CN114394986B - 一种比率型过氧亚硝酰荧光探针、制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种比率型过氧亚硝酰荧光探针，具体地，本发明的探针可作为过氧亚硝酰荧光探针用于过氧亚硝酰的检测、测量或筛选。这类探针可实现如下的技术效果中的至少一个：可以高特异性地识别过氧亚硝酰；可以快速响应过氧亚硝酰；可以高灵敏地分析过氧亚硝酰的浓度；可以实现对过氧亚硝酰的比率定量分析；生物毒性低，可以应用生物细胞中的过氧亚硝酰成像，并可以实现对细胞内过氧亚硝酰变化的荧光信号响应及其实时可视化检测；合成简单，性质稳定，可以长期保存使用。

Description

一种比率型过氧亚硝酰荧光探针、制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种比率型过氧亚硝酰荧光探针及其 在测量、检测或筛选过氧亚硝酰及活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提 供了制备所述荧光探针的方法。
背景技术
过氧亚硝酰(ONOO-)是一种重要的活性氧物种，它通过一氧化氮和超氧 化物之间的反应内源性地产生。过氧亚硝酰在信号转导中起着至关重要的作用， 并且由于其异常强效的氧化能力和亲核特性，可以破坏许多关键的生物分子， 如蛋白质，脂质和核酸。过氧亚硝酰水平的异常与一些疾病相关，例如心血管疾病，神经退行性疾病，炎症疾病，癌症等。因此，开发用于监测过氧亚硝酰 的分析方法对于相关疾病的诊断有十分重要的作用。
近年来，荧光探针广泛用于检测生命系统中的生物活性分子，虽然目前已 开发出许多用于检测生物系统中过氧亚硝酰的荧光探针，但是大多数荧光探针 都是单发射波长。与单波长探针相比，比率型荧光探针具有消除多种干扰因素 的优点，例如探针定位，环境变化，激发和发射效率等。据我们所知，只有少 数荧光探针可以比率监测线粒体中的过氧亚硝酰，而且用单一激发波长实现比率检测的探针更少。Qian课题组开发了一种基于FRET机理的比率探针，可用 于线粒体中过氧亚硝酰的半定量化检测；Yuan课题组报道了一种荧光探针，在 发炎的小鼠模型中对内源性过氧亚硝酰进行比率荧光成像；Li课题组报告了两例比率探针用于监测线粒体内的过氧亚硝酰。综上所述，开发一种单一激发波 长的用于高选择性的、高灵敏度的检测过氧亚硝酰比率型荧光探针具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一种比率型过氧亚硝酰荧光探针以及 它们的制备方法和用途，具有合成简单、选择性好、灵敏度高、能够检测过氧 亚硝酰，并且能够在生理水平条件下对过氧亚硝酰进行有效测量、检测或筛选。
具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
其中：R1，R2为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧 基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R1，R2，均为氢原子 的式(Ⅱ)化合物，其结构式如下：
本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法，包括如下步骤：
使式(Ⅲ)化合物与式(Ⅳ)化合物反应制备得式(Ⅰ)化合物：
其中：R1，R2为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧 基、磺酸基、酯基和羟基组成的组；且其中的R1，R2，可以相同或不同。
具体而言：将式(Ⅲ)化合物和式(Ⅳ)化合物与碳酸钾在N,N-二甲基甲 酰胺中加热回流反应，反应结束后，通过减压旋蒸得到固体，然后，进一步通 过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式(Ⅰ) 化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(Ⅳ)化合物和式(Ⅲ)化合物 的摩尔比为1:1-1:5。
在本发明的一些具体实施方案中，式(I)化合物制备方法步骤所述回流反 应时间为10-12小时。
本发明还提供了用于测量、检测或筛选过氧亚硝酰的荧光探针组合物，其 包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(I)化合物具有以下结构：
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、 酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了用于检测样品中过氧亚硝酰的存在或测量样品中的过氧亚 硝酰含量的方法，其包括：
a)使所述式(I)或式(Ⅱ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者 动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了检测样品中过氧亚硝酰的存在或测定样品中的过氧亚硝酰 含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(Ⅱ)化合物。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅱ)化合物在细胞荧光成像中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)比率检测
本发明的过氧亚硝酰的荧光探针，可以使用单一激发波长实现比率测量、 检测或筛选过氧亚硝酰，其具有消除多种干扰因素的优点，例如探针定位，环 境变化，激发和发射效率等。
(2)快速响应
本发明的过氧亚硝酰荧光探针能够对过氧亚硝酰快速响应，有利于过氧亚 硝酰的快速或实时检测。
(3)选择性好
本发明的过氧亚硝酰荧光探针可选择性的与过氧亚硝酰发生特异性反应， 生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子及生命体内的其他物质，包 括但不限于钾离子、钙离子、钠离子、亚铁离子、铁离子、铜离子、氯离子、 溴离子、碘离子、硫离子、亚硝酸根离子、硝酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢 根离子、硫酸氢根离子、亚硫酸氢根离子、谷胱甘肽、半胱氨酸、过氧化叔丁醇自由基、羟基自由基、单线态氧、次氯酸根离子、过氧化氢等，本发明荧光 探针显示出了较高的选择性。
(4)生物毒性低
本发明荧光探针具有低毒性的特点，有利于将其长时间应用于细胞样品中 过氧亚硝酰的检测或成像。
(5)灵敏度高
本发明的过氧亚硝酰荧光探针与过氧亚硝酰反应非常灵敏，从而有利于对 过氧亚硝酰的检测。
(6)可生理水平下应用
本发明的过氧亚硝酰荧光探针可在生理水平条件下实现对过氧亚硝酰的测 量、检测或筛选，并且，可以进行细胞生物成像的应用，能实现对细胞内过氧 亚硝酰变化的荧光信号响应及其实时可视化检测。
(7)合成简单
本发明的过氧亚硝酰荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1合成探针核磁共振氢谱图；
图2是实施例1合成探针核磁共振氢谱图；
图3是实施例1合成探针质谱图；
图4是探针加入过氧亚硝酰前后的吸收光谱(A)和荧光光谱谱图(B)；
图5探针加入过氧亚硝酰前后的响应时间谱图；
图6(A)是探针加入过氧亚硝酰前后的荧光光谱，(B)是探针在678nm处 荧光强度和570nm处荧光强度的比值和过氧亚硝酰的线性关系图；
图7是不同离子分析物(谷胱甘肽、半胱氨酸(1mM)，其它都为100μM)对探 针的荧光强度的影响，柱状图代表的是不同分析物存在下探针的荧光强度比值 (I678/I570)；
图8是不同浓度探针对HeLa细胞的毒性实验谱图，浓度分别为：0μM，10μM， 15μM，20μM；
图9是探针在HeLa细胞中检测内源性过氧亚硝酰的细胞成像图及对照组细 胞成像图；
图10是探针在斑马鱼细胞中检测内源性过氧亚硝酰的细胞成像图及对照组 细胞成像图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、 清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该 用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员 在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1式(Ⅱ)化合物的合成
合成路线如下：
具体操作步骤如下：
将式(Ⅴ)化合物(348mg,1mmol)和式(Ⅳ)化合物(356mg,1.2mmol) 加入到50mL的圆底烧瓶中，然后加入10mLN,N-二甲基甲酰胺和276mg碳酸钾， 80℃加热回流反应12小时，冷却至室温，减压旋蒸除去溶剂得到固体，然后， 进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)为洗脱剂，可得到纯净的式(Ⅱ)化合物269mg，产率为49.8％。
用该方法合成的式(Ⅱ)化合物氢谱、碳谱、质谱图分别如图1、图2和图 3所示。
实施例2：测试荧光探针与过氧亚硝酰反应前后的吸收光谱和荧光光谱变化
配制两个探针浓度为10μM的10mL的测试体系，摇晃均匀后，然后分别 用吸收光谱仪和荧光光谱仪测试其吸收光谱和荧光光谱，然后，分别将20μM 的过氧亚硝酰加入到测试体系中，摇晃均匀后，静置3分钟，然后分别用吸收 光谱仪和荧光光谱仪，测试其吸收光谱和荧光光谱变化。上述测定是在PBS缓 冲溶液(10mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备 的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
由图4(A)可以清楚地看到，加入过氧亚硝酰后，408nm的吸收峰逐渐降 低，并在521nm出现新的吸收峰。与此同时，吸收光谱在442nm处出现一个等 吸收点。
由图4(B)可以清楚地看到，加入过氧亚硝酰后，570nm处的发射峰降低， 在678nm处出现新的发射峰。与此同时，荧光光谱在621nm处出现一个等发射点。
实施例3：测试荧光探针的时间动力学
配制一个探针浓度为10μM的10mL的测试体系，然后将20μM的过氧亚 硝酰加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。 上述测定是在PBS缓冲溶液(10mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针 是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
由图5可以清楚地看到，当过氧亚硝酰加入后，探针荧光强度比值(I678/I570) 随时间变长而变强，并在2分钟之内达到最大值，这说明该探针对过氧亚硝酰 快速响应，能够为过氧亚硝酰的测定提供快速的分析方法。
实施例4：测试荧光探针对于过氧亚硝酰的浓度梯度
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓 度(0-15μM)的过氧亚硝酰加入到测试体系中，摇晃均匀后静置3分钟，用荧 光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mM PBS,pH7.4) 体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃ 下测得的。
从图6(A)可以清晰的看出，随着过氧亚硝酰浓度的增加，570nm处的发 射峰逐渐降低，在678nm处的发射峰逐渐升高。并且，由图6(B)可以看出探 针(10μM)加入过氧亚硝酰(0-15μM)之后，其荧光强度比值(I678/I570)与过 氧亚硝酰浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对过 氧亚硝酰进行定量分析。
实施例5：测试荧光探针的选择性
配置多个探针浓度为10μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分 析物(分析物分别是空白、钾离子、钙离子、钠离子、亚铁离子、铁离子、铜 离子、氯离子、溴离子、碘离子、硫离子、亚硝酸根离子、硝酸根离子、碳酸 根离子、碳酸氢根离子、硫酸氢根离子、亚硫酸氢根离子、谷胱甘肽(1mM)、半 胱氨酸(1mM)、过氧化叔丁醇自由基、羟基自由基、单线态氧、次氯酸根离子、 过氧化氢和过氧亚硝酰；除特殊标明外，其他分析物浓度均为100μM)加入到 测试体系中，摇晃均匀后，静置3分钟，然后用荧光光谱仪测试其荧光强度变 化。上述测定是在PBS缓冲溶液(10mMPBS,pH7.4)体系中进行的，所使用的 探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的。
从图7可以清晰的看出，只有过氧亚硝酰加入的时候才能引起探针荧光强 度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对 过氧亚硝酰具有较高的选择性，可以被用作环境中和生物体内过氧亚硝酰的专 一性识别分析。
实施例6：探针的检出限测试和计算
采用荧光滴定法计算检出限。检测限计算公式如下:
检出限＝3σ/k
σ是空白探针的荧光强度的标准差，k是图6(B)线性关系图的斜率。
由此计算式(II)探针的检出限为212nM。
实施例7：荧光探针对HeLa细胞的毒性测试
使用MTT法检测不同浓度的探针对HeLa细胞的细胞毒性。探针浓度分别 为0μM，10μM，15μM，20μM，探针孵育细胞的时间为24h。
从图8可以清晰的看出，探针具有低毒性的特点，可以将其长时间应用于 细胞样品中过氧亚硝酰的实时检测。
实施例8:荧光探针对HeLa细胞内源性过氧亚硝酰的检测
将HeLa细胞分成三组，a组为空白组，作为对照组，直接用探针(10μM) 孵育30min；b组为清除组，先用NAC(N-乙酰半胱氨酸，一种过氧亚硝酰清 除剂，可以消除HeLa细胞产生的过氧亚硝酰)孵育1h，然后再用探针(10μM) 孵育30min；c组为刺激组，先用100ng/mL的IFN-γ(干扰素-γ)和1μg/mL LPS (脂多糖)孵育6h，再用10nM PMA(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，可在 生理刺激下产生高水平过氧亚硝酰)孵育30min然后再用探针(10μM)孵育30min；最后对三组细胞分别进行共聚焦显微成像。
从图9可以清晰的看出，当清除过氧亚硝酰后，绿色通道内的荧光信号升 高，与此同时红色通道内的荧光信号降低；当刺激产生过氧亚硝酰后，绿色通 道内的荧光信号降低，与此同时红色通道内的荧光信号增强。以上实验结果表 明探针可以检测细胞内过氧亚硝酰的变化，从而通过建立两通道内的荧光强度比值(F黄/F红)与过氧亚硝酰之间的线性关系，实现对细胞内过氧亚硝酰的精 确测定。
实施例9：探针对斑马鱼内源性过氧亚硝酰的检测
将斑马鱼细胞分成三组，a组为空白组，作为对照组，直接用探针(10μM) 孵育30min；b组为清除组，先用鱼藤酮(一种诱导帕金森病药物，可以诱导斑 马鱼发生帕金森病产生过量过氧亚硝酰)孵育1h，然后再用探针(10μM)孵 育30min；c组为清除组，先用硫化氢(一种过氧亚硝酰消耗剂，可以消耗斑马 鱼产生的过氧亚硝酰)孵育1h，然后再用探针(10μM)孵育30min；最后对三 组斑马鱼分别进行共聚焦显微成像。
从图10可以清晰的看出，当清除过氧亚硝酰后，绿色通道内的荧光信号升 高，与此同时红色通道内的荧光信号降低；当刺激产生过氧亚硝酰后，绿色通 道内的荧光信号降低，与此同时红色通道内的荧光信号增强。以上实验结果表 明探针可以检测斑马鱼内过氧亚硝酰的变化，从而通过建立两通道内的荧光强度比值(F黄/F红)与过氧亚硝酰之间的线性关系，实现对斑马鱼内过氧亚硝酰 的精确测定。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精 神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本 发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.化合物，其具有以下结构：
。
2.一种制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：使式（Ⅴ）化合物与式（Ⅳ）化合物反应制备得式（Ⅱ）化合物：
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式（Ⅴ）化合物和式（Ⅳ）化合物与碳酸钾在N,N-二甲基甲酰胺中加热回流反应，反应结束后，通过减压旋蒸得到固体，然后，进一步通过色谱柱进行分离，二氯甲烷和甲醇的混合体系为洗脱剂，可得到纯净的式（Ⅱ）化合物。
4.一种用于测量、检测或筛选过氧亚硝酰的荧光探针组合物，其包含权利要求1所述化合物。
5.如权利要求4所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
6.一种用于检测样品中过氧亚硝酰的存在或测定样品中的过氧亚硝酰含量的方法，所述方法为非疾病诊断目的，包括：
a)使权利要求1所述的化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b）测定所述荧光化合物的荧光性质。
7.如权利要求6所述方法，所述样品是化学样品或生物样品。
8.权利要求1所述化合物在细胞荧光成像中的应用，所述应用为非疾病诊断目的应用。
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CN111808607A (zh) * 2020-07-29 2020-10-23 湖南文理学院 一种检测过氧亚硝酰阴离子的荧光探针、制备方法和应用

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