CN113402470A - 一种多通道可逆比色汞离子荧光探针、制备方法与应用 - Google Patents

一种多通道可逆比色汞离子荧光探针、制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多通道可逆比色汞离子荧光探针，具体地，本发明的探针本发明可用于测量、检测或筛选汞离子及活细胞荧光成像，本发明的探针以巴比妥酸化合物作为汞离子配位单元，通过酰亚胺结构去质子化实现与汞配位的荧光探针，能够通过比色以及丁达尔效应迅速、灵敏、高选择的识别汞离子，可实现在水溶液中进行裸眼识别，还可通过荧光分析方法超灵敏、高选择的检测活细胞和斑马鱼体内的汞离子。

Description

一种多通道可逆比色汞离子荧光探针、制备方法与应用
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种多通道可逆比色汞离子荧光探针及其在测量、检测或筛选汞离子及活细胞荧光成像方法中的应用；本发明还提供了制备所述荧光探针的方法。
背景技术
汞(Hg2+)作为一种具有严重生理毒性的金属元素，由于金矿开采，石油炼制，以及化石燃料，大量的汞释放到环境当中，引起人们越来越多的关注。环境中的无机汞离子可在一定条件下由生物体转化为剧毒的甲基汞。无机汞主要影响肾脏，而甲基汞进入人体后主要侵害神经系统，尤其是中枢神经系统。两者均可通过食物链在生物组织里高度富集，从而对人和自然界造成巨大的危害。汞中毒会对整个社会产生极其恶劣的影响，现在汞被优先列在全球环境监控系统清单上，因此，对汞离子的选择性识别，尤其是汞离子的原位、实时、在线监测对于医学、生物学和环境科学都具有重要意义。
现阶段，已经报道的检测汞离子的分析方法包括原子吸收-发射光谱法、高效液相色谱法、电感耦合等离子体质谱、核磁共振、电化学方法、荧光探针分析法，在这众多方法中，荧光探针方法因其独特的优势而受到广泛关注。但是，目前已经报道的方法仍有一定的缺陷，比如选择性差，灵敏度低，合成复杂，响应时间长、检测形式单一等。因此，开发一种迅速、高选择性、高灵敏度、多种通道检测汞离子的荧光探针成为本领域技术人员亟需解决的课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在于提供一类新颖的可多种形式检测汞离子的比色荧光探针，其合成简单，选择性好，且可以通过比色以及丁达尔效应实现在水溶液中快速灵敏的检测汞离子，进而能在水溶液中实现对汞离子裸眼检测，以实现对汞离子的多通道检测。
具体而言，本发明提供了一种化合物，具有式(Ⅰ)所示的结构：
Figure BDA0003120360110000021
式(I)中，R1，R2，R3，R4，R5和R6为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的RR1，R2，R3，R4，R5和R6可以相同或不同。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的化合物是R1，R2，R3，R4，R5和R6均为氢原子的式(Ⅳ)化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003120360110000022
本发明还提供了式(Ⅰ)化合物的制备方法，包括如下步骤：
将式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物以及无水哌嗪溶于无水乙醇，常温反应，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅰ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，可得到纯净的式(Ⅰ)化合物，其反应式如下：
Figure BDA0003120360110000031
式(Ⅰ)-(Ⅲ)中：R1，R2，R3，R4，R5和R6为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5和R6可以相同或不同。
具体而言：将式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物以及无水哌嗪溶于无水乙醇，常温反应，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅰ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，可得到纯净的式(Ⅰ)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物的摩尔比为3:2-1:2。
在本发明的一些具体实施方案中，式(I)化合物制备方法步骤(1)和步骤(2)所述反应时间为10-24小时。
本发明还提供了用于测量、检测或筛选汞离子的荧光探针组合物，其包含本发明的所述式(I)化合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述式(I)化合物具有以下结构：
Figure BDA0003120360110000032
在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
本发明还提供了用于检测样品中汞离子的存在或测量样品中的汞离子含量的方法，其包括：
a)使所述式(I)或式(Ⅳ)化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质，或通过比色来裸眼检测，或通过丁达尔效应来裸眼检测。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是化学样品或生物样品。
在本发明的一些具体实施方案中，所述样品是包括水、血液、微生物或者动物细胞或组织在内的生物样品。
本发明还提供了检测样品中汞离子的存在或测定样品中的汞离子含量的试剂盒，其包含所述式(I)或式(Ⅳ)化合物。
本发明还提供了所述式(I)或式(Ⅳ)化合物在细胞荧光成像中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
(1)多通道检测
本发明的汞离子荧光探针既可以通过荧光强度变化检测来测定汞离子的含量，又可以通过比色或者丁达尔效应实现裸眼快速检测，方便快捷。
(2)可逆检测
本发明的汞离子荧光探针识别汞离子后，荧光发生淬灭，淬灭后的体系在加入碘化钾后，荧光得到恢复。因此，本发明的汞离子荧光探针可用于汞离子的实时可逆检测，尤其是可用于细胞内汞离子的实时可逆检测。
(3)选择性高，抗干扰能力强
本发明的汞离子荧光探针可选择性的与汞离子发生特异性反应，生成荧光变化的产物，相较于常见的其他金属离子，包括但不限于镉离子、银离子、铜离子、铝离子、钾离子、镍离子、铅离子、锌离子、钙离子、二价铁离子、铬离子、锰离子、钠离子、镁离子、钴离子、三价铁离子等，本发明荧光探针显示出了较高的选择性，并且抗干扰能力强。
(4)灵敏度高，响应迅速
本发明的汞离子荧光探针与汞离子反应非常灵敏，并且响应迅速，从而有利于对汞离子的检测。
(5)可生理水平条件下应用
本发明的汞离子荧光探针可在生理水平条件下应用，并且，生物体内常见的金属离子对其干扰较小，可以应用于活细胞荧光成像。
(6)稳定性好
本发明的汞离子荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
(7)合成简单
本发明的汞离子荧光探针合成简单，有利于商业化的推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是探针(5μM)加入汞离子(5μM)前后的吸收光谱；
图2是探针(5μM)对汞离子(5μM)在620nm处的时间动力学谱；
图3(a)是探针(5μM)加入汞离子(0-4μM)前后的荧光光谱；
图3(b)是探针(5μM)在620nm处的荧光强度和汞离子(0-1.5μM)的线性关系图；
图4(a)是汞离子(5μM)与其他不同离子分析物(25μM)对探针(5μM)的荧光强度的影响；
图4(b)是不同离子分析物(25μM)存在下探针(5μM)对汞离子(5μM)识别后的荧光强度；
图5是荧光探针与汞离子和碘化钾存在一个可逆过程的荧光图像；
图6(a)是探针(10μM)在HeLa细胞中对外源性汞离子的荧光显微成像；
图6(b)是探针(10μM)在斑马鱼中对外源性汞离子的荧光显微成像；
图7(a)是探针(5μM)在纯水中不同汞离子浓度通过肉眼观察的比色效果图；
图7(b)探针(0.3μM)在纯水中对汞离子(0.3μM)产生的丁达尔效应的图像。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行、清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，不应该用来限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1式(Ⅳ)化合物的合成
合成路线如下：
Figure BDA0003120360110000071
具体操作步骤如下：
实施方案1：将巴比妥酸(192mg，1.5mmol)与4-二甲氨基肉桂醛(175mg，1mmol)以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml无水乙醇，常温条件下反应12小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅳ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到紫色的纯净的式(Ⅳ)化合物210mg，产率为73.7％。
实施方案2：将巴比妥酸(128mg，1mmol)与4-二甲氨基肉桂醛(263mg，1.5mmol)以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml无水乙醇，常温条件下反应12小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅳ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到紫色的纯净的式(Ⅳ)化合物255mg，产率为89.5％。
实施方案3：将巴比妥酸(128mg，1mmol)与4-二甲氨基肉桂醛(350mg，2mmol)以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于20ml无水乙醇，常温条件下反应12小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅳ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到紫色的纯净的式(Ⅳ)化合物243mg，产率为85.3％。
实施方案4：将巴比妥酸(128mg，1mmol)与4-二甲氨基肉桂醛(175mg，1mmol)以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于15ml无水乙醇，常温条件下反应12小时，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅳ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到紫色的纯净的式(Ⅳ)化合物263mg，产率为92.3％。
实施方案5：将巴比妥酸(128mg，1mmol)与4-二甲氨基肉桂醛(175mg，1mmol)以及无水哌嗪(129mg,1.5mmol)溶于20ml无水乙醇，常温条件下反应12小时反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅳ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，得到紫色的纯净的式(Ⅳ)化合物248mg，产率为87％。
实施例2测试荧光探针加入汞离子前后的吸光光谱
配制两个5mL的测试体系，标号为A和B。测试体系B作为对照组，不进行任何操作。在测试体系A中加入探针(5μM)后，用紫外吸收光谱仪进行测定，然后加入汞离子(5μM)，用紫外吸收光谱仪进行测定。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且吸收光谱测试是在25℃下测得的，测试结果如图1所示。
从图1可以清晰的看出，当汞离子(5μM)加入后，探针的吸收峰发生明显的变化。
实施例3：测试荧光探针的时间动力学
配制一个探针浓度为5μM的10mL的测试体系，然后将5μM的汞离子加入到测试体系中，摇晃均匀后立即用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图2所示。
由图2可以清楚地看到，当汞离子加入后，荧光强度瞬间达到最小值并保持不变，这说明该探针与汞离子反应迅速，能够为汞离子的测定提供快速的分析方法。
实施例4：测试荧光探针对于汞离子的浓度梯度
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同浓度的汞离子(0-4μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图3(a)和图3(b)所示。
从图3(a)可以清晰的看出，随着汞离子浓度的增加，620nm处的荧光强度逐渐降低。并且，由图3(b)可以看出探针(5μM)加入汞离子(0-1.5μM)之后，其620nm处的荧光强度的与汞离子浓度之间呈现了良好的线性关系，这证明借助于该荧光探针能够对汞离子进行定量分析。
实施例5：测试荧光探针的选择性
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、镉离子、银离子、铜离子、铝离子、钾离子、镍离子、铅离子、锌离子、钙离子、二价铁离子、铬离子、锰离子、钠离子、镁离子、钴离子、三价铁离子、汞离子；除汞离子为5μM外，其他分析物浓度均为25μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图4(a)所示。
从图4(a)可以清晰的看出，只有汞离子加入的时候才能引起探针荧光强度的强烈变化，而其他分析物的影响几乎可以忽略不计。实验证明，该探针对汞离子具有较高的选择性，有利于对汞离子的检测分析。
实施例6：测试荧光探针的抗干扰能力
配置多个探针浓度为5μM的平行样品于10mL比色管中，然后将不同的分析物(分析物分别是空白、镉离子、银离子、铜离子、铝离子、钾离子、镍离子、铅离子、锌离子、钙离子、二价铁离子、铬离子、锰离子、钠离子、镁离子、钴离子、三价铁离子、空白；除空白外，分析物浓度均为25μM)加入到测试体系中，摇晃均匀后，除了第一个空白组外，其他组分别加入汞离子(浓度为5μM)，摇晃均匀后，用荧光光谱仪测试其荧光强度变化。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且荧光光谱是在25℃下测得的，测试结果如图4(b)所示。
从图4(b)可以清晰的看出，其他金属离子加入对荧光探针检测汞离子几乎没有干扰，实验证明，该探针对汞离子具有较高的抗干扰能力，有利于对汞离子的检测分析。
实施例7荧光探针可逆检测测试
配制一个5mL的测试体系，在测试体系中加入探针(5μM)后，然后加入汞离子(5μM)，摇晃均匀后测荧光强度，再在该测试体系中加入10μM碘化钾，摇晃均匀后测荧光强度。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，且吸收光谱测试是在25℃下测得的，测试结果如图5所示。
从图5可以清晰的看出，当加入碘化钾后，荧光恢复明显，说明该探针可以可逆地检测汞离子。
实施例8:荧光探针对HeLa细胞和斑马鱼细胞中外源性汞离子的荧光显微成像
将HeLa细胞分成三组，A组作为空白对照组，B组用探针(10μM)孵育30min；C组先用探针(10μM)孵育30min，再加汞离子(20μM)孵育30min。
最后对三组细胞分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图6(a)所示。
将斑马鱼细胞分成三组，A组作为空白对照组，B组用探针(10μM)孵育30min；C组先用探针(10μM)孵育30min，再加汞离子(20μM)孵育30min。
最后对三组细胞分别进行共聚焦显微成像，测试结果如图6(b)所示。
从图6(a)可以看出，该探针可以检测HeLa细胞中外源性的汞离子；从图6(b)可以看出，该探针可以检测斑马鱼细胞中外源性的汞离子；实验证明，该探针可以应用于生物样品中的汞离子检测。
实施例9：荧光探针裸眼检测测试
配制一组5mL的测试体系，在测试体系中加入探针(5μM)后，然后分别加入不同浓度汞离子(0μM；5μM；10μM；20μM)，摇晃均匀后进行拍照。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，拍照照片如图7(a)所示。
配制一个探针浓度为0.3μM的测试体系，在测试体系中加入汞离子(0.3μM)后，摇晃均匀后，用红色激光照射，并进行拍照。上述测定是在HEPES缓冲溶液(5mMHEPES,pH7.4)体系中进行的，所使用的探针是实施例1中所制备的探针，拍照照片如图7(b)所示。
从图7(a)可以看出，该探针对汞离子的检测可以通过肉眼观察到，从图7(b)可以看出，在只加探针的体系中，丁达尔效应不明显，仅有一个较弱的光束，当加入识别物汞离子之后，探针与汞离子作用发生聚集，使丁达尔效应增强，可以看到更加明显的光束，因此该探针能通过丁达尔效应超灵敏的观察到加入汞离子之后的变化，实现了多种通道检测汞离子；并且这种操作是在纯水中完成的，表明该探针可实现对实际水样的裸眼检测。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003120360100000011
其中：R1，R2，R3，R4，R5和R6为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5和R6可以相同或不同。
2.按照权利要求1的化合物，其中R1，R2，R3，R4，R5和R6均为氢原子。
3.一种制备权利要求1或2所述化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：使式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物反应制备得式(Ⅰ)化合物，其反应式分别如下：
Figure FDA0003120360100000012
其中：R1，R2，R3，R4，R5和R6为独立地选自由氢原子、直链或支链烷基、直链或支链烷氧基、磺酸基、酯基和羧基组成的组；且其中的R1，R2，R3，R4，R5和R6可以相同或不同。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将式(Ⅱ)化合物与式(Ⅲ)化合物以及无水哌嗪溶于无水乙醇，常温反应，反应结束后，减压抽滤得到固体，从而获得含有式(Ⅰ)化合物的粗产物。将粗产品用二氯甲烷溶解去除可溶性杂质，可得到纯净的式(Ⅰ)化合物。
5.一种用于测量、检测或筛选汞离子的荧光探针组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述化合物。
6.如权利要求5所述的荧光探针组合物，所述化合物是：
Figure FDA0003120360100000021
7.如权利要求5或6所述荧光探针组合物，其特征在于，所述荧光探针组合物进一步包含溶剂、酸、碱、缓冲溶液或其组合。
8.一种用于检测样品中汞离子的存在或测定样品中的汞离子含量的方法，其包括：
a)使权利要求1-2中任一项的化合物与样品接触以形成荧光化合物；
b)测定所述荧光化合物的荧光性质，或通过比色来裸眼检测，或通过丁达尔效应来裸眼检测。
9.如权利要求8所述方法，所述样品是化学样品或生物样品。
10.权利要求1-2任一项所述化合物在细胞荧光成像的应用。
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