CN104789209A - 一种基于罗丹明B的水溶性Cu2+、Hg2+探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于罗丹明B的水溶性Cu²⁺、Hg²⁺探针及其制备方法和应用，属于金属离子分析检测技术领域。结构式为：解决了现有技术中检测铜离子或汞离子的荧光分子探针存在检测离子单一、多数荧光分子探针的灵敏度低、选择性差对pH值敏感和不可逆等问题。该探针分子在检测铜离子和汞离子方面，表现出抗干扰能力强的特点，选择性好，灵敏度高，可以很好的应用于环境污染和生物细胞成像中铜离子和汞离子的检测，并能可逆操作。

Description

一种基于罗丹明B的水溶性Cu2+、Hg2+探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于金属离子分析检测技术领域，具体涉及一种基于罗丹明B的水溶性Cu²⁺、Hg²⁺探针的制备及其在生物细胞成像和环境水样检测方面的应用。

背景技术

众所周知，铜是一种过渡金属离子，过量的铜对人体、动植物都有害，但也是生命所必需的微量元素，在线粒体的呼吸、铁的吸收、酶的氧化还原等不同的生理过程中起着十分重要的作用。但若体内的铜离子代谢平衡遭到破坏，有可能引起氧化应激和神经退行性疾病，如Alzheimer病，Wilson病，Menke综合症。此外，由于铜离子大量地开采和广泛地使用，使得铜也成为一个重要的金属污染物。汞是一种具有严重生理毒性的化学物质，由于其具有持久性、易迁移性和高度生物富集性，使其成为目前全球引人关注的环境污染物之一。环境中汞可通过食物链在生物组织里高度富集，从而对人和自然界造成巨大的危害。鉴于其对生命和环境的重要性，过去几年中科学家们一直致力于采用选择性比色和荧光传感探针实现对铜离子、汞离子在生物和环境系统中检测的研究。

近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点，已经成为检测金属离子污染的重要手段。荧光增强传感材料可减少检测错误，对复杂体系检测准确，可同时用多种检测物对不同分析物进行检测。罗丹明类染料由于具有摩尔吸光率大、水溶性好、荧光量子产率高和发射波长较长等特点，在铜离子和汞离子识别的领域得到越来越广泛的重视。

发明内容

针对现有技术中检测铜离子或汞离子的荧光分子探针存在检测离子单一、多数荧光分子探针的灵敏度低、选择性差和对pH值敏感等问题，本发明主要目的在于提供一种可同时检测铜离子和汞离子且灵敏度高、选择性好和对pH值不敏感的金属离子荧光分子探针；另一目的是提供该荧光分子探针的制备方法和应用。

为实现本发明的目的，本发明所述的基于罗丹明B的比色法检测铜离子和荧光法检测汞离子的探针为罗丹明B异羟肟酸衍生物，其化学式为：C₄₅H₅₉N₅O₃S₂，结构式为：

本发明将其称为探针L，其制备路线如下：

该探针L的制备方法通过如下步骤实现：

将原料1溶于乙腈中，加入碳酸钾和碘化钾，回流状态下加入NH(CH₂CH₂SCH₂CH₂CH₃)₂，继续回流反应；反应结束后，将溶液冷却至室温，滤除沉淀，将滤液减压浓缩；用二氯甲烷/甲醇为展开剂通过柱硅胶，真空干燥得探针L。

原料1和NH(CH₂CH₂SCH₂CH₂CH₃)₂摩尔比优选1:1。

原料1根据文献Chem.Asian J.2011,6,1987–1991方法合成。

本发明分子探针可用于检测铜离子和汞离子，具体应用方法如下：

铜离子的检测：采用比色法和分光光谱法，将其应用于环境中铜离子的分析检测。在乙醇：水＝4:1(pH＝7.4缓冲溶液中,V/V)溶液中，加入用乙腈/水配制成的探针L母液，稀释，混合均匀后，加入待测样品中，目测或利用分光光度法测定450nm-650nm范围内的吸光值，定性检测水相中的铜离子。探针分子L对Cu²⁺有高效的识别性能，加入铜离子能引发明显的颜色变化：溶液的颜色从无色变成紫红色；同时探针分子L有很强的抗干扰能力和较低的检测限。具体应用如下：将探针分子L配制成0.4mM的溶液，然后稀释成10μM。在乙醇和水溶液中，加入10当量的铜离子之后，在500-600nm出现了一个强的吸收峰，接着向体系中加入过量的硫化钠，体系在500-600nm的吸收峰基本消失，溶液的颜色由加入铜离子之后明显的紫红色变为无色，使该探针分子得以循环利用。

汞离子的检测：采用荧光光谱法，将其应用于环境中汞离子的分析检测。在纯水溶液中，加入用乙腈/水配制成的探针L母液，稀释，混合均匀后，加入待测样品中，利用荧光光谱法定性检测水中的汞离子。探针分子L对Hg²⁺有高效的识别性能，探针分子L几乎没有荧光，加入汞离子后引起了明显的荧光增强。具体应用如下：将探针分子L配制成0.4mM的溶液，然后稀释成10μM。在纯水溶液中，加入10当量的汞离子之后，在586nm出现了一个强的发射峰，接着向体系中加入过量的硫化钠，体系在586nm的发射峰迅速减弱，基本到达了配体的水平，实现了该探针分子的可逆操作。

本发明探针对细胞内汞离子染色：探针分子透过细胞膜，与细胞内的汞离子络合发出荧光，用荧光显微镜能清晰地观察到发射橘红色荧光的细胞成像。即该荧光探针可用于活体细胞的荧光成像技术。

本发明创新点及优点：(1)该探针分子在乙醇和水的混合溶液中为无色，加入Cu²⁺之后，迅速变为紫红色，通过由无色变为紫红色的显色模式(500-600nm吸光度增强)定性、定量测定水样中的铜离子。利用紫外—可见分光光度计，可以检测水样中不低于1.63μM的铜离子，检测限非常低。(2)该探针分子在纯水溶液中能专一性地识别汞离子且不受其他金属离子的干扰。(3)该探针对铜离子和汞离子的检测均能实现可逆操作。(4)本发明探针对pH不敏感，可以在很宽的pH范围内(pH 4.0～9.0)对铜离子和汞离子实施检测。(5)该探针可以应用于环境水、活体生物系统中汞离子的检测，具有良好的开发前景。

附图说明

图1为本发明探针L(10μM)在乙醇：水＝4:1(pH＝7.4HEPES,V/V)溶液中加入不同金属阳离子(100μM)后的紫外光谱。图中，1为铜离子紫外光谱曲线，2为其它金属离子紫外光谱曲线，3为镉离子紫外光谱曲线。

图2为本发明探针L(10μM)在纯水溶液中加入不同金属阳离子(100μM)后的荧光光谱。图中，1为汞离子荧光光谱曲线，2为其它金属离子荧光光谱曲线。

图3为不同pH的乙醇-缓冲水溶液对本发明探针L(10μM)及其铜络合物的影响。

图4为不同pH的去离子水溶液对本发明探针L(10μM)及其汞络合物的影响。

图5为本发明探针分子在含汞离子的PC3细胞中的荧光显微成像图。

图6为考察本发明探针分子对水样中含汞的检测能力。

图7为本发明探针分子对铜离子的检测限。

图8为本发明探针分子对汞离子的检测限。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步的说明：

实施例1：合成探针L

步骤一：原料1根据文献Chem.Asian J.2011,6,1987–1991方法合成。

步骤二：将55mg原料1(0.0859mmol)溶于5ml乙腈中，加入24mg碳酸钾和15mg碘化钾，80℃回流状态下加入19mg NH(CH₂CH₂SCH₂CH₂CH₃)₂(0.0859mmol)，继续回流反应；反应结束后，将溶液冷却至室温，滤除沉淀，将滤液减压浓缩；用二氯甲烷/甲醇20:1为展开剂通过柱硅胶，真空干燥得35mg探针L。产率：52％

¹H NMR(400MHz,CDCl₃,ppm)δ＝7.94(d,1H,J＝6.3Hz),7.57(t,1H,J＝15.4Hz),7.49(d,2H,J＝1.6Hz),7.39(m,2H,J＝19.9Hz),7.09(t,1H,J＝6.8Hz),6.57(d,2H,J＝8.8Hz),6.39(s,2H),6.30(s,1H),6.28(d,1H,J＝2.4Hz),4.90(s,2H),3.71(s,2H),3.35(m,8H,J＝6.9Hz),2.73(t,4H,J＝13.3Hz),2.60(t,4H,J＝7.9Hz),2.44(t,4H,J＝14.6Hz),1.56(m,4H,J＝36.4Hz),1.18(t,12H,J＝13.5Hz),0.95(t,6H,J＝14.6Hz).

¹³C NMR(400MHz,CDCl₃,ppm)δ＝164.62,158.48,155.42,153.61,150.65,148.82,136.82,133.09,128.77,128.71,128.30,123.88,122.99,121.63,121.04,107.95,104.93,97.78,80.11,65.45,60.05,54.16,44.35,34.35,29.58,23.01,13.48,12.65.

FT-IR(KBr,cm^-1):2968,2925,2358,2341,2170,1715,1652,1634,1615,1557,1539,1516,1488,1456,1428,1384,1360,1265,1220,1120,10050,788,757,668,568,525,491.

实施例2：本发明探针L对铜离子的选择性：

将合成的探针L用乙腈/水(1:1，V/V)配制成0.4mM母液，用去离子水配制5mM的各种金属盐溶液。在比色皿中加入3ml的乙醇：水＝4:1(pH＝7.4缓冲溶液中,，V/V)溶液，然后向其中加入75μL 0.4mM的上述配置好的本发明探针分子L的溶液，将其稀释为10μM。混合均匀后，测定体系在450nm-650nm范围内的吸光值，探针分子L在562nm有微弱的吸光值，加入铜离子之后出现强吸收，吸光度增加了约870倍，溶液的颜色由无色变为了紫红色，而加入其他金属离子

K⁺,Na⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cr³⁺,Hg²⁺,Pb²⁺,Ag⁺,Al³⁺(浓度与Cu²⁺相当)均没有明显的变化，Cd²⁺稍有变化，见附图1。表明探针对铜离子具有高灵敏度、高选择性可视比色检测识别作用。

实施例3：共存金属离子对探针分子紫外检测铜离子的影响：

在浓度为10μM探针化合物的乙醇：水＝4:1(pH＝7.4缓冲溶液中,V/V)溶液中，在加入10当量的铜离子之后吸光度显著增强，再分别向探针-Cu²⁺溶液中加入其他金属离子如K⁺,Na⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cr³⁺,Hg²⁺,Pb²⁺,Ag⁺,Al³⁺(浓度与Cu²⁺相当)后测定体系吸光度，结果显示其它金属离子的存在并没有影响本发明探针分子L对于铜离子的检测。体现了该探针分子很强的抗干扰性能。见附图1.。

实施例4：本发明探针L对汞离子的选择性：

将合成的探针L用乙腈/水(1:1，V/V)配制成0.4mM母液，用去离子水配制5mM的各种金属盐溶液。在比色皿中加入3ml去离子水溶液，然后向其中加入75μL 0.4mM的上述配置好的本发明探针分子L的溶液，将其稀释为10μM。混合均匀后，利用荧光光谱法定性检测水中的汞离子。探针分子L对Hg²⁺有高效的识别性能：探针分子L几乎没有荧光，加入汞离子后在586nm出现了一个强的发射峰，荧光明显增强，增强了293倍，见附图2。这一结果表明探针分子对汞离子具有高度的专一选择性。

实施例5：共存金属离子对探针分子荧光检测汞离子的影响：

在浓度为10μM探针化合物的去离子水溶液中，在加入10当量的汞离子之后荧光显著增强，再分别向探针-Hg²⁺溶液中加入其他金属离子如K⁺,Ca²⁺,Na⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺,Co²⁺,Cd²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cr³⁺,Pb²⁺,Ag⁺,Al³⁺，Cu²⁺(浓度与Hg²⁺相当)后测定体系的荧光，结果显示其它金属离子的存在并没有影响本发明探针分子L对于汞离子的检测。体现了该探针分子很强的抗干扰性能。见附图2。

实施例6：pH对探针分子L及其铜、汞络合物的影响：

从图3和图4可以看出，在pH＝4～9范围内，分子探针L及其铜、汞络合物几乎不受pH的影响，这说明探针L及其铜、汞络合物在此pH范围内是稳定的。由此可得，探针L可以在pH＝4～9这一很宽的范围内专一性地识别铜离子和汞离子。

实施例7：该荧光探针与Hg²⁺对PC3细胞的荧光显微成像：

取培养好的PC3细胞片于六孔板中(标记为1号、2号)，向这两个六孔板中各加入3mL的培养基和75uL 0.4mM的该荧光探针溶液，在37℃恒温箱中孵育30分钟。然后于2号六孔板中加入60uL 5mM的氯化汞水溶液，将2号六孔板在37℃恒温箱中再孵育30分钟。之后弃掉片中的培养基，用PBS溶液洗涤2次，置于荧光倒置显微镜下进行明场和暗场成像拍照，1号片明场和暗场的图像分别标记为(a)、(b)，2号片明场和暗场的图像分别标记为(c)、(d)。从图中可知，图(b)没有荧光，图(d)有明显的橘红色荧光。见附图5。说明该探针与Hg²⁺离子在细胞内实现了染色，呈现荧光照影成像。

实施例8：该探针分子在不同环境水样中对汞离子的检测实验：

将眉湖，西流湖，金水河环境水样过滤，取3ml于比色皿中后分别加入该探针分子L(10uM)，再加入不同量的汞离子(0-12uM)，检测荧光信号的变化，见附图6。

实施例9：对本发明荧光探针分子进行可逆操作试验：

向加入本发明探针分子和铜离子之后的水溶液中再加入硫化钠水溶液，体系的吸光度迅速降低，基本回到探针分子的吸光度水平，说明该探针对铜离子的检测具有很好的可逆性，可以循环利用。向加入本发明探针分子和汞离子之后的水溶液中再加入硫化钠水溶液，体系的荧光强度迅速降低，基本回到探针分子的荧光强度水平，说明该探针对汞离子的检测具有很好的可逆性，可以循环利用。

实施例10：本发明探针分子对铜离子检测的灵敏度试验：

取75uL 0.4mM的本发明探针分子溶液加入到3ml乙醇-缓冲水溶液中，向其中加入2.5-5uM的铜离子水溶液，记录相应的吸光度变化，测试结果见附图7。由附图7可以看出该探针分子在铜离子浓度为2.5-5uM时吸光度明显增强且随铜离子浓度变化呈现很好的线性关系，线性相关系数为0.9939，对铜离子的检测下限为1.63×10^-6mol/L。

实施例11：本发明探针分子对汞离子检测的灵敏度试验：

取75uL 0.4mM的本发明探针分子溶液加入到3ml去离子水溶液中，向其中加入2.5-5uM的汞离子水溶液，记录相应的荧光强度变化，测试结果见附图8。由附图8可以看出该探针分子在汞离子浓度为2.5-5uM时荧光强度明显增强且随汞离子浓度变化呈现很好的线性关系，线性相关系数为0.9924，对汞离子的检测下限为2.36×10^-6mol/L。

该荧光探针可以很好地应用于水环境体系或生物细胞体系中的汞离子和铜离子的传感检测，分析及示踪。

Claims (5)

1.一种基于罗丹明B的水溶性Cu²⁺、Hg²⁺探针，其特征在于，其结构式如下：

     。

2.制备如权利要求1所述的罗丹明B的Cu²⁺、Hg²⁺探针的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

将原料1溶于乙腈中，加入碳酸钾和碘化钾，回流状态下加入NH(CH₂CH₂SCH₂CH₂CH₃)₂，继续回流反应；反应结束后，将溶液冷却至室温，滤除沉淀，将滤液减压浓缩；用二氯甲烷/甲醇为展开剂通过柱硅胶，真空干燥得探针L。

3.如权利要求1所述的基于罗丹明B的分子探针在金属离子检测方面的应用，其特征在于，采用分光光度法和荧光光谱法，将其应用于铜离子和汞离子的分析检测。

4.根据权利要求3所述的基于罗丹明B的分子探针在金属离子检测方面的应用，其特征在于，在pH = 7.4 缓冲溶液中,乙醇:水体积比 = 4:1 溶液中，加入用乙腈/水配制成的探针L母液，稀释，混合均匀后，加入待测样品中，用分光光度法测定 450 nm-650 nm范围内的吸光值，定性检测水相中铜离子；在纯水溶液中，加入用乙腈/水配制成的探针L母液，稀释，混合均匀后，加入待测样品中，用荧光光谱法测定体系的荧光强度，定性检测水样中的汞离子。

5.根据权利要求3所述的基于罗丹明B的分子探针在金属离子检测方面的应用，其特征在于，该荧光探针能用于水环境体系或生物细胞体系中的汞离子和铜离子的传感检测，分析及示踪。