CN111334291B - 一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111334291B
CN111334291B CN202010212542.0A CN202010212542A CN111334291B CN 111334291 B CN111334291 B CN 111334291B CN 202010212542 A CN202010212542 A CN 202010212542A CN 111334291 B CN111334291 B CN 111334291B
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
probe
formula
aggregation
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010212542.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111334291A (zh
Inventor
申静
鲍萍萍
李聪
张海峰
章经天
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TIANJIN STOMATOLOGICAL HOSPITAL
Original Assignee
TIANJIN STOMATOLOGICAL HOSPITAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TIANJIN STOMATOLOGICAL HOSPITAL filed Critical TIANJIN STOMATOLOGICAL HOSPITAL
Priority to CN202010212542.0A priority Critical patent/CN111334291B/zh
Publication of CN111334291A publication Critical patent/CN111334291A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111334291B publication Critical patent/CN111334291B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6402—Atomic fluorescence; Laser induced fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1059—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing three nitrogen atoms as heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用，属于细菌检测技术领域。本发明提供的聚集诱导发光荧光开启探针中含有可特异性结合革兰氏阴性菌(G‑菌)的多粘菌素B(Polymyxin B)片段，Polymyxin B可以与革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分LPS特异性结合，在可见光照射下能够发出强烈荧光，从而可以实现定性的特异性检测G‑菌，还可以作为光动力疗法的光敏剂，白光照射后产生活性氧物质(ROS)，从而实现选择性杀死G‑细菌。

Description

一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细菌检测技术领域，尤其涉及一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用。
背景技术
细菌微生物的研究方法主要包括分离培养和显微观察两方面。细菌培养是传统的细菌鉴定方法，但耗时长、特异性低，并且很多细菌型尚无法培养。随着分子生物学的发展，聚合酶链反应被用于根管细菌的检测及定量分析，相对于细胞培养，特异性高、敏感性强、速度快，但易将己调亡的细菌也包括在内，增加了细菌活菌检测的假阳性。逆转录聚合酶链反应检测RNA的方法相对PCR能更准确评价活性状态细菌，但是操作步骤复杂，易受操作者技术影响。高通量测序技术(High-Throughput Sequencing，HTS)以高输出量与高解析度为特性，可实现根管微生物鉴定更大的测序深度，促进了对不可培养微生物以及痕量菌的研究，但是存在海量数据分析难和数据去伪存真难的问题。扫描电子显微镜分辨率高，能直观显示根管表面细菌的形态与分布，还可利用图像分析软件对细菌进行定量分析，但是样本观察前繁杂的处理过程会影响细菌生物膜形态结构。近年来，应用LIVE/DEAD荧光探针(多为SYTO9/PI)染色结合共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)逐渐成为观察根管细菌生物膜的主流研究方法，它可以实现对细菌生物膜的三维定量分析，直观显示细菌活死状态，对于牙本质小管内细菌的观察分析更是其突出优势。
以上技术虽各具优势，但无一不复杂繁琐、对操作者技术要求高、花费时间长。目前尚缺乏一种简单、快速、准确且灵敏度高的细菌检测方法，因此研究一种可以特异性区分革兰氏阳性/阴性(G+/G-)菌的检测方法具有重要意义。
近年来，荧光开启(turn-on)探针用于生物活性分子的检测吸引了研究者们的极大关注。这些探针含有淬灭基团，通常在水溶液中不发光或荧光强度很弱(off状态)，只有当它们遇到所需检测的生物分子并与之相互作用后，探针的荧光才会显现(turn-on)，因此具有高特异性、高信噪比以及低伪阳性信号的优点。但是，这些探针的制备工艺复杂，生产成本较高，使其应用受到一定限制，目前已有的荧光turn-on探针中，仅很少一部分可用于实时检测活有机体中的生物活性分子。
最近，基于“聚集诱导发光”(Aggregation-Induced Emission，AIE)染料的荧光turn-on探针被开发。AIE分子是一类在聚集状态下表现出发光增强的发光材料，如四苯基乙烯等，其检测生物分子的机理是AIE分子内旋转单元的旋转受到限制，导致荧光开启。相比于含有淬灭基团的荧光turn-on探针，AIE荧光turn-on探针合成更为简单经济，荧光开启的比率更高，并且可以在活细胞中检测生物分子。但是，现有技术中AIE荧光turn-on探针并不能用于特异性检测或特异性杀伤G-菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚集诱导发光荧光开启探针，本发明提供的具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针可以特异性检测G-菌，还可以特异性杀伤G-菌。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种聚集诱导发光荧光开启探针，具有式I所示结构：
Figure BDA0002423310670000021
式I中R具有式II所示结构：
Figure BDA0002423310670000031
本发明提供了上述技术方案所述聚集诱导发光荧光开启探针的制备方法，包括以下步骤：
将化合物A与二甲基亚砜混合，调节所得体系的pH值为7～8，得到化合物A的二甲基亚砜溶液；将所述化合物A的二甲基亚砜溶液、化合物B、硫酸铜、抗坏血酸钠、四氢呋喃和水混合后进行点击反应，得到化合物C；
将R-H与N,N-二甲基甲酰胺混合，调节所得体系的pH值为7，得到R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液；将所述R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液与化合物C混合后进行迈克尔加成反应，得到具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针；
其中，R-H中R具有式II所示结构，化合物A、化合物B和化合物C分别具有式A、式B和式C所示结构：
Figure BDA0002423310670000032
Figure BDA0002423310670000041
优选地，所述化合物A和二甲基亚砜的用量比为15～35μmol：1mL；
所述化合物A和化合物B的摩尔比为15～35：6；
所述二甲基亚砜、四氢呋喃和水的体积比为10：2～3：2。
优选地，所述点击反应的温度为室温，时间为20～28h。
优选地，所述R-H和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为7～10μmol：1mL；
所述R-H和化合物C的摩尔比为7～10：2～3。
优选地，所述迈克尔加成反应的温度为室温，时间为20～28h。
优选地，调节化合物A与二甲基亚砜混合后所得体系pH值的试剂为N,N-二异丙基乙胺；
调节R-H与N,N-二甲基甲酰胺混合后所得体系pH值的试剂为N,N-二异丙基乙胺或三乙胺。
优选地，所述点击反应和迈克尔加成反应后还独立的包括高效液相色谱分离纯化。
本发明提供了上述技术方案所述具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针在制备特异性检测革兰氏阴性菌的检测试剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针在制备特异性杀伤革兰氏阴性菌的药剂中的应用。
本发明提供了一种具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针。本发明提供的探针中含有可特异性结合革兰氏阴性菌(G-菌)的多粘菌素B(PolymyxinB)片段，PolymyxinB可以与革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分LPS特异性结合，在可见光照射下能够发出强烈荧光，从而可以实现定性的特异性检测G-菌，还可以作为光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)的光敏剂，白光照射后产生活性氧物质(reactive oxygenspecies，ROS)，从而实现选择性杀死G-细菌。
附图说明
图1为实施例1步骤(1)所得产物的LC图；
图2为实施例1步骤(1)所得产物的MS图；
图3为实施例1步骤(2)所得产物的LC图；
图4为实施例1步骤(2)所得产物的MS图；
图5为探针AIE-DCM-2Polymyxin B在工作液中的吸收光谱图以及AIE-DCM和探针AIE-DCM-2PolymyxinB的荧光发射光谱图；
图6为probe组和probe+E.coli组的荧光发射光谱图；
图7为不同菌液经浓度为20μmol/L的探针AIE-DCM-2Polymyxin B于37℃、黑暗环境下孵育30s的效果图；
图8为不同菌液经浓度为20μmol/L的探针AIE-DCM-2Polymyxin B于37℃、黑暗环境下孵育30s后的CLSM图像，标尺为20μm；
图9为0.861W/cm2白光照射条件下，浓度为20μmol/L的探针AIE-DCM-2PolymyxinB在不同情况下，ABDA吸收光谱随光照时间变化情况图以及ABDA的分解速率图；
图10为不同菌液在加探针AIE-DCM-2Polymyxin B/不加探针AIE-DCM-2PolymyxinB以及白光照射/非白光照射情况下的效果图；
图11为平板计数后的结果统计图。
具体实施方式
本发明提供了一种聚集诱导发光荧光开启探针，具有式I所示结构：
Figure BDA0002423310670000061
式I中R具有式II所示结构：
Figure BDA0002423310670000062
本发明提供的具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针可以特异性检测G-菌，还可以特异性杀伤G-菌。
本发明提供了上述技术方案所述聚集诱导发光荧光开启探针的制备方法，包括以下步骤：
将化合物A与二甲基亚砜混合，调节所得体系的pH值为7～8，得到化合物A的二甲基亚砜溶液；将所述化合物A的二甲基亚砜溶液、化合物B、硫酸铜、抗坏血酸钠、四氢呋喃和水混合后进行点击反应，得到化合物C；
将R-H与N,N-二甲基甲酰胺混合，调节所得体系的pH值为7，得到R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液；将所述R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液与化合物C混合后进行迈克尔加成反应，得到具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针；
其中，化合物A、化合物B和化合物C分别具有式A、式B和式C所示结构：
Figure BDA0002423310670000071
本发明将化合物A与二甲基亚砜混合，调节所得体系的pH值为7～8，得到化合物A的二甲基亚砜溶液；将所述化合物A的二甲基亚砜溶液、化合物B、硫酸铜、抗坏血酸钠、四氢呋喃和水混合后进行点击反应，得到化合物C。在本发明中，所述化合物A的化学名称为马来酰亚胺己酰炔丙基甘氨酸，缩写为Mal-Pra，具体结构式如式A所示；化合物B为AIE小分子化合物(TPE-Ph-DCM-2N3)，简写为AIE-DCM，具体结构式如式B所示。本发明对所述化合物A和化合物B的来源不作特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售商品或本领域技术人员熟知的方法制备得到均可。
本发明将化合物A与二甲基亚砜混合，调节所得体系的pH值为7～8，得到化合物A的二甲基亚砜溶液；调节pH值采用的试剂优选为N,N-二异丙基乙胺。在本发明中，所述化合物A和二甲基亚砜的用量比优选为15～35μmol：1mL，更优选为32.6μmol：1mL。
得到化合物A的二甲基亚砜溶液后，本发明将所述化合物A的二甲基亚砜溶液、化合物B、硫酸铜、抗坏血酸钠、四氢呋喃和水混合后进行点击反应，得到化合物C。在本发明中，所述化合物A和化合物B的摩尔比优选为15～35：6，更优选为32.6：6。
在本发明中，所述硫酸铜和抗坏血酸钠作为催化剂，本发明对所述催化剂的用量没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的催化剂用量即可；所述二甲基亚砜、四氢呋喃和水作为溶剂，二甲基亚砜、四氢呋喃和水的体积比优选为10：2～3：2，更优选为10：3：2。
本发明优选将化合物B溶于四氢呋喃中，得到化合物B的四氢呋喃溶液；将硫酸铜溶解于部分水中，得到硫酸铜溶液；将抗坏血酸钠溶于剩余水中，得到抗坏血酸钠溶液；将所述化合物A的二甲基亚砜溶液、化合物B的四氢呋喃溶液、硫酸铜溶液和抗坏血酸钠溶液混合(各组分满足上述配比即可)，之后进行点击反应。
本发明将化合物A的二甲基亚砜溶液的pH值控制在7～8，且各组分在上述配比范围内，能够为点击反应提供合适的反应环境，同时采用上述混合顺序，有利于保证点击反应顺利进行。
在本发明中，所述点击反应的温度优选为室温，即不需要额外的加热或降温，在本发明的实施例中，室温具体为25℃；所述点击反应的时间优选为20～28h，更优选为24h。
完成所述点击反应后，本发明优选还包括将所得点击反应产物体系进行高效液相色谱分离纯化，得到化合物C。本发明优选将所述点击反应产物体系过0.45μm有机滤膜，之后利用高效液相色谱仪进行分离纯化，所述分离纯化的条件优选包括：
采用C18反向色谱柱，柱温为50℃；流动相A液：水+甲醇+三氟乙酸(TFA)，其中，水与甲醇的体积比为19：1，三氟乙酸占流动相A液总体积的0.05％；流动相B液：甲醇+三氟乙酸，其中，三氟乙酸占流动相B液总体积的0.05％；流动相流速为8mL/min，采用梯度洗脱方式，具体洗脱梯度见表1。
表1利用高效液相色谱仪对点击反应产物体系进行分离纯化的洗脱梯度
Figure BDA0002423310670000081
Figure BDA0002423310670000091
所述分离纯化完成(待反应产物出峰)后，本发明优选收集对应的流动相，在避光条件下利用空气泵吹去收集到的流动相中的甲醇，得到化合物C，简写为AIE-DCM-2Mal，具体结构式如式C所示。
本发明将R-H与N,N-二甲基甲酰胺混合，调节所得体系的pH值为7，得到R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液；调节pH值采用的试剂优选为N,N-二异丙基乙胺或三乙胺，更优选为三乙胺。在本发明中，所述R-H和N,N-二甲基甲酰胺的用量比优选为7～10μmol：1mL，更优选为7.2μmol：1mL。
本发明将R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液的pH值调节到7，可以为迈克尔加成反应提供合适的反应环境。在本发明中，所述R-H为带巯基的可特异性结合革兰氏阴性菌的多粘菌素B(PolymyxinB)片段，简写为Polymyxin B-SH；所述R-H中的R具体结构如式II所示。本发明对所述R-H的来源不作特殊限定，采用本领域技术人员熟知的市售商品或本领域技术人员熟知的方法制备得到均可。
得到R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液和化合物C后，本发明将所述R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液与化合物C混合后进行迈克尔加成反应，得到具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针。本发明对配制R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液以及制备化合物C的先后顺序不作特殊限定。在本发明中，所述R-H和化合物C的摩尔比优选为7～10：2～3，更优选为7.2：2～3。
在本发明中，所述迈克尔加成反应的温度优选为室温，即不需要额外的加热或降温，在本发明的实施例中，室温具体为25℃；所述迈克尔加成反应的时间优选为20～28h，更优选为24h。
完成所述迈克尔加成反应后，本发明优选还包括将所得迈克尔加成反应产物体系进行高效液相色谱分离纯化，得到具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针。本发明优选将迈克尔加成反应产物体系过0.45μm有机滤膜，之后利用高效液相色谱仪进行分离纯化(所述分离纯化的条件优选参照上述对点击反应产物体系进行高效液相色谱分离纯化的条件，在此不再进行赘述)，收集对应的流动相，在避光条件下利用空气泵吹去收集到的流动相中的甲醇，得到剩余物。
得到剩余物后，本发明优选将所述剩余物与盐酸混合，之后将所得体系于-80℃条件下冻结，之后进行冷冻干燥(真空度<10Pa)，得到的黄色固体为具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针，即AIE荧光turn-on探针，简写为AIE-DCM-2Polymyxin B。本发明对提供-80℃条件的设备不作特殊限定，具体可以为冰箱；本发明对所述冷冻干燥采用的设备不作特殊限定，具体可以为真空冻干机。
在本发明中，所述盐酸的浓度优选为1mol/L，所述盐酸的加入量优选以化合物B的物质的量×10为基准，如所述化合物B的物质的量(mol)为n，盐酸的浓度为1mol/L，则所用盐酸的体积(L)为10n。
本发明通过盐酸置换所述剩余物中残余的三氟乙酸(大部分三氟乙酸会在空气泵吹去流动相中甲醇的过程中挥发)，使其在冷冻干燥过程中随水被彻底去除，以满足生物学要求。
在本发明中，具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针的合成路线如式1所示：
Figure BDA0002423310670000111
其中，式1中R的结构式为
Figure BDA0002423310670000112
本发明以AIE-DCM与Mal-Pra为起始原料经过点击反应后得到初始反应产物AIE-DCM-2Mal，之后将其与对细菌具有靶向作用的多粘菌素B偶联，形成具有特异性检测并具有杀伤作用的AIE荧光turn-on探针；所述AIE荧光turn-on探针可以特异性检测G-菌，还可以作为光动力疗法的光敏剂，白光照射后产生活性氧物质，从而实现选择性杀死G-细菌。
本发明提供了上述技术方案所述具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针在制备特异性检测革兰氏阴性菌的检测试剂中的应用。
本发明提供了上述技术方案所述具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针在制备特异性杀伤革兰氏阴性菌的药剂中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)称取10mg化合物A(缩写为Mal-Pra，32.6μmol)溶于1mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，并用N,N-二异丙基乙胺(DIEA)将体系pH值调节到7，得到Mal-Pra溶液；称取5mg化合物B(简写为AIE-DCM，6μmol)溶于300μL四氢呋喃(THF)中，将所得AIE-DCM溶液加入Mal-Pra溶液中，得到混合溶液；
称取6.5mg的CuSO4·5H2O溶于1mL超纯水中，得到CuSO4溶液；称取10mg抗坏血酸钠溶于1mL超纯水中，得到抗坏血酸钠溶液；分别取100μL的CuSO4溶液和100μL抗坏血酸钠溶液加入所述混合溶液中，室温(25℃)条件下进行点击反应24h；
点击反应完成后，将所得点击反应产物体系过0.45μm有机滤膜，之后利用高效液相色谱仪进行分离纯化，操作条件包括：采用C18反向色谱柱，柱温为50℃；流动相A液：水+甲醇+三氟乙酸，其中，水与甲醇的体积比为19：1，三氟乙酸占流动相A液总体积的0.05％，流动相B液：甲醇+三氟乙酸，其中，三氟乙酸占流动相B液总体积的0.05％；流动相流速为8mL/min，采用梯度洗脱方式，具体洗脱梯度见表1；分离纯化完成(待反应产物出峰)后，收集对应的流动相，在避光条件下利用空气泵吹去收集到的流动相中的甲醇，得到化合物C(简写为AIE-DCM-2Mal)；
(2)称取8mg的R-H(简写为PolymyxinB-SH，7.2μmol)溶于1mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，使用三乙胺将体系pH值调节到7，之后将所得PolymyxinB-SH溶液与步骤(1)中所得AIE-DCM-2Mal混合，室温(25℃)条件下进行迈克尔加成反应24h；
迈克尔加成反应完成后，按照步骤(1)中方法对所得迈克尔加成反应产物体系进行分离纯化并吹去收集到的流动相中的甲醇，得到剩余物；将所述剩余物与60μL浓度为1mol/L的盐酸混合，之后将所得体系放入-80℃冰箱，冻结后转入真空冻干机进行冷冻干燥(真空度<10Pa)，得到的黄色固体即为AIE荧光turn-on探针(探针AIE-DCM-2PolymyxinB)，产率为81％。
对步骤(1)所得产物进行LCMS分析，结果如图1和图2所示，其中，图1为LC图，图2为MS图；由图1和图2可知，步骤(1)所得产物确实为化合物AIE-DCM-2Mal。
对步骤(2)所得产物进行LCMS分析，结果如图3和图4所示，其中，图3为LC图，图4为MS图；由图3和图4可知，步骤(2)所得产物确实为目标探针，即探针AIE-DCM-2PolymyxinB。
实验例1
微生物检测：
将-80℃条件下保存的革兰氏阳性粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)和革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)分别接种于BHI平板和LB平板中，在37℃条件下倒置过夜培养，之后挑取过夜培养的实验菌株分别接种于BHI和LB液体培养基中，37℃条件下培养16～18h。
首先对探针AIE-DCM-2PolymyxinB在工作液中的吸收光谱进行测定。具体是用DMSO溶解探针AIE-DCM-2Polymyxin B，配成探针浓度为4mM的母液，之后溶于1×PBS缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，配成探针浓度为20μmol/L的工作液(按体积比计，DMSO/PBS＝1/199)；取3mL于石英比色皿中，于紫外分光光度计下测定吸收光谱，每组做3个重复。结果如图5中的A所示，由此可知探针AIE-DCM-2PolymyxinB的最大吸收在439nm左右。
对AIE-DCM和探针AIE-DCM-2Polymyxin B的荧光变化进行测定。具体是用DMSO分别溶解AIE-DCM和探针AIE-DCM-2PolymyxinB，配成浓度为4mM的母液，之后溶于1×PBS缓冲液中，配成浓度为20μmol/L的工作液(按体积比计，DMSO/PBS＝1/199)；取3mL于石英比色皿中，使用Perkin-ElmerLS 55分光光谱仪测定两组荧光变化情况(Ex＝439nm)，每组做3个重复。结果如图5中的B所示，修饰多粘菌素B(Polymyxin B)片段后的荧光探针(AIE-DCM-2PolymyxinB)相比于AIE-DCM分子荧光显著降低，这是由于修饰水溶性的多粘菌素B片段后，探针AIE-DCM-2Polymyxin B水溶性增加，探针分子内运动不再受限，探针分子吸收的光能更多通过热辐射形式耗散，发射出的荧光减弱。AIE-DCM-2Polymyxin B这一初始荧光较弱的特性为其turn-on成像革兰氏阴性菌奠定了基础。
取上述培养16～18h后的菌液(具体为E.coli菌液)，加入LB液体培养基，得到细菌悬液(OD600＝0.5)，取3000μL所述细菌悬液离心(8000rpm，5min)，之后用1×PBS(10mM，pH＝7.4)缓冲液洗涤3次，加入探针AIE-DCM-2PolymyxinB，得到探针浓度为20μmol/L的混合液，在黑暗环境下孵育30s后，取3mL混合液置于石英比色皿中，使用Perkin-Elmer LS 55分光光谱仪测定荧光强度(Ex＝439nm)，并设置不加E.coli菌液的对照组；每组做3个重复。结果如图6所示，由图6可知，与对照组(probe组，即探针组)相比，在E.coli存在条件下，浓度为20μmol/L的探针AIE-DCM-2PolymyxinB在PBS缓冲液中的荧光强度提高了3～4倍，说明探针AIE-DCM-2PolymyxinB可以特异性的与E.coli结合。
对细菌的识别进行研究。以革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为研究对象，以革兰氏阳性粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)和变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)为对照。分别取上述培养16～18h后的菌液(即E.coli菌液、E.faecalis菌液和S.mutans菌液)，加入BHI和LB液体培养基，得到细菌悬液(OD600＝0.5)；分别取300μL所述细菌悬液离心(8000rpm，5min)，之后用1×PBS缓冲液洗涤3次，加入探针AIE-DCM-2PolymyxinB，得到探针浓度为20μmol/L的混合液，在37℃、黑暗环境下孵育30s后，将混合液离心(8000rpm，5min)，结果如图7所示，图7中从左到右依次为：Probe+E.coli组、Probe+E.faecalis组、Probe+S.mutans组。由图7可知，Probe+E.coli组为黄色，而Probe+E.faecalis组和Probe+S.mutans组为白色，表明探针AIE-DCM-2Polymyxin B可以和革兰氏阴性大肠杆菌(E.coli)特异性结合。
用荧光成像技术对细菌的识别进行研究。以革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)为研究对象，以革兰氏阳性粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)为对照。分别取300μL上述细菌悬液(OD600＝0.5)离心(8000rpm，5min)，之后用1×PBS缓冲液洗涤3次，加入探针AIE-DCM-2PolymyxinB，得到探针浓度为20μmol/L的混合液，在37℃、黑暗环境下孵育30s后，将混合液离心(8000rpm，5min)，1×PBS缓冲液洗涤3次，洗涤后的菌体再悬浮于1×PBS缓冲液中，用移液枪将菌液转移至玻璃载玻片上，盖上盖玻片后，在405nm激发下，用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)在560nm以上采集荧光信号。结果如图8(标尺为20μm)所示，由图8可知，本发明提供的探针AIE-DCM-2PolymyxinB可以特异性的与革兰氏阴性大肠杆菌结合并发出强烈的荧光。
对探针AIE-DCM-2PolymyxinB产生活性氧(ROS)的能力，以及探针AIE-DCM-2PolymyxinB与E.coli混合液产生ROS的能力进行检测，检测时使用ABDA(9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸)作为活性氧检测指示剂，其能与活性氧快速反应，降低吸光度。具体是将ABDA溶解于DMSO中，配成浓度为50mM的ABDA母液，分别加入到上述探针浓度为20μmol/L的工作液以及探针浓度为20μmol/L的混合液(具体为探针AIE-DCM-2Polymyxin B与E.coli的混合液)中，得到待测液，其中，ABDA母液与待测液的体积比为1:1000；之后在0.861W/cm2白光照射条件下，定时测量待测液吸收光谱的变化；其中，ROS产率与ABDA下降速率成正比，每组做3个重复，且以超纯水作为对照组。结果如图9所示，其中，A为probe组，B为probe+E.coli组，C为分别加入probe、probe+E.coli或超纯水(对照组)的待测液在400nm处的相对紫外吸光度随光照时间的变化曲线，D为0.861W/cm2白光照射条件下probe组以及probe+E.coli组中ABDA的分解速率图，其中，A0和A分别为辐照前后400nm处的吸光度。由图9中的A、B和C可知，在0.861W/cm2白光照射条件下，probe组以及probe+E.coli组，数秒钟内吸光度均迅速下降；作为对照组(超纯水)，并没有引起明显的吸光度下降；由图9中的D可知，探针AIE-DCM-2Polymyxin B可以有效地产生ROS。
实验例2
特异性杀伤革兰氏阴性菌：
将-80℃条件下保存的革兰氏阳性粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)、变异链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)和革兰氏阴性大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)分别接种于BHI平板和LB平板中，在37℃条件下倒置过夜培养，之后挑取过夜培养的实验菌株分别接种于BHI和LB液体培养基中，37℃条件下培养16～18h。
从固体BHI琼脂平板上取一粪肠球菌、变异链球菌的菌落转移至液体BHI培养基(5mL)中，所得细菌悬液在37℃的培养箱中培养16～18h，取1mL细菌悬液离心(8000rpm，5min)，用1×PBS缓冲液洗涤3次；洗涤后的菌体再悬浮于1×PBS缓冲液中，稀释至OD600＝0.5。从固体LB琼脂平板上取一大肠杆菌的菌落转移至液体LB培养基(5mL)中，所得细菌悬液在37℃的培养箱中培养16～18h，取1mL细菌悬液离心(8000rpm，5min)，用1×PBS缓冲液洗涤3次；洗涤后的菌体再悬浮于1×PBS缓冲液中，稀释至OD600＝0.5。
采用菌落形成单元(CFU)计数法研究探针AIE-DCM-2PolymyxinB的抗菌作用，具体步骤如下：
对照组(革兰氏阳性粪肠球菌、变异链球菌)取1mL细菌悬液(OD600＝0.5)离心(8000rpm，5min)，1×PBS洗涤3次，洗涤后的菌体再重悬于24孔板液体BHI培养基中，白光照射(0.861W/cm2，30s)或者不照射。另取1mL细菌悬液(OD600＝0.5)加入探针AIE-DCM-2Polymyxin B，得到探针浓度为20μmol/L的混合液，黑暗环境下孵育30s，混合液离心(8000rpm，5min)，1×PBS洗涤3次，洗涤后的菌体再重悬于24孔板液体BHI培养基中，白光照射(0.861W/cm2，30s)或者不照射。将A、B、C、D组(其中，A和B为未加探针组，C和D为加探针组，且A和C为不进行白光照射组，B和D为进行白光照射组)的细菌悬浮液连续稀释1×105倍，取100μL最终稀释后的细菌悬浮液铺于固体BHI琼脂平板上，37℃孵育16～18h后菌落计数，每个实验菌种做三个平行。
实验组(革兰氏阴性大肠杆菌)取1mL细菌悬液(OD600＝0.5)离心(8000rpm，5min)，1×PBS洗涤3次，洗涤后的菌体再重悬于24孔板液体LB培养基中，白光照射(0.861W/cm2，30s)或者不照射。另取1mL细菌悬液(OD600＝0.5)加入探针AIE-DCM-2PolymyxinB，得到探针浓度为20μmol/L的混合液，黑暗环境下孵育30s，混合液离心(8000rpm，5min)，1×PBS洗涤3次，洗涤后的菌体再重悬于24孔板液体LB培养基中，白光照射(0.861W/cm2，30s)或者不照射。将A、B、C、D组(其中，A和B为未加探针组，C和D为加探针组，且A和C为不进行白光照射组，B和D为进行白光照射组)的细菌悬浮液连续稀释1×105倍，取100μL最终稀释后的细菌悬浮液铺于固体LB琼脂平板上，37℃孵育16～18h后菌落计数，每个实验菌种做三个平行。
图10为探针的杀菌作用结果图，其中，A和B为未加探针组，C和D为加探针组，且A和C为不进行白光照射组，B和D为进行白光照射组。由图10可知，本发明提供的探针AIE-DCM-2Polymyxin B在白光照射条件下可以有效杀灭革兰氏阴性大肠杆菌。
图11为对图10平板计数的结果统计图，其中，“Dark”代表不进行白光照射(且未加探针AIE-DCM-2PolymyxinB)，“Light”代表进行白光照射(且未加探针AIE-DCM-2PolymyxinB)，“Probe”代表加探针AIE-DCM-2Polymyxin B(且不进行白光照射)，“Probe+Light”代表加探针AIE-DCM-2PolymyxinB且进行白光照射。由图11可知，本发明提供的探针AIE-DCM-2PolymyxinB在白光照射下可以有效杀灭革兰氏阴性大肠杆菌，对革兰氏阳性粪肠球菌、变异链球菌无明显的杀灭作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种聚集诱导发光荧光开启探针，其特征在于，具有式I所示结构：
Figure FDA0002423310660000011
式I中R具有式II所示结构：
Figure FDA0002423310660000012
2.权利要求1所述聚集诱导发光荧光开启探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将化合物A与二甲基亚砜混合，调节所得体系的pH值为7～8，得到化合物A的二甲基亚砜溶液；将所述化合物A的二甲基亚砜溶液、化合物B、硫酸铜、抗坏血酸钠、四氢呋喃和水混合后进行点击反应，得到化合物C；
将R-H与N,N-二甲基甲酰胺混合，调节所得体系的pH值为7，得到R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液；将所述R-H的N,N-二甲基甲酰胺溶液与化合物C混合后进行迈克尔加成反应，得到具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针；
其中，R-H中R具有式II所示结构，化合物A、化合物B和化合物C分别具有式A、式B和式C所示结构：
Figure FDA0002423310660000021
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物A和二甲基亚砜的用量比为15～35μmol：1mL；
所述化合物A和化合物B的摩尔比为15～35：6；
所述二甲基亚砜、四氢呋喃和水的体积比为10：2～3：2。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述点击反应的温度为室温，时间为20～28h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述R-H和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为7～10μmol：1mL；
所述R-H和化合物C的摩尔比为7～10：2～3。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，所述迈克尔加成反应的温度为室温，时间为20～28h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，调节化合物A与二甲基亚砜混合后所得体系pH值的试剂为N,N-二异丙基乙胺；
调节R-H与N,N-二甲基甲酰胺混合后所得体系pH值的试剂为N,N-二异丙基乙胺或三乙胺。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述点击反应和迈克尔加成反应后还独立的包括高效液相色谱分离纯化。
9.权利要求1所述具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针在制备特异性检测革兰氏阴性菌的检测试剂中的应用。
10.权利要求1所述具有式I所示结构的聚集诱导发光荧光开启探针在制备特异性杀伤革兰氏阴性菌的药剂中的应用。
CN202010212542.0A 2020-03-24 2020-03-24 一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用 Active CN111334291B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010212542.0A CN111334291B (zh) 2020-03-24 2020-03-24 一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010212542.0A CN111334291B (zh) 2020-03-24 2020-03-24 一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111334291A CN111334291A (zh) 2020-06-26
CN111334291B true CN111334291B (zh) 2023-02-28

Family

ID=71180445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010212542.0A Active CN111334291B (zh) 2020-03-24 2020-03-24 一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111334291B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113337275B (zh) * 2021-04-25 2022-11-01 江苏新视界先进功能纤维创新中心有限公司 一种抗菌aie材料及其制备方法
CN114235939B (zh) * 2021-12-15 2023-09-26 上海交通大学 一种肿瘤微环境细菌探针及其在基于成像质谱流式技术的肿瘤微环境细菌检测中的应用
CN114748619B (zh) * 2022-03-01 2023-12-26 深圳市第三人民医院 聚集诱导发光材料及其制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016075481A1 (en) * 2014-11-13 2016-05-19 The University Court Of The University Of Edinburgh Fret molecular probes with cleavable linkers for detecting bacteria and/or fungi in vitro and in vivo
WO2016078603A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 The Hong Kong University Of Science And Technology Aie luminogens for bacteria imaging, killing, photodynamic therapy and antibiotics screening, and their methods of manufacturing
CN107236539A (zh) * 2017-06-02 2017-10-10 华南理工大学 一种聚集诱导发光抗菌多肽探针及制备与应用
CN108982430A (zh) * 2017-05-31 2018-12-11 北京大学 标记细菌菌群样品的试剂盒、方法、带荧光标记的细菌菌群及其应用
CN110041916A (zh) * 2019-05-16 2019-07-23 南京中医药大学 一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10753941B2 (en) * 2011-09-01 2020-08-25 The Hong Kong University Of Science And Technology Biocompatible nanoparticles with aggregation induced emission characteristics as fluorescent bioprobes and methods of using the same for in vitro and in vivo imaging
GB201420222D0 (en) * 2014-11-13 2014-12-31 Univ Edinburgh Molecular probes and methods using the same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016075481A1 (en) * 2014-11-13 2016-05-19 The University Court Of The University Of Edinburgh Fret molecular probes with cleavable linkers for detecting bacteria and/or fungi in vitro and in vivo
WO2016078603A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 The Hong Kong University Of Science And Technology Aie luminogens for bacteria imaging, killing, photodynamic therapy and antibiotics screening, and their methods of manufacturing
CN108982430A (zh) * 2017-05-31 2018-12-11 北京大学 标记细菌菌群样品的试剂盒、方法、带荧光标记的细菌菌群及其应用
CN107236539A (zh) * 2017-06-02 2017-10-10 华南理工大学 一种聚集诱导发光抗菌多肽探针及制备与应用
CN110041916A (zh) * 2019-05-16 2019-07-23 南京中医药大学 一种检测细菌内毒素的聚集诱导荧光多肽探针制备及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Probing the Penetration of Antimicrobial Polymyxin Lipopeptides into Gram-Negative Bacteria;Zakuan Z. Deris,et al.;《Bioconjugate Chem.》;20140317;第25卷;第750-760页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111334291A (zh) 2020-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111334291B (zh) 一种聚集诱导发光荧光开启探针及其制备方法和应用
Wang et al. Past, present and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology
CN105732564B (zh) 一种双光子荧光探针及在检测缺氧区硝基还原酶中的应用
CN105295909A (zh) 一种苯二胺与柠檬酸制备细胞显影用碳量子点标记探针的方法
Cui et al. In situ identification of environmental microorganisms with Raman spectroscopy
US10351707B2 (en) Water-soluble iron ion fluorescent probe and preparation method thereof
CN112500386A (zh) 基于吡啰红肟的近红外HClO荧光探针、制备及其应用
CN108865132B (zh) 一种荧光碳量子点及其制备方法和用途
He et al. A biocompatible dual-AIEgen system without spectral overlap for quantitation of microbial viability and monitoring of biofilm formation
CN110643355A (zh) 一种检测内质网极性的荧光探针及其制备方法和应用
CN110092773A (zh) 一种氧杂蒽类衍生物及其制备方法和应用
CN115745899B (zh) 一种汞（ⅱ）荧光探针、制备方法及其应用
CN105004703A (zh) 利用dapi嵌入和释放模拟dna纳米折纸结构作为药物载体的方法
Zhang et al. Challenges and current advances in in vitro biofilm characterization
CN110194900B (zh) 一种发射近红外光的荧光染料及其制备方法
CN113072534B (zh) 一种rna荧光探针及其制备方法和应用
CN109650387B (zh) 一种具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的制备方法及其用途
CN111072011B (zh) 一种线粒体-核仁可逆迁移荧光碳点的制备及在监测细胞活性中的应用
Dong et al. Bio-friendly Maillard reaction fluorescent products from glutathione and ascorbic acid for the rapid and label-free detection of Fe 3+ in living cells
CN114085890A (zh) miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒
CN110105377B (zh) 一种检测结核分枝杆菌β-内酰胺酶的探针化合物、制备方法、一种荧光探针
CN110981841B (zh) 一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针及应用
CN114032087A (zh) 一种酶激活型聚集诱导发光荧光探针、制备方法及其应用
CN113121541A (zh) 一种同时区分金离子与钯物种的荧光探针的合成及应用
Guéneau et al. Spatial analysis of multispecies bacterial biofilms

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant