CN115745899B - 一种汞（ⅱ）荧光探针、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种汞（Ⅱ）荧光探针、制备方法及其应用，该探针的分子式为：C34H23N3O2S；该探针对汞（Ⅱ）表现出很强的敏感性，具有较低的检测限，具有良好的时间稳定性；对汞（Ⅱ）有很好的响应；对汞（Ⅱ）具有高选择性，探针在复杂的环境下能够实现对汞（Ⅱ）的检测；本发明探针在细胞成像实验中，细胞毒性低，能准确定位细胞，可对HeLa细胞，斑马鱼和烟草幼苗中汞（Ⅱ）有良好的成像效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种汞（Ⅱ）荧光探针的制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
汞（Hg）是一种公认的毒性最强的重金属之一，它不仅危害生态环境，而且也威胁人类的身心健康。多年以来，汞排放的重要原因主要来自人为来源，尤其是矿石开采、化石燃烧、垃圾焚烧。汞（Ⅱ）污染往往具有极长的滞留时间，主要存在水和土壤中，通过食用进入人类生活区，最终在人类的体内富集，且很难排除体外，对人类的身体健康产生巨大威胁。例如通过饮用受污染的水源，吸入受污染的空气、食用含有汞的农副产品和鱼类海鲜，吸入或渗入人体的汞（Ⅱ）会与酶和蛋白质中的巯基结合，导致细胞损害，对人类的人脑、神经系统、肾功能产生很大威胁，尤其会对婴幼儿的神经功能产生严重的损害。因此，开发一种新型检测汞（Ⅱ）的荧光探针是非常必要的。
汞（Ⅱ）检测的传统技术有很多，例如原子吸收光谱法、X射线吸收光谱学、电感耦合等离子体发射光谱等，但是这些方法仪器昂贵、操作专业、制样过程复杂，此外无法实现实时原位监测。相比之下荧光探针因其在低成本、高灵敏度、样品用量少、高选择性等优势，被认为是一种强大的分析工具。在过去的几十年里，已经报道了很多对汞具有良好测定效果的荧光探针。但是基于三嗪染料为电子受体的荧光探针未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种汞（Ⅱ）荧光探针、制备方法及其应用，采用三嗪染料作为荧光团，该探针对汞（Ⅱ）表现出很强的敏感性，具有较低的检测限，具有良好的细胞相容性，对汞（Ⅱ）有很好的响应；在细胞成像实验中，细胞毒性低，能准确定位细胞，可对HeLa细胞，斑马鱼以及烟草茎中汞（Ⅱ）有良好的成像效果。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种汞（Ⅱ）荧光探针，该探针的分子式为：C34H23N3O2S。
该探针的化学式结构如下：
；
所述汞（Ⅱ）荧光探针的制备方法，按照以下步骤进行：将化合物TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯溶解在二氯甲烷中，缓慢滴加三乙胺，并在室温下搅拌23-25小时，得到汞（Ⅱ）荧光探针。
所述化合物TzAr-Nap-OH的化学结构式为：
；
所述TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯的摩尔比为1:1.1-1.3；所述TzAr-Nap-OH和二氯甲烷的质量体积比为31-33 mg：1mL；所述TzAr-Nap-OH和三乙胺的摩尔比为1:1.8-2.2。
所述的汞（Ⅱ）荧光探针的应用，该荧光探针应用于生物细胞体系中汞（Ⅱ）的传感检测。
所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像检测。
探针TzAr-Nap-Hg的合成路线如下：
；
本发明采用上述技术方案，具有以下有益效果：
（1）探针的合成步骤简单，原料来源广泛；
（2）该探针对汞（Ⅱ）表现出很强的敏感性，具有较低的检测限，最低检测限为0.731μΜ；具有良好的时间稳定性；对汞（Ⅱ）有很好的响应；对汞（Ⅱ）具有高选择性，探针在复杂的环境下能够实现对汞（Ⅱ）的检测；1mol的探针最高可以检测10mol的Hg2+。
（3）本发明探针在细胞成像实验中，细胞毒性低，能准确定位细胞，可对HeLa细胞，斑马鱼和烟草幼苗中汞（Ⅱ）有良好的成像效果。
附图说明
图1 探针TzAr-Nap-Hg的1H NMR图谱；
图2 探针TzAr-Nap-Hg的13C NMR图谱；
图3 探针TzAr-Nap-Hg滴加Hg2+前后的紫外吸收图谱；
图4 探针TzAr-Nap-Hg滴定Hg2+后的荧光发射图谱；
图5 探针TzAr-Nap-Hg滴定Hg2+后的线性关系图；
图6 探针TzAr-Nap-Hg在不同pH下的荧光发射光谱图；
图7为探针TzAr-Nap-Hg加入汞后随时间变化的荧光发射光谱图；
图8 为探针TzAr-Nap-Hg加入汞后的时间和荧光强度的相关性图谱；
图9 探针TzAr-Nap-Hg离子选择性的荧光发射图谱；
1–Fe3+；2–Na+；3–HCO3 -；4–H2O2； 5–Ca2+； 6–Mg2+； 7–Cu2+；8–Al3+；9–Fe2+；10–Cys ；11–Arg；12–HClO；13–NO2-；14–O2-；15–Hg2+；
图10 探针TzAr-Nap-Hg对HeLa细胞活力的影响；
图11 探针TzAr-Nap-Hg的细胞成像图；
图12 探针TzAr-Nap-Hg的斑马鱼成像图；
图13 探针TzAr-Nap-Hg的烟草茎成像图；
其中a）为探针TzAr-Nap-Hg对具有不同浓度Hg(II)的烟草幼苗的茎段进行荧光成像图；
b)为图13 a）中绿色通道的荧光强度的柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，TzAr-Nap-Hg代表汞（Ⅱ）荧光探针。
实施例中采用的HEPES缓冲溶液，浓度为10 mM， pH为7.4。
实施例1探针TzAr-Nap-Hg的合成路线如下：
将化合物TzAr-Nap-OH(80.0 mg, 0.2 mmol)和硫代氯甲酸苯酯(41.6 mg, 0.24mmol)溶解在二氯甲烷(2.5 mL)中，逐滴加入三乙胺(40.0 mg, 0.4mmol)，并在室温下搅拌24小时。反应结束后，粗品经硅胶柱层析（石油醚/乙酸乙酯，v/v=10/1）纯化，得到白色固体TzAr-Nap-Hg（72.6 mg, 67.7%）1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.74 (d,J= 7.0 Hz, 4H),8.57 (d,J= 15.9 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.02 – 7.87 (m, 3H), 7.69 (s, 1H),7.59 (dd,J= 16.3, 8.8 Hz, 6H), 7.50 (dd,J= 15.1, 6.8 Hz, 3H), 7.42 (d,J= 8.7Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.28 (s, 1H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 194.71, 171.44,171.26, 153.56, 151.90,141.92, 135.77, 134.47, 133.47, 132.72, 131.92,130.34, 129.76, 129.73, 129.06, 128.71, 128.66, 126.93, 126.72, 124.96,121.93, 121.81, 119.16. HRMS (ESI):calcd for C34H23N3O2S [M+H]+538.1584,found 538.1581.
探针的1H NMR图谱见图1，13C NMR图谱见图2。
探针TzAr-Nap-Hg的分子式为：C34H23N3O2S。
实施例2
取荧光探针TzAr-Nap-Hg溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制成1mM的储备液。从荧光探针储备液中取出20 μL，滴加到含有25%的DMF的HEPES缓冲液（10 mM, pH=7.4）中，最终体积为2 mL，测量了探针的紫外吸收光谱；加入Hg2+（10 eq.）后再次测量了探针的紫外吸收光谱，如图3所示。TzAr-Nap-Hg的最大吸收峰从350 nm处红移至375 nm处，初步表明该探针在Hg2+的作用下生成了TzAr-Nap-OH，可以对Hg2+进行检测。
实施例3
从荧光探针储备液中取出20μL，滴加到1980μL含有25%(体积比)的DMF的HEPES缓冲溶液（10 mM, pH=7.4）中，然后滴加硝酸汞溶液（Hg2+相对于探针的摩尔当量为1.0-10.0eq.），测量探针的荧光发射光谱（λex= 375 nm）。如图4所示，随着Hg2+的加入荧光在470 nm处的荧光强度逐渐增强，当硝酸汞溶液的量加入到Hg2+相对于探针的摩尔当量为10.0 eq时，荧光强度趋于稳定（1mol的探针最高可以检测10mol的Hg2+）。如图5所示，探针TzAr-Nap-Hg最低检测限为0.731μΜ。
实施例4
从荧光探针储备液中取出20 μL，滴加到H2O/DMF=3/1（体积比为3:1）体系中，最终体积为2 mL；同样的方法共配制8份混合液，然后分别调pH为
3.1；4.1；5.1；6.1；7.4；8.1；9.1；10.1；测量了不同pH对探针的影响。
然后测量了在滴加硝酸汞溶液后（滴加硝酸汞溶液后所得的混合液中，汞离子和探针的摩尔比为10:1）不同pH的影响，如图6所示。
图6是检测的是荧光发射光谱，激发波长λex=375nm
纵坐标是最大发射波长470 nm处对应的荧光强度。
实施例5
从荧光探针储备液中取出20 μL，滴加到1980μL含有25%（体积比）的DMF的HEPES缓冲溶液（10 mM, pH=7.4）中，再加入硝酸汞溶液（Hg2+相对于探针的摩尔当量为10 eq.），测量其随着时间变化的荧光谱图（激发波长375nm）；
如图7、8所示。当加入汞（Ⅱ）后，TzAr-Nap-Hg在最大发射峰处的荧光强度会随着时间逐渐增强，在最初阶段荧光强度迅速增加，往后荧光强度增加缓慢，最终在80min左右荧光强度会达到最大值（最大值286），最终趋向于稳定。这一现象表明TzAr-Nap-Hg具有良好的稳定性。
实施例6
从荧光探针储备液中取出20 μL，滴加到1.960mL含有25%（体积比）的DMF的HEPES缓冲溶液（10 mM, pH=7.4），再滴加20μL 的100 μM（终浓度）的各种离子溶液，最终体积为2.0 mL，测量了各种离子对TzAr-Nap-Hg荧光强度的影响，如图9所示。研究发现当加汞（Ⅱ）后，荧光强度强度会明显增强。但是加入其他离子后，荧光几乎不变。这一现象说明TzAr-Nap-Hg对汞（Ⅱ）具有高选择性，同时说明探针在复杂的环境下能够实现对汞（Ⅱ）的检测。
实施例7
对TzAr-Nap-Hg做了细胞毒性实验，采用标准的MTT比色法检测探针TzAr-Nap-Hg在体外对HeLa细胞的细胞毒性。首先，将2×105个细胞/mL的细胞接种在96孔板中，然后用不同浓度的TzAr-Nap-Hg (0、2、5、10、15、20和25 μM，终浓度)处理24小时。随后，向每个孔中加入10 μL MTT (5 mg/mL，终浓度)并再孵育3小时。最后，除去培养基，加入100μL DMSO以溶解甲瓒晶体。将平板轻微摇动约10分钟，用酶标仪测量570 nm处的吸光度。如图10所示。TzAr-Nap-Hg在HeLa细胞中的MTT分析显示存活率超过80%，表明该探针可作为复杂生物环境中Hg（Ⅱ）标记的实用工具。
图10中，HeLa细胞在 0、2、5、10、15、20、25 μM（终浓度）TzAr-Nap-Hg 中，细胞存活率分别为100%，98%，97%，95%，93%，92%，90%。
实施例8
TzAr-Nap-Hg对汞（Ⅱ）响应的细胞成像，如图11所示。具体操作如下将HeLa细胞（共孵育液中细胞密度为1×104个细胞/mL）与Hg2+(100 μM，终浓度)孵育0.5 h，然后用无菌PBS缓冲液洗去HeLa细胞表面的汞离子残留物。然后将HeLa细胞（共孵育液中，细胞浓度为1×104个细胞/mL）与TzAr-Nap-Hg (10μM，终浓度)一起孵育1.5小时。最后，用无菌PBS缓冲液洗涤HeLa细胞三次，并用共聚焦显微镜成像。空白组只用探针处理HeLa细胞，HeLa细胞不用汞离子处理。(a，d)明场；(b，e)绿色通道，λex= 405 nm，λem= 450-500nm；(c，f)合并明场和绿色通道。
我们选取两组细胞进行对比实验，当与探针共同孵育海拉细胞加入汞离子后，荧光强度会有明显的增强。而只与探针共同孵育HeLa细胞在共聚焦显微镜下只有微弱的荧光。这一现象说明探针能够在复杂的生理环境下，对HeLa细胞内的汞（Ⅱ）进行成像，表明探针能够检测海拉细胞内的汞（Ⅱ）。
实施例9
TzAr-Nap-Hg对汞（Ⅱ）响应的斑马鱼成像，将活斑马鱼与Hg2+(200 μM)孵育1小时，然后用蒸馏水洗掉斑马鱼表面的汞离子残留物。然后将活斑马鱼与探针TzAr-Nap-Hg溶液一起孵育1.5小时。最后，用蒸馏水洗涤斑马鱼表面上残留的荧光探针三次，并通过共聚焦显微镜成像。对照组没有用汞离子处理斑马鱼。如图12所示，(a，d)明场；(b，e)绿色通道，λex= 405 nm，λem= 450-500 nm；(c，f)合并明场和绿色通道。
如图12所示，加入汞离子的斑马鱼荧光明显增强，主要集中在斑马鱼的眼睛以及腹部，而未加入汞（Ⅱ）的斑马鱼几乎没有荧光。表明探针可以检测脊椎动物体内汞（Ⅱ）。
实施例10
首先将五叶大小的烟草幼苗在营养液中培养3天，然后在含有不同浓度Hg2+(0、1、5、10、20、40 μM)的营养液中培养3天，并用蒸馏水洗涤整个根3次。最后，用含有TzAr-Nap-Hg (10μM)蒸馏水培养24小时。将烟草幼茎切片，然后用共聚焦显微镜成像。如图13所示，在没有Hg(II)的烟草幼苗的茎段中，在绿色通道中有微弱的荧光，荧光强度随着Hg(II)浓度的增加而逐渐增强。表明探针能够检测烟草幼苗体内的汞（Ⅱ）。a)通过探针TzAr-Nap-Hg对具有不同浓度Hg(II)的烟草幼苗的茎段进行荧光成像；b)图13a)中绿色通道的荧光强度。λex = 405 nm，λem = 450-500 nm。
本发明汞（Ⅱ）荧光探针可以应用于复杂生物体细胞中汞（Ⅱ）的检测；可以对活体斑马鱼及烟草幼苗进行成像。
Claims (5)
1.一种汞（Ⅱ）荧光探针，其特征在于：该探针的分子式为：C34H23N3O2S；
该探针的结构如下：
。
2.权利要求1所述汞（Ⅱ）荧光探针的制备方法，其特征在于：按照以下步骤进行：将化合物TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯溶解在二氯甲烷中，缓慢滴加三乙胺，并在室温下搅拌23-25小时，得到汞（Ⅱ）荧光探针；
所述化合物TzAr-Nap-OH的化学结构式为：
。
3.根据权利要求2所述汞（Ⅱ）荧光探针的制备方法，其特征在于：所述TzAr-Nap-OH和硫代氯甲酸苯酯的摩尔比为1:1.1-1.3；所述TzAr-Nap-OH和二氯甲烷的质量体积比为31-33mg：1mL；所述TzAr-Nap-OH和三乙胺的摩尔比为1:1.8-2.2。
4.权利要求1所述汞（Ⅱ）荧光探针在制备生物细胞体系中汞（Ⅱ）的传感检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的传感检测包含荧光检测和细胞成像检测。
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