CN110106176A - 一种比色法测定银离子和汞离子的g-四链体-氯化血红素dna酶及其测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶，其特征在于：所述的DNA酶由G‑四链体DNA与氯化血红素结合而成，其中G‑四链体DNA序列为：5'‑CTG GGA GGG AGG GAG GGA‑3'。利用含腺嘌呤碱基T的G‑四链体作为银离子和汞离子的识别序列，没有金属离子存在时，其与氯化血红素(Hemin)结合形成G‑四链体‑Hemin DNA酶，能高效催化H2O2氧化反应底物ABTS导致溶液变绿色；当有Ag+或Hg2+存在时，金属离子会阻碍该DNA酶的形成，溶液颜色变浅，分别通过EDTA掩蔽汞离子和富C的DNA掩蔽银离子，构筑了比色法测定Ag+和Hg2+的传感器。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定银离子和汞离子的G-四链体-氯化血红素DNA酶及其测定方法，属于重金属检测领域。
背景技术
银离子在制药、化工、制镜、电子工业中有较多的应用，其对人体的潜在危害，如导致人体巯基酶失活，引起肝肾损害，结合代谢分子中氨基、羰基等，逐渐受到人们的重视。汞离子是公认的高毒性重金属离子，其通过火电厂煤燃烧、金矿开采、化石燃料燃烧、固体废弃物焚烧等途径进入发明人生存的环境中，汞离子能在人体细胞中累积，对人体心脏、肾脏、免疫系统、中枢神经系统等产生损害。因此，建立简单、灵敏、高选择性测定银离子和汞离子的方法具有重要意义。
G-四链体-氯化血红素DNA酶是一种由富含鸟嘌呤碱基G的DNA序列与氯化血红素(Hemin)结合而形成的具有类似过氧化物酶活性的人工模拟酶，该DNA酶能高效催化H2O2氧化反应底物(如2,2`-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐,ABTS)产生明显的颜色变化，利用金属离子能促进或阻碍G-四链体-Hemin DNA酶的形成产生溶液颜色信号改变，有很多比色法测定金属离子的传感器报道。在测定银离子传感器方面，Li和Kong等报道利用Ag+通过C-Ag+-C配位键促进G-四链体-Hemin DNA酶的形成建立了比色法测定银离子传感器，Zhou等利用Ag+与鸟嘌呤碱基G结合阻碍G-四链体-Hemin DNA酶的形成构筑了比色法测定银离子传感器；汞离子传感器方面，Lu和Kong等报道利用Hg2+形成T-Hg2+-T配位键抑制或促进该DNA酶的形成建立比色法定量检测汞离子的传感器。这些传感器虽然具有较好的灵敏度和选择性，但仅限于测定银离子或测定汞离子，未见能同时对银离子和汞离子产生响应的G-四链体-Hemin DNA酶传感器报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种G-四链体-氯化血红素DNA酶，该DNA酶既能检测银离子，也能汞离子，解决了现有技术中的一种DNA酶只能单独银离子或汞离子的问题。
本发明的技术方案是：一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶，所述的DNA酶由G-四链体DNA与氯化血红素结合而成，其中G-四链体DNA序列为：5'-CTG GGA GGG AGG GAGGGA-3'。
Ag+和Hg2+检出限分别为55.9nmol/L和64.3nmol/L。
溶液的吸光度与Ag+和Hg2+的浓度分别在100.0-1000.0nmol/L和80.0-800.0nmol/L范围内具有良好的线性关系。
最佳检测条件为：NaNO3浓度为100-300mmol/L，金属离子与G-四链体DNA保留时间30-40min，缓冲溶液pH值为7.5。
一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶的使用方法，室温下，在含KNO3、EAD2、NaNO3的PBS的缓冲溶液中，加入不同浓度的Ag+或Hg2+保留30-40分钟，然后加入Hemin保留20-30分钟，取前述混合溶液与显色工作缓冲液按体积比1:90混合，再加入过氧化氢溶液摇匀，显色20-30分钟，于紫外可见分光光度计上测显色溶液在390-450nm波长范围内的紫外可见吸收光谱，或测溶液在422nm波长处的吸光度A。
一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶的使用方法，在含KAc、NaAc的PBS缓冲溶液中，品加入EAD2及Ag+或Hg2+保留30-40分钟，然后使用光径为1.0mm的石英样品池在圆二色谱仪上进行测定，测定参数：扫描速率100nm/min，带宽1.0nm，响应时间0.5s，步长1nm，扫描次数3次。
本发明的有益效果：利用含腺嘌呤碱基T的G-四链体(5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA-3')作为银离子和汞离子的识别序列，没有金属离子存在时，其与氯化血红素(Hemin)结合形成G-四链体-Hemin DNA酶，能高效催化H2O2氧化反应底物(2,2`-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐,ABTS)导致溶液变绿色；当有Ag+或Hg2+存在时，金属离子会阻碍该DNA酶的形成，溶液颜色变浅，分别通过EDTA掩蔽汞离子和富C的DNA掩蔽银离子，构筑了比色法测定Ag+和Hg2+的传感器。在最佳实验条件下，溶液的吸光度与Ag+和Hg2+的浓度分别在100.0～1000.0nmol/L和80.0～800.0nmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限分别为55.9nmol/L和64.3nmol/L。该方法具有较好的选择性，采用该方法对实际样品进行测试，结果令人满意。
附图说明
图1为存在1000.0nmol/L银离子(b)、1000.0nmol/L汞离子(c)及不含银离子与汞离子(a)的G-四链体DNA酶显色溶液的紫外可见吸收光谱和颜色；
图2为加与不加银离子(a)和加与不加汞离子(b)的G-四链体DNA溶液圆二色谱；
图3为溶液的pH值对△A的影响；
图4为保留时间对△A的影响；
图5为NaNO3浓度对△A的影响；
图6为存在不同浓度Ag+显色溶液的紫外可见吸收光谱、溶液颜色和线性图；(a)1750.0nmol/L,(b)1000.0nmol/L,(c)750.0nmol/L,(d)500.0nmol/L,(e)400.0nmol/L,(f)300.0nmol/L,(g)200.0nmol/L,(h)100.0nmol/L,(i)0.0nmol/L；
图7为存在不同浓度Hg2+显色溶液的紫外可见吸收光谱、溶液颜色和线性图；(a)1750.0nmol/L,(b)1000.0nmol/L,(c)800.0nmol/L,(d)600.0nmol/L,(e)400.0nmol/L,(f)200.0nmol/L,(g)80.0nmol/L,(h)0.0nmol/L；
图8为方法的选择性示意图。
具体实施方式
G-四链体DNA序列的筛选
对银离子敏感的G-四链体DNA传感器序列的筛选：选择催化效果最佳的三条G-四链体DNA序列①EAD[C(TG3)4A]、②EAD2[CTG3(AG3)3A]、③c-Myc[TGAG3TG4AG3TG4A2]进行对比，通过比较加与不加银离子溶液的颜色变化及吸光度变化，筛选出对银离子敏感，同时含多个腺嘌呤碱基T(识别汞离子)的G-四链体DNA序列(EAD2,5'-CTG GGA GGGAGG GAG GGA-3')作为识别银离子和汞离子的传感器序列。
为了检验该方法的可行性，对加与不加金属离子溶液的颜色变化和紫外可见吸收光谱进行比较。图1a为未加金属离子，显色溶液的紫外可见吸收光谱曲线，在422nm处均有一个很强的吸收峰，对应溶液为绿色；而图1b和1c分别为加入1000.0nmol/L银离子和1000.0nmol/L汞离子后显色溶液的紫外可见吸收光谱曲线，422nm处吸收峰的强度均明显降低，溶液基本变为无色，说明该方法用于比色法测定银离子和汞离子可行。
为了进一步考察G-四链体DNA测定金属离子的作用机理，发明人对有和没有金属离子的EAD2溶液的圆二色谱进行了研究。如图2所示，没有金属离子的G-四链体溶液在263nm处有一个明显的正圆二色峰，这是形成平行G-四链体结构的典型特征。当溶液中加入银离子(图2a)或汞离子(图2b)后，260nm左右的正圆二色峰明显减弱，当溶液中加入银离子(图2a)，260nm左右的正圆二色峰明显减弱，表明银离子可能与鸟嘌呤碱基G螯合而阻碍G-四链体结构的形成；加入汞离子(图2b)后，该圆二色峰同样明显减弱，表明汞离子可能通过非T-Hg2+-T配位作用破坏G-四链体结构的形成。存在Hemin溶液的圆二色谱变化类似，说明Hemin对银离子或汞离子与G-四链体作用影响不大。
反应条件的优化
G-四链体-Hemin DNA酶显色溶液的吸光度受多种因素的影响，为了获得加入相同量金属离子产生最大信号变化值，对影响显色溶液吸光度的实验条件进行优化，以便加入金属离子能产生最大吸光度改变值ΔA，ΔA＝A(无Ag+)-A(有Ag+)。
溶液pH值对ΔA的影响
溶液pH值的大小会影响G-四链体结构的形成及显色溶液的吸光度大小，对溶液的pH进行了优化。如图3所示，虽然pH为7.0时吸光度变化值ΔA更大，但从插图可以看到，有银离子溶液的吸光度在0.5左右，实际溶液仍略显绿色；而当pH为7.5时，存在同样量的银离子，溶液的吸光度约为0.2，实际溶液接近无色。因此，选择pH值为7.5的缓冲溶液作为最佳实验条件。
保留时间对ΔA的影响
加金属离子与G-四链体DNA作用时间的长短会影响DNA酶的形成，从而影响显色溶液吸光度大小，对加银离子后混合保留时间进行了优化，如图4所示，加Ag+后保留时间在30min△A不再增加。因此，选择30min作为金属离子与G-四链体DNA保留时间。
硝酸钠浓度对ΔA的影响
硝酸钠浓度会影响EAD2折叠为G-四链体结构及DNA酶的形成，对显色溶液的吸光度产生影响，对NaNO3浓度进行了优化，如图5所示，随着NaNO3浓度的增加，加入相同量Ag+引起的吸光度变化值ΔA增加，当浓度达到200.0mmol/L时产生最大信号变化值。因此，选择200.0mmol/L NaNO3浓度作为最佳实验条件。
线性范围
在最佳实验条件下，记录了存在不同浓度银离子和汞离子显色溶液的颜色和紫外可见吸收光谱。如图6为存在不同浓度银离子溶液的颜色和紫外可见吸收光谱曲线，随着银离子浓度增加而溶液颜色变浅，溶液在422nm处吸光度与银离子浓度在100.0～1000.0nmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为：A＝–0.0006272C+0.7553，相关系数(r)为0.9918，检出限为55.9nmol/L(3δ/Slope)。
如图7为存在不同浓度汞离子溶液的颜色和紫外可见吸收光谱曲线，随着汞离子浓度增加而溶液颜色变浅，溶液在422nm处吸光度与汞离子浓度在80.0～800.0nmol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为：A＝–0.0005459C+0.7131，相关系数(r)为0.9926，检出限为64.3nmol/L(3δ/Slope)。
方法的选择性
为了考察该方法的选择性，对1000.0nmol/L银离子、汞离子及10种常见其他金属离子(Ba2+、Pb2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Fe3+、Al3+、Zn2+、Cu2+、Ni2+)与G-四链体DNA作用显色后的溶液在422nm的吸光度值进行了对比。如图8所示，只有银离子和汞离子存在会导致溶液的吸光度值明显下降，存在常见金属离子溶液的吸光度值与空白溶液差不多，其中汞离子对银离子测定的干扰可以通过加入EDTA消除，而银离子对汞离子的测定干扰可以通过加入富含胞嘧啶碱基C的EAD2,5'-CTG GGA GGGAGG GAG GGA-3'消除。说明该方法具有较好的选择性，既可以用银离子的测定也可以用于汞离子的测定。
紫外可见吸收光谱及吸光度的测定
室温25℃下，在总体积为50.0μL含20.0mmol/L KNO3、100.0nmol/L EAD、200.0mmol/L NaNO3的20mmol/L PBS(pH 7.5)的缓冲溶液中，加入不同浓度的Ag+保留30分钟，然后加入100.0nmol/LHemin保留25分钟。取前述混合溶液5.0μL于500μL离心管，加入490.0μL显色工作缓冲液，再加入5.0μL 30mmol/L过氧化氢溶液摇匀，显色25分钟。于PE-lambda 35紫外可见分光光度计上测显色溶液在390～450nm波长范围内的紫外可见吸收光谱，或测溶液在422nm波长处的吸光度A。
圆二色谱的测定
在总体积为1000μL含20mmol/L KAc、200mmol/L NaAc的20mmol/L PBS(pH 7.5)缓冲溶液中，第一组样品加入3μmol/L EAD保留30分钟，第二组样品加入3μmol/L EAD及52umol/L Ag+或Hg2+保留30分钟，第三组样品在第一组和第二组样品基础上分别加入6μΜHemin保留25分钟。所有样品溶液使用光径为1.0mm的石英样品池在Chirascan圆二色谱仪上进行测定。测定参数：扫描速率100nm/min，带宽1.0nm，响应时间0.5s，步长1nm，扫描次数3次。
水样中银离子和汞离子的测定
在最佳实验条件下，采用该方法对贵阳市蔡家关雅河河水中的银离子和汞离子含量进行测定，均未检出，采用加标回收法进行试验，测定结果见表1，样本的加标回收率分别为94.8％～99.7％，相对标准偏差为2.89％～4.99％，说明该方法用于银离子和汞离子测定有较好的精密度和重现性，能够应用于实际样品的测定。
表1水样中银离子和汞离子的测定
| Sample | Added(nmol/L) | Found(nmol/L) | RSD(％,n＝6) | Recovery(％,n＝6) |
| Yahe river(for Ag<sup>+</sup>) | 0.0，200.0，750.0 | —，187.1，747.5 | —，4.70，4.99 | —，94.8，99.7 |
| Yahe river(for Hg<sup>2+</sup>) | 0.0，200.0，750.0 | —，190.6，715.5 | —，2.89，4.51 | —，95.3，95.4 |
序列表
<110> 贵州大学
<120>一种比色法测定银离子和汞离子的G-四链体-氯化血红素DNA酶及其测定方法
<160> 1
<210> 1
<211>18
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 1
CTG GGA GGG AGG GAG GGA
Claims (6)
1.一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶，其特征在于：所述的DNA酶由G-四链体DNA与氯化血红素结合而成，其中G-四链体DNA序列为：5'-CTG GGA GGG AGG GAG GGA-3'。
2.根据权利要求1所述的一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶，其特征在于：Ag+和Hg2+检出限分别为55.9nmol/L和64.3nmol/L。
3.根据权利要求1所述的一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶，其特征在于：溶液的吸光度与Ag+和Hg2+的浓度分别在100.0-1000.0nmol/L和80.0-800.0nmol/L范围内具有良好的线性关系。
4.根据权利要求1所述的一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶，其特征在于：最佳实验条件为：NaNO3浓度为100-300mmol/L，金属离子与G-四链体DNA保留时间30-40min，缓冲溶液pH值为7.5。
5.权利要求1-4之一所述的一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶的使用方法，其特征在于：室温下，在含KNO3、EAD2、NaNO3的PBS的缓冲溶液中，加入不同浓度的Ag+或Hg2+保留30-40分钟，然后加入Hemin保留20-30分钟，取前述混合溶液与显色工作缓冲液按体积比1:90混合，再加入过氧化氢溶液摇匀，显色20-30分钟，于紫外可见分光光度计上测显色溶液在390-450nm波长范围内的紫外可见吸收光谱，或测溶液在422nm波长处的吸光度A。
6.权利要求1-4之一所述的一种比色法测定银离子和汞离子的DNA酶的使用方法，其特征在于：在含KAc、NaAc的PBS缓冲溶液中，品加入EAD2及Ag+或Hg2+保留30-40分钟，然后使用光径为1.0mm的石英样品池在圆二色谱仪上进行测定，测定参数：扫描速率100nm/min，带宽1.0nm，响应时间0.5s，步长1nm，扫描次数3次。
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