CN114790202B - 生物硫醇激活的沉淀染料类高效诊疗一体化探针的制备与应用 - Google Patents
生物硫醇激活的沉淀染料类高效诊疗一体化探针的制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及沉淀荧光团类化合物作为生物硫醇(包括半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽)荧光探针。具体地，本发明的探针可用于测量、检测生物硫醇(包括半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽)；可以实现对生物硫醇(包括半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽)的高灵敏分析；可以区分肿瘤细胞与正常细胞；利用沉淀荧光团的特性，可以对肿瘤细胞产生选择性高毒性。
Description
技术领域
本发明涉及沉淀荧光团类化合物作为生物硫醇(包括半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽)荧光探针，能够迅速、灵敏的对生物硫醇进行识别，可应用于对肿瘤细胞与正常细胞进行区分，并能对肿瘤细胞表现出选择性高毒性。
背景技术
癌症作为一种死亡率极高的疾病，已经引起人们的广泛关注。癌症是一种多因素疾病，正常细胞可通过内源或外源性因素导致恶性增殖转变为癌细胞。但是，癌症在早期患病时，并无特异性症状，因此，对癌症患者的早期诊断较为困难，大大降低了病人的康复几率。并且，现阶段的治疗方式大多为手术治疗以及放疗和化疗，这些方法在损伤癌细胞的同时，也会对正常细胞造成损害，并没有特异性，后续还可能存在癌细胞扩散的风险。另一方面，生物硫醇，包括半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)和同型半胱氨酸(Hcy)，存在于各种正常细胞以及癌细胞中，在生命系统中发挥着关键作用。并且，研究发现，癌细胞中的生物硫醇的含量要高于正常细胞。因此，发展一种能够对细胞中生物硫醇进行检测的方法对癌症的诊断与治疗是及其重要和有意义的。
近年来，已报道的检测生物硫醇的方法有高效液相色谱法、分光光度比色法、气相色谱法、化学发光分析法、荧光探针分析法等。由于高灵敏性、高选择性以及可实现对细胞内检测物的实时检测等优点，小分子荧光探针已经被广泛应用于生物样品中的分析物的测定。目前，已经报道的硫醇检测的荧光探针大多数会在识别完成后在细胞中扩散，甚至有些荧光团会流散到细胞外，造成细胞成像不准确。此外，大多数的探针分子只能通过监测硫醇来区分正常细胞与肿瘤细胞，并无治疗作用，而且，目前已经报道的一些诊疗一体化试剂连接了药物大分子，合成困难，结构复杂。因此，开发结构简单的具有优秀的生物硫醇检测性能的诊疗一体化探针成为急需解决的课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类新型生物硫醇荧光探针，以及它们的制备方法和用途，具有合成简单、灵敏度高、选择性好且能快速响应生物硫醇等特点，并且能够在生理水平条件下对细胞进行荧光成像，同时具有有效区分正常细胞和肿瘤细胞的能力以及对肿瘤细胞选择性毒性的特征。
具体而言，一种用于测量、检测或筛选Cys、Hcy和GSH的生物硫醇的荧光探针，其特征在于：化学结构式如式(Ⅰ)所示：
式(I)中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10和R11为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10和R11可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的荧光探针是R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10和R11均为氢原子的式(Ⅳ)化合物，其结构式如下：
本发明还提供了式(Ⅰ)荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
将式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物以及三乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，常温反应，然后溶于饱和食盐水中用二氯甲烷进行萃取，将得到的产物溶液进行旋蒸，得到粗产品。如果要得到较纯的产品，可以将固体用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系过液相色谱柱得到纯净的式(Ⅰ)化合物，其反应式如下：
式(Ⅰ)-(Ⅲ)中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10和R11为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10和R11可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物的摩尔比为1:1-1:2。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物的反应时间为6-8小时。
本发明还提供了用于测量、检测或筛选半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(I)荧光探针。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(I)荧光探针具有以下结构：
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了用于检测样品中Cys、Hcy和GSH的存在或测定样品中的Cys、Hcy和GSH含量的方法，
a)使所述式(I)或式(Ⅳ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了检测样品中Cys、Hcy和GSH的存在或测定样品中的Cys、Hcy和GSH含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(Ⅳ)荧光探针。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅳ)荧光探针在细胞荧光成像中的应用。
本发明还提供了所述荧光探针制备应用于区分正常细胞与肿瘤细胞以及对肿瘤细胞产生选择性高毒性的试剂中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)可筛选肿瘤细胞
本发明的荧光探针可以通过正常细胞与肿瘤细胞中硫醇含量的不同，在正常细胞与肿瘤细胞中表现出不同的荧光信号，实现对正常细胞与肿瘤细胞的区分。
(2)可对肿瘤细胞表现选择性高毒性
本发明的荧光探针可利用肿瘤细胞中高表达的生物硫醇作为控制开关，在肿瘤细胞中释放难溶性荧光团作为简易药物分子，在肿瘤细胞中聚集引起细胞应激，造成肿瘤细胞的选择性损伤。
(3)灵敏度高，响应迅速
本发明的荧光探针与半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽反应非常灵敏，并且响应迅速，从而有利于对半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的检测。
(4)选择性高，抗干扰能力强
本发明的荧光探针可选择性的与半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他氨基酸以及阴阳离子，包括但不限于丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、亚硫酸根、硝酸根、碳酸根、氯离子、硫酸根、亚硫酸氢根、过氧化氢等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。
(5)可生理水平条件下应用
本发明的荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的氨基酸对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像。
(6)稳定性好
本发明的荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
(7)合成简单
本发明的荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1制备得到的探针的核磁氢谱；
图2是实施例1制备得到的探针的核磁碳谱；
图3是探针(5μM)分别加入Cys、Hcy、GSH前后的响应时间谱图；
图4中(a)是探针(5μM)加入Cys(0-50μM)前后的荧光光谱；图4中(b)是探针(5μM)在545nm处的荧光强度和Cys(0-10μM)的线性关系图；
图5中(a)是探针(5μM)加入Hcy(0-50μM)前后的荧光光谱；图5中(b)是探针(5μM)在545nm处的荧光强度和Hcy(0-10μM)的线性关系图；
图6中(a)是探针(5μM)加入GSH(0-20μM)前后的荧光光谱；图6中(b)是探针(5μM)在525nm处的荧光强度和GSH(1-9μM)的线性关系图；
图7中(a)是Cys/Hcy(50μM)与其他不同离子分析物(250μM)对探针(5μM)的荧光强度的影响。分析物包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、亚硫酸根、硝酸根、碳酸根、氯离子、硫酸根、亚硫酸氢根、过氧化氢、半胱氨酸和同型半胱氨酸；图7中(b)是GSH(50μM)与其他不同离子分析物(250μM)对探针(5μM)的荧光强度的影响。分析物包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、亚硫酸根、硝酸根、碳酸根、氯离子、硫酸根、亚硫酸氢根、过氧化氢和谷胱甘肽；
图8是不同离子分析物(除特殊表明外，都为250μM)存在下探针(5μM)对Cys(50μM)识别后的荧光强度；柱状图代表的探针在不同测试条件下在545nm处的荧光强度；
图9是不同离子分析物(除特殊表明外，都为250μM)存在下探针(5μM)对Hcy(50μM)识别后的荧光强度；柱状图代表的探针在不同测试条件下在545nm处的荧光强度；
图10是不同离子分析物(除特殊表明外，都为250μM)存在下探针(5μM)对GSH(50μM)识别后的荧光强度；柱状图代表的探针在不同测试条件下在525nm处的荧光强度；
图11是不同浓度(0-100μM)探针的吸收光谱；
图12是不同浓度(0-100μM)探针的吸收光谱分别在363nm和472nm处的吸光度与探针浓度的线性关系图；
图13是探针(10μM)在HepG2细胞中对外源性Cys、Hcy、GSH(200μM)的荧光成像；
图14是探针(10μM)在不同肿瘤细胞中的荧光成像；
图15是探针(10μM)和对照化合物(10μM)在HUVEC细胞和A549细胞中16小时的毒性效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1式(Ⅳ)化合物的合成
合成路线如下：
具体操作步骤如下：
实施方案1：将沉淀荧光团(309mg，1mmol)与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑(200mg，1mmol)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入三乙胺(101mg，1mmol)常温搅拌6小时。然后溶于饱和食盐水中用二氯甲烷进行萃取，将得到的产物溶液进行旋蒸，得到粗产品。将粗产品用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系(v/v,30:1)过液相色谱柱，得到纯净的式(Ⅳ)化合物180mg，产率为38％。
实施方案2：将沉淀荧光团(309mg，1mmol)与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑(300mg，1.5mmol)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入三乙胺(152mg，1.5mmol)常温搅拌6小时。然后溶于饱和食盐水中用二氯甲烷进行萃取，将得到的产物溶液进行旋蒸，得到粗产品。将粗产品用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系(v/v,30:1)过液相色谱柱，得到纯净的式(Ⅳ)化合物200mg，产率为42％。
实施方案3：将沉淀荧光团(309mg，1mmol)与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑(300mg，1.5mmol)溶于10ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入三乙胺(202mg，2mmol)常温搅拌8小时。然后溶于饱和食盐水中用二氯甲烷进行萃取，将得到的产物溶液进行旋蒸，得到粗产品。将粗产品用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系(v/v,30:1)过液相色谱柱，得到纯净的式(Ⅳ)化合物230mg，产率为49％。
实施方案4：将沉淀荧光团(309mg，1mmol)与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑(200mg，1mmol)溶于7ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入三乙胺(152mg，1.5mmol)常温搅拌8小时。然后溶于饱和食盐水中用二氯甲烷进行萃取，将得到的产物溶液进行旋蒸，得到粗产品。将粗产品用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系(v/v,30:1)过液相色谱柱，得到纯净的式(Ⅳ)化合物240mg，产率为51％。
实施方案5：将沉淀荧光团(309mg，1mmol)与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑(400mg，2mmol)溶于7ml的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入三乙胺(202mg，2mmol)常温搅拌8小时。然后溶于饱和食盐水中用二氯甲烷进行萃取，得到粗产品。将粗产品用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系(v/v,30:1)过液相色谱柱，得到纯净的式(Ⅳ)化合物280mg，产率为59％。
制备得纯净的式(Ⅳ)化合物的核磁氢谱与碳谱分别如图1和图2所示。
实施例2：测试荧光探针的时间动力学
配制一个荧光探针浓度为5μM的10mL的测试体系，然后将100μM的半胱氨酸加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，除特殊说明外，所有光谱数据均在λex＝445nm条件下采集，狭缝:Wex＝Wem＝5nm。测试结果如图3中(A)所示。
荧光探针对同型半胱氨酸和谷胱甘肽的时间动力学测试方法与半胱氨酸的测试相同，测试结果分别如图3中(B)和(C)所示。
由图3可以清楚地看到，当半胱氨酸加入后，经检测，10min左右545nm处的荧光强度达到最大值并保持不变；当同型半胱氨酸加入后，经检测，20min左右545nm处的荧光强度达到最大值并保持不变；当谷胱甘肽加入后，经检测，20min左右525nm处的荧光强度达到最大值并保持不变；这说明该探针与半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽反应迅速，能够为其测定提供快速的分析方法。
实施例3:测试荧光探针对于Cys的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的Cys(0-50μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图4所示。
从图4中(a)可以清晰的看出，随着Cys浓度的增加，545nm处的荧光强度逐渐升高。并且，由图4中(b)可以看出探针(5μM)加入Cys(0-10μM)之后，其545nm处的荧光强度的与Cys浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对Cys进行定量分析。
实施例4:测试荧光探针对于Hcy的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的Hcy(0-50μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图5所示。
从图5中(a)可以清晰的看出，随着Hcy浓度的增加，545nm处的荧光强度逐渐升高。并且，由图5中(b)可以看出探针(5μM)加入Hcy(0-10μM)之后，其545nm处的荧光强度的与Hcy浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对Hcy进行定量分析。
实施例5：测试荧光探针对于GSH的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的GSH(0-20μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图6所示。
从图6中(a)可以清晰的看出，随着GSH浓度的增加，525nm处的荧光强度逐渐升高。并且，由图6中(b)可以看出探针(5μM)加入GSH(1-9μM)之后，其525nm处的荧光强度的与GSH浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对GSH进行定量分析。
实施例6：测试荧光探针的选择性
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、亚硫酸根、硝酸根、碳酸根、氯离子、硫酸根、亚硫酸氢根、过氧化氢、Cys和Hcy/GSH；除Cys和Hcy/GSH为50μM外，其他分析物浓度均为250μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图7所示。
从图7中(a)可以清晰的看出，在发射波长在545nm处时，只有Cys和Hcy加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计；从图7中(b)可以清晰的看出，在发射波长在525nm处时，只有GSH加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对生物硫醇类(Cys和Hcy/GSH)具有较高的选择性，有利于对生物硫醇类(Cys和Hcy/GSH)的检测分析。
实施例7：测试荧光探针的抗干扰能力
配置多个测试体系于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、钾离子、钙离子、钠离子、镁离子、铝离子、硝酸根、碳酸根、氯离子、硫酸根、亚硝酸根、硫化氢、空白；除特殊标明外，其他分析物浓度均为250μM)加入到测试体系中，然后加入Cys(除了第一个空白组不添加外其他组均为50μM)，分别加入荧光探针(5μM)，摇晃均匀后静置30分钟，用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图8所示。
针对于识别Hcy和GSH的抗干扰能力测试，与上述方法相同，只是替换半胱氨酸的添加即可。测试结果分别如图9-10所示。
从图8-10可以清晰的看出，其他分析物加入对荧光探针检测半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽几乎没有干扰，实验证明，该探针对生物硫醇(半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽)具有较高的抗干扰能力，有利于对生物硫醇(半胱氨酸、同型半胱氨酸以及谷胱甘肽)的检测分析。
实施例8：测试荧光探针的溶解性
配置多个探针浓度为0-100μM的平行样品于10mL比色管中，摇晃均匀后用紫外光谱仪测试其吸光度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH 7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且吸收光谱是在25℃下测得的，测试结果如图11和12所示。
从图11可以清晰的看出，随着荧光探针浓度的增加，363nm处的吸光度逐渐升高，472nm处的吸光度逐渐降低。并且，由图12可以看出探针浓度与363nm处的吸光度和472nm处的吸光度均具呈现了良好的线性关系，这证明借助于荧光探针具有良好的溶解性，有利于其商业应用。
实施例9:荧光探针对HepG2细胞中外源性生物硫醇(Cys/Hcy/GSH)的荧光显微成像
将HepG2细胞分成五组，A组用探针(10μM)孵育30min；B组先用NEM(50μM)孵育30分钟后，再用探针(10μM)孵育30min；C组先用Cys(200μM)孵育30分钟后，再用探针(10μM)孵育30min；D组先用GSH(200μM)孵育30分钟后，再用探针(10μM)孵育30min；E组先用Hcy(200μM)孵育30分钟后，再用探针(10μM)孵育30min。最后对五组细胞分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图13所示。
从图13可以看出，该探针可以检测HepG2细胞中外源性的生物硫醇(Cys/Hcy/GSH)；实验证明，该探针可以应用于生物样品中的生物硫醇(Cys/Hcy/GSH)检测。
实施例10:荧光探针在不同种类细胞中的荧光显微成像
选取四组不同种的细胞，A组选取正常细胞RAW264.7细胞；B组选取正常细胞HUVEC细胞；C组选取肿瘤细胞A549细胞；D组选取肿瘤细胞HepG2细胞。四组细胞均用探针(20μM)孵育30min后分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图14所示。
从图14可以看出，该探针在肿瘤细胞中的荧光强度高于在正常细胞；实验证明，该探针可以通过细胞中不同的硫醇含量将正常细胞与肿瘤细胞区分开。
实施例11：探针的检出限测试和计算
采用荧光滴定法计算检出限。检测限计算公式如下:
检出限＝3σ/k
σ是空白探针的荧光强度的标准差，k是图4-6线性关系图的斜率。
由此计算式(Ⅱ)探针对Cys/Hcy/GSH的检出限分别为11.4nM、16.8nM、145.4nM。
实施例12:荧光探针在正常细胞与肿瘤细胞中的毒性效果
选取两组细胞，A组为正常细胞(HUVEC细胞)；B组为肿瘤细胞(A549细胞)。两组细胞分别用不同浓度的探针和不同浓度的对照化合物进行孵育16小时，用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测毒性效果，测试结果如图15所示。
从图15可以清晰的看出，该探针会对肿瘤细胞(A549细胞)产生更强的毒性效果。实验证明，该探针可以对肿瘤细胞产生选择性高毒性，也能证明本发明荧光探针不存在识别完成后在细胞中扩散，甚至荧光团流散到细胞外的情况，从而有利于细胞成像的准确性。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于测量、检测或筛选Cys、Hcy和GSH的生物硫醇荧光探针，其特征在于：化学结构式如式（Ⅳ）所示：
。
2.一种制备权利要求1所述荧光探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：使式（Ⅴ）化合物与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑反应制备得式（Ⅳ）化合物，其反应式分别如下：
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式（Ⅴ）化合物与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑以及三乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中，常温反应，然后溶于饱和食盐水中用二氯甲烷进行萃取，将得到的产物溶液进行旋蒸，得到粗产品，并将上述粗产品用二氯甲烷和无水甲醇的混合体系过液相色谱柱得到纯净的式（Ⅳ）化合物。
4.一种用于测量、检测或筛选Cys、Hcy和GSH的生物硫醇荧光探针组合物，其包含权利要求1所述荧光探针。
5.如权利要求4所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
6.一种用于用于非疾病诊断和治疗目的的检测样品中Cys、Hcy和GSH的存在或测定样品中的Cys、Hcy和GSH含量的方法，其包括：
a)使权利要求1所述荧光探针与样品接触以形成荧光化合物；
b）测定所述荧光化合物的荧光性质。
7.如权利要求6所述方法，所述样品是化学样品或生物样品。
8.根据权利要求1所述荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针制备应用于区分正常细胞与肿瘤细胞以及对肿瘤细胞产生选择性高毒性的试剂。
9.权利要求1所述荧光探针在细胞荧光成像的应用，所述应用用于非疾病诊断和治疗目的。
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