检测技术主要有高效液相色谱法等一些仪器分析方法,这些技术需要繁琐的样品前处理和昂贵的仪器,检测成本高、费时耗力,难以用于大批量样本的实地现场快速检测。
另外,也有以抗体来检测双酚A的技术,但是抗体的制备过程麻烦,保存条件苛刻,而且需要多次洗涤与分离过程,因而限制了它们的广泛应用。
G四聚体序列是由富含G碱基的一段单链DNA组成,在缓冲体系和hemin(氯高铁血红素)存在的情况下,可折叠成G四聚体二级结构。G四聚体具有类似HRP(辣根过氧化物酶)的催化活性,可催化氧化TMB(四甲基联苯胺)产生蓝色底物,使反应溶液肉眼可见。以G四聚体来检测双酚A具有操作简单,方便现场快速分析等优点。但是基于G四聚体的比色法检测灵敏度低,需要进一步提高灵敏度。传统的信号放大技术主要是PCR以及一系列依赖工具酶的信号扩增技术,但是酶的使用不仅增加了成本和操作步骤,而且酶的存储也比较麻烦,因此需要研发一种无需工具酶信号扩增技术来提高检测灵敏度。
核酸适体(aptamer,源于拉丁语)指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子,与特异靶分子相结合,特异性如同抗体一样,对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA自组装和G四聚体的分子检测方法及检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是:
一种基于DNA自组装和G四聚体的检测试剂盒,包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液,还包括如下核酸序列:
DNA1:将待测分子核酸适体的一端适当延伸,形成DNA1,延伸的核酸序列中,靠近待测分子核酸适体的核酸序列依次记为1*、2*和3*区;
DNA2:DNA2至少与DNA1的1*区域和待测分子核酸适体的部分核酸互补配对;
DNA3:具有茎环结构,其核酸序列依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区,2、3和2*、3*互补配对形成茎结构,环为4*区,1、2、3分别和DNA1的1*、2*和3*区互补配对;
DNA4:具有茎环结构,其核酸序列依次为3、4、3*、2*和4*区,4和4*区形成茎结构,环为3*和2*区,3、4、3*、2*区分别和DNA3的3*、4*、3、2区互补配对;
DNA5:依次为5*、6*和G四聚体封闭区,5*、6*区与DNA3的5*和6*区相同;
DNA6:依次为G四聚体、6、5、和2区,6、5、和2区分别和DNA3的6*、5*和2*互补配对。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,DNA2至少与待测分子核酸适体的8个碱基互补配对。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,1~6、1*~6*区中,每个区至少含有6个碱基。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,DNA5的G四聚体封闭区至少与DNA6的G四聚体中的6个碱基互补配对。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,对1~6、1*~6*区核酸序列中的至少一个核苷酸进行修饰,以在不改变碱基配对原则的情况下提高核酸序列之间的亲和力。
一种双酚A的检测试剂盒,包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液,还包括如下核酸序列:
DNA1:5'-CGACATCT(3*)AACCTAGC(2*)TCACTGAC(1*)CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'(SEQ ID NO:1);
DNA2:5'-TAAGCTGGAAGCGTCAGTGA-3'(SEQ ID NO:2);
DNA3:5'-GTCAGTGA(1)GCTAGGTT(2)AGATGTCG(3)CCATGTGTAGA(4*)CGACATCT(3*)AACCTAGC(2*)CCTTGTCA(5*)TAGAGCAC(6*)-3'(SEQ ID NO:3);
DNA4:5'-AGATGTCG(3)TCTACACATGG(4)CGACATCT(3*)AACCTAGC(2*)CCATGTGTAGA(4*)-3'(SEQ ID NO:4);
DNA5:5'-CCTTGTCA(5*)TAGAGCAC(6*)TCCCTC(G四聚体封闭区)-3'(SEQ ID NO:5);
DNA6:5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA(G四聚体序列)GTGCTCTA(6)TGACAAGG(5)GCTAGGTT(2)-3'(SEQ ID NO:6)。
一种分子的检测方法,包括如下步骤:
1)将过量DNA5和DNA6于DNA杂交缓冲液中混合反应,形成DNA5-DNA6复合物;
2)将DNA1和过量DNA2于DNA杂交缓冲液中混合反应,形成DNA1-DNA2复合体;
3)将DNA1-DNA2复合体内加入待测样品、DNA3和DNA4,混合反应完全,得到DNA3-DNA4复合物;
4)将DNA3-DNA4复合物、DNA5-DNA6复合物、氯高铁血红素、TMB显色缓冲液混合,如反应体系产生蓝色底物,说明待测样品含有待测分子;
其中,DNA1~DNA 6的序列组成如上所示。
作为上述分子检测方法的进一步改进,DNA杂交缓冲液为Tris-HCl缓冲液,含有200 mM NaCl以及50 mM KCl。
作为上述分子检测方法的进一步改进,TMB显色缓冲液,含有26.6 mM柠檬酸,51.4mM磷酸氢二钠,25 mMKCl,10 mL 0.5%的TMB,20 mL 30%的H2O2,pH=5.0。
本发明的有益效果是:
1)本发明的检测方法及检测试剂盒具有较高的灵敏度,对双酚A的检测限为1 pg/mL,检测结果肉眼可见,适于现场快速分析。
2)本发明所述的分子检测方法应用核酸适体实现待测分子的捕捉,具有很好的特异性,其他常见的干扰物对检测不产生影响。
3)以G四聚体作为信号报告分子,结合DNA自组装介导的信号放大技术,可产生大量的具有催化活性的G四聚体,整个操作简单,经济便宜,不需要使用任何检测仪器,不需要专业技术人员,无须培训即可推广使用。
附图说明
图1 是DNA1-DNA2复合体在双酚A作用下脱离的原理示意图;
图2是DNA3-DNA4复合体形成的原理示意图;
图3是显色反应阶段的原理示意图;
图4是不同浓度的双酚A检测的结果图;
图5是特异性实验结果图。
具体实施方式
一种基于DNA自组装和G四聚体的检测试剂盒,包括TMB显色缓冲液、氯高铁血红素、DNA杂交缓冲液,还包括如下核酸序列:
DNA1:将待测分子核酸适体的一端适当延伸,形成DNA1,延伸的核酸序列中,靠近待测分子核酸适体的核酸序列依次记为1*、2*和3*区;
DNA2:DNA2至少与DNA1的1*区域和待测分子核酸适体的部分核酸互补配对;
DNA3:具有茎环结构,其核酸序列依次为1、2、3、4*、3*、2*、5*和6*区,2、3和2*、3*互补配对形成茎结构,环为4*区,1、2、3分别和DNA1的1*、2*和3*区互补配对;
DNA4:具有茎环结构,其核酸序列依次为3、4、3*、2*和4*区,4和4*区形成茎结构,环为3*和2*区,3、4、3*、2*区分别和DNA3的3*、4*、3、2区互补配对;
DNA5:依次为5*、6*和G四聚体封闭区,5*、6*区与DNA3的5*和6*区相同;
DNA6:依次为G四聚体、6、5、和2区,6、5、和2区分别和DNA3的6*、5*和2*互补配对。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,DNA2至少与待测分子核酸适体的8个碱基互补配对,以确保DNA1-DNA2复合物的稳定性。同时DNA2与待测分子核酸适体的碱基互补配对数也不宜过多,一般不超过20个碱基互补配对,以免影响待测分子与DNA1中的核酸适体竞争性结合从而把DNA2置换下来。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,1~6、1*~6*区中,每个区至少含有6个碱基,以确保对应区域结合的稳定性。优选的,为6~20个,更佳为6~15个、6~10个。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,DNA5的G四聚体封闭区至少与DNA6的G四聚体中的6个碱基互补配对,封闭后的G四聚体没有催化活性。
作为上述检测试剂盒的进一步改进,对1~6、1*~6*区核酸序列中的至少一个核苷酸进行修饰,以在不改变碱基配对原则的情况下提高核酸序列之间的亲和力。如通过锁核酸修饰以提高碱基之间的亲和力,使用较短的序列实现本发明的技术方案。
下面结合附图,以双酚A的检测为例,进一步说明本发明的检测原理:
DNA1-DNA2复合体的形成:双酚A的核酸适体的一端适当延伸,形成DNA1,靠近核酸适体一端包含3个区域,分别是1*,2*,3*。DNA2与部分DNA1互补。将DNA1和DNA2在缓冲体系中反应一段时间,形成DNA1-DNA2复合物。在DNA1-DNA2复合物中,DNA1中的1*区域被DNA2封闭。当DNA1-DNA2反应体系中存在双酚A时,双酚A将与核酸适体相互作用,从而把DNA2置换下来,使DNA1中的1*区域暴露出来(原理如图1所示)。如无双酚A存在,DNA1-DNA2复合物稳定存在,DNA1中的1*区域无法暴露。
DNA3-DNA4复合体的形成与放大:DNA1中暴露的1*区域可作为DNA支点,将会与DNA3中的1区域互补结合,启动DNA自组装链置换反应,介导DNA1中的2*、3*区域与DNA3中的2、3区域结合,形成更长的双链DNA(1-1*、2-2*、3-3*),从而打开颈环结构的DNA3,使DNA3中的3*区域暴露(原理图2反应a所示)。DNA4中的3区域从而能与暴露的DNA3中的3*区域结合,启动DNA自组装链置换反应,介导DNA4的4、3*、2*区域与DNA3的4*、3、2区域结合,形成更长的双链DNA(3*-3、4*-4、3-3*、2-2*),从而把颈环结构的DNA4也打开(原理图2反应b所示)。形成的复合物DNA1-DNA2-DNA3本身不稳定,DNA1链会自动脱离,从而循环进入下一轮的DNA自组装信号扩增(原理图2反应c所示),从而不断形成DNA3-DNA4复合物。在DNA3-DNA4复合物中2*区域是暴露的。如无双酚A存在,则DNA1中的1*区域不会启动DNA3的自组装链置换反应,无法形成DNA3-DNA4复合体,反应终止。
显色反应:将DNA5和DNA6在缓冲液中反应一段时间,出现DNA5-DNA6复合物。其中DNA6的5'端是一段G四聚体序列,部分G四聚体序列被DNA5的G四聚体封闭区封闭,此时的G四聚体没有催化活性(如原理图3所示)。将DNA3-DNA4加入到DNA5-DNA6复合物中,DNA3中暴露的2*区域将会与DNA6中的2区域杂交,启动链置换反应,从而把DNA5置换下来,形成DNA3-DNA4-DNA6复合物,在该复合物中,封闭的G四聚体序列被暴露出来,形成具有活性的G四聚体序列。G四聚体序列再与hemin(氯高铁血红素)相互作用,能够催化氧化TMB-H2O2(四甲基联苯胺-双氧水)检测体系,产生蓝色的底物,结果肉眼可见,从而达到检测双酚A的目的。
下面结合实施例,进一步说明本发明的技术方案。
双酚A检测试剂盒:
试剂盒包括如下成分:
(1)检测用DNA序列:DNA1~DNA6的序列分别如下:
DNA1:5'-CGACATCT(3*)AACCTAGC(2*)TCACTGAC(1*)CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'(SEQ ID NO:1);
DNA2:5'-TAAGCTGGAAGCGTCAGTGA-3' (SEQ ID NO:2);
DNA3:5'-GTCAGTGA(1)GCTAGGTT(2)AGATGTCG(3)CCATGTGTAGA(4*)CGACATCT(3*)AACCTAGC(2*)CCTTGTCA(5*)TAGAGCAC(6*)-3'(SEQ ID NO:3);
DNA4:5'-AGATGTCG(3)TCTACACATGG(4)CGACATCT(3*)AACCTAGC(2*)CCATGTGTAGA(4*)-3'(SEQ ID NO:4);
DNA5:5'-CCTTGTCA(5*)TAGAGCAC(6*)TCCCTC(G四聚体封闭区)-3'(SEQ ID NO:5);
DNA6:5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA(G四聚体序列)GTGCTCTA(6)TGACAAGG(5)GCTAGGTT(2)-3'(SEQ ID NO:6);
(2)DNA杂交缓冲液:Tris-HCl缓冲液,含有200 mM NaCl以及50 mM KCl;
(3)氯高铁血红素;
(4)TMB显色缓冲液:含有26.6 mM柠檬酸,51.4 mM磷酸氢二钠,25 mM KCl,10 mL0.5%的TMB,20 mL 30%的H2O2,pH=5.0。
实施例1:
所使用的试剂如上述双酚A检测试剂盒所述,具体检测方法如下:
1)先用Tris-HCl缓冲液(20 mM,pH为7.4,含有200 mM NaCl以及50 mM KCl)分别溶解DNA1、DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6;
2)100 nM的DNA1与400 nM的DNA2混合,室温反应20分钟,形成DNA1-DNA2混合物;其中DNA2过量就是为了保证封闭全部DNA1;
3)把不同浓度的双酚A加入到DNA1-DNA2混合物中,室温反应45分钟;
4)再加入1 mM的DNA3和DNA4,室温反应1个小时;
5)将1.2 mM的DNA5与1 mM的DNA6混合,室温反应30分钟,形成DNA5-DNA6混合物;其中DNA5过量就是为了保证封闭全部DNA6。然后再加入到步骤(3)中的反应液中,室温反应30分钟;
6)加入0.3 mM 的hemin(氯高铁血红素),室温反应30分钟;
7)取出50 mL反应液,加入到950 mL显色缓冲液中(含有26.6 mM柠檬酸,51.4 mM磷酸氢二钠,25 mM KCl,10 mL 0.5%的TMB,20 mL 30%的H2O2,pH=5.0),室温反应15分钟,即可观察颜色变化。
最低检测限的确定:
配制双酚A标准溶液,浓度分别为1 pg/mL,10 pg/mL,100 pg/mL,1 ng/mL和10ng/mL,室温保存。
将不同浓度的双酚A溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中,充分反应后观察实验结果,如图4所示,1 pg/mL的双酚A可产生明显的蓝色变化,说明其检测限为1 pg/mL。随着双酚A浓度的增加,颜色也增加,并逐渐趋于饱和。
特异性实验:
配制浓度为10 ng/mL的不同干扰物标准溶液,分别是雌三醇、17b-雌二醇、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素。
将10 ng/mL的不同干扰物标准溶液和100 pg/mL双酚A标准溶液分别加到实施例1中所述的反应体系中,充分反应后观察颜色变化,如图5所示,10 ng/mL的雌三醇、17b-雌二醇、孕酮、西维因、洁霉素、丝裂霉素没有产生颜色变化,对检测不产生影响。只有当加入双酚A后才会产生蓝色,这证明该方法对双酚A的检测具有很好的特异性。
<110> 广东省生态环境与土壤研究所
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