CN114085890A - miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒 - Google Patents

miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒，在细胞内环境下，当目标miRNA存在时，其诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成RNA适配体Corn的G‑4链体结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光，从而通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测，或者通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。本发明利用在胞内环境下，由目标物miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成G‑四链体Corn的空间结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光这一原理，构建了生物体系内miRNA的高灵敏度监测的新方案，能够实现miRNA的原位成像与高灵敏度、高特异性检测。

Description

miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸序列检测领域，特别涉及一种miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒。
背景技术
微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类广泛存在于动植物体内的内源性非编码单链RNA，由19～23个核苷酸组成。可通过与靶信使核糖核酸特异结合抑制转录后基因表达，在调控基因表达、细胞周期、生物体发育时序等方面发挥重要作用，具有极其重要的病理和生理意义的细胞内标志物。细胞异质性使得各个细胞的生长速度、侵袭能力、对药物敏感性等各个方面产生差异，了解细胞组织内一些关键基因的异质性信息，研究其产生过程，不仅要了解其相关microRNA等标志物的存在，更要理解其在细胞中特定位置的作用区域，该方向一直是生物学研究的热点和难点。
目前microRNA成像方法主要有核酸纳米探针，贵金属纳米探针和荧光原位杂交技术等。荧光原位杂交技术(Fluorescent In Situ Hybridization，FISH)是单细胞层面上的成像分析的重要工具，该技术能够直接绘制亚细胞器和组织中的基因表达，已被广泛应用于基因的检测、成像及治疗中。然而，FISH技术仍存在一些问题：如探针选择性、灵敏度低，成像分析时的噪音大；更重要的是，FISH检测通常需要细胞固定化处理，只能检测细胞某个特定时间点死细胞的microRNA表达量。核酸纳米探针除了需要复杂的探针设计外，探针的荧光标记也增加了成本；贵金属纳米探针的均匀性和潜在的毒性在一定程度上限制了其应用。综上，发展灵敏度高、特异性强，且对细胞本身生理过程不产生或很少产生干扰的新型原位成像新方法，实现miRNAs空间分布和表达水平的监测，探究细胞基因表达的空间分布、异质性，一直是研究学者们不断追求的目标，但现在缺少可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒。本发明基于Corn-DFHO尺寸小，生物相容性好及优异的光稳定性，针对活细胞内相关的miRNAs，开发了新型目标物诱导的熵驱动的DNA催化反应，能够将其直接应用于细胞层面上内源性miRNAs的检测与成像。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明提供一种miRNA检测方法，该方法为：在细胞内环境下，当待检测的目标miRNA存在时，该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成RNA适配体Corn的G-4链体结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光，从而通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测。
本发明还提供一种miRNA成像方法，该方法为：在细胞内环境下，当目标miRNA存在时，该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成RNA适配体Corn的G-4链体结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光，从而通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
Wenjiao Song等筛选出一种红色荧光蛋白模拟RNA，该RNA只含有28个碱基，并最终命名为Corn。Corn与3，5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮-2-肟(DFHO)结合后，荧光强度可增强1000倍以上，且Corn-DFHO结合后形成一种黄色荧光复合物，与细胞孵育时有更低的荧光背景，且其光稳定性大大提高。最终Corn-DFHO被应用于Pol III转录物的实时荧光成像(Song W,Filonov GS,Kim H,et al.Imaging RNA polymerase III transcription usinga photostable RNA-fluorophore complex.Nature Chemical Biology 2017,13(11):1187-1194.)，用来研究mTOR抑制剂对Pol III的转录抑制。随后，文献(Warner KD,Sjekloca L,Song W,et al.A homodimer interface without base pairs in anRNAmimic of red fluorescent protein.Nature Chemical Biology 2017,13(11):1195-1201.)报道了Corn-DFHO的发光原理，结果表明Corn折叠后可以形成G-四链体构像，而DFHO正好可以夹在两个同形G-四链体的中间，形成头对头的结构，从而“调整”DFHO的光物理特性，使荧光增强。Corn-DFHO具有优异的光稳定性(Engelhart AE.A tale of two G-quadruplexes.Nature Chemical Biology 2017,13(11):1140-1141.)，如果能将其应用于细胞中内源性microRNA的动态监测，可以在很大程度上解决传统Fish成像中存在光稳定性和细胞固定化的问题，成为活细胞内基因空间分布与动态运动研究的有效手段。但现有技术中未见公开可靠的方案，而本申请成功利用Corn-DFHO实现了miRNA的检测与成像。
本发明还提供一种用于miRNA检测和成像的组合物，其用于采用以上方法对目标miRNA进行检测和/或成像。
优选的是，目标miRNA为miRNA-141，序列为：
5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’；
该组合物包括：
引物探针OB，其序列为：
5’-CGAAGAAGGA GGTCTGAGGAGGTCACTG-3’；
引物探针SB，其序列为：
5’-CCACATACATCATATT AACT TAACACTGTCTGGTAA-3’；
引物探针LB，其序列为：
5’-CCATCTTTACCAGACAGTGTTAAGTTCAGTGACCTCCTCAGACC-3’；
以及染料探针F，其序列为：
5’-GGTCTGAGGAGGTCACTGAACTTAACACTGTCTGGTAA-3’；
其中，引物探针OB、SB、LB用于杂交合成底物探针S，底物探针S和染料探针F作为反应物，当目标miRNA存在时，在熵驱动的作用下，目标miRNA不断的催化熵驱动的链取代反应，使染料探针F取代底物探针S中的引物探针OB和SB两条链，从而使引物探针OB从底物探针S中游离到反应体系的溶液中，游离的引物探针OB与反应体系中加入的DFHO结合，形成RNA适配体Corn的G-4链体结构，从而本来无荧光的DFHO产生荧光；最终能够通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测，以及通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
本发明还提供一种用于miRNA检测和成像的试剂盒，其包括如上所述的组合物。
优选的是，该试剂盒还包括TE缓冲液、不含RNA酶的离心管、MgCl2溶液、opti-MEM培养基、lipo3000溶液。
优选的是，该试剂盒用于目标miRNA检测或成像的方法包括以下步骤：
1)合成底物探针S：
分别用TE缓冲液配制引物探针OB溶液、引物探针SB溶液和引物探针LB溶液，然后将三种引物探针溶液加入到不含RNA酶的离心管中，混合均匀后再加入MgCl2溶液，加热，之后冷却至室温，最后用DNA纯化试剂盒纯化后，干燥得到底物探针S的干粉；
2)制备质粒包裹的底物探针S和染料探针F：
分别取底物探针S干粉、染料探针F用opti-MEM培养基溶解并配制成底物探针S溶液和染料探针F溶液，另取lipo3000溶液用opti-MEM培养基稀释，将探针S溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到A混合液，将染料探针F溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到B混合液，静置备用；
3)对包含目标miRNA的细胞进行培养；
4)对培养后的细胞进行目标miRNA检测：
将A混合液、B混合液与培养后的细胞混合进行孵育，之后用PBS溶液清洗去除多余的探针，再加入DFHO溶液继续孵育，然后再用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液；
最后检测细胞的荧光强度，实现目标miRNA的检测；或者通过采集细胞的荧光图像实现目标miRNA成像。
优选的是，该试剂盒用于目标miRNA检测或成像的方法包括以下步骤：
1)合成底物探针S：
分别用TE缓冲液配制引物探针OB溶液、引物探针SB溶液和引物探针LB溶液，然后将三种引物探针溶液加入到不含RNA酶的离心管中，混合均匀后再加入MgCl2溶液，加热至95℃，并保持5分钟，之后冷却至室温，最后用DNA纯化试剂盒纯化后，干燥得到底物探针S的干粉；
2)制备质粒包裹的底物探针S和染料探针F：
分别取底物探针S干粉、染料探针F用opti-MEM培养基溶解并配制成底物探针S溶液和染料探针F溶液，另取lipo3000溶液用opti-MEM培养基稀释，将探针S溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到A混合液，将染料探针F溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到B混合液，静置15min备用；
3)对包含目标miRNA的细胞进行培养；
4)对培养后的细胞进行目标miRNA检测或成像：
将A混合液、B混合液与培养后的细胞混合孵育5小时，之后用PBS溶液清洗去除多余的探针，再加入DFHO溶液继续孵育30min，然后再用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液；
最后通过检测细胞的荧光强度，实现目标miRNA的检测；或者通过采用共聚焦显微镜采集细胞的荧光图像实现目标miRNA成像。
优选的是，所述步骤3)中的细胞为包含目标miRNA的MCF-7细胞，进行细胞培养的方法为：将MCF-7细胞用RPMI-1640培养液培养，培养液中添加了胎牛血清、青霉素和链霉素；细胞置于含有5％CO2的37℃的培养箱中培养；将融合度大于90％的细胞以5×105浓度接种培养皿中，在培养箱中培养过夜。
本发明的有益效果是：本发明利用在胞内环境下，由目标物miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成可自组装形成头对头构型G-四链体Corn的空间结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光这一原理，构建了生物体系内miRNA的高灵敏度监测的新方案，能够实现miRNA的原位成像与高灵敏度、高特异性检测；同时，通过对探针中目标识别单元的更改，能进一步扩大此方法的应用范围，实现活细胞内多种核酸标志物的高灵敏度测定与成像。
附图说明
图1为本发明中miRNA检测与成像的原理示意图；
图2为本发明的实施例2中凝胶电泳验证目标物诱导的熵驱动扩增过程的结果；
图3为本发明的实施例2中不同物质的荧光光谱图；
图4为本发明的实施例3中目标miRNA成像激光照射时间与荧光强度的关系；
图5为本发明的实施例3中miRNA-141成像共聚焦图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例的本发明提供一种miRNA检测方法，该方法为：在细胞内环境下，当待检测的目标miRNA存在时，该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成RNA适配体Corn的G-4链体结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光，从而通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测。
本实施例还提供一种miRNA成像方法，该方法为：在细胞内环境下，当目标miRNA存在时，该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成RNA适配体Corn的G-4链体结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光，从而通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
实施例2
本发明还提供一种用于miRNA检测和成像的组合物，其用于采用实施例1的方法对目标miRNA进行检测和/或成像。
本实施例中，目标miRNA为miRNA-141，序列为：
SEQ ID Nos 1：5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’；
该组合物包括：
引物探针OB，其序列为：
SEQ ID Nos 2：5’-CGAAGAAGGA GGTCTGAGGAGGTCACTG-3’；
引物探针SB，其序列为：
SEQ ID Nos 3：
5’-CCACATACATCATATT AACT TAACACTGTCTGGTAA-3’；
引物探针LB，其序列为：
SEQ ID Nos 4：
5’-CCATCTTTACCAGACAGTGTTAAGTTCAGTGACCTCCTCAGACC-3’；
以及染料探针F，其序列为：
SEQ ID Nos 5：
5’-GGTCTGAGGAGGTCACTGAACTTAACACTGTCTGGTAA-3’；
其中，引物探针OB、SB、LB用于杂交合成底物探针S，底物探针S和染料探针F作为反应物，当目标miRNA存在时，在熵驱动的作用下，目标miRNA不断的催化熵驱动的链取代反应，使染料探针F取代底物探针S中的引物探针OB和SB两条链，从而使引物探针OB从底物探针S中游离到反应体系的溶液中，游离的引物探针OB与反应体系中加入的DFHO结合，形成RNA适配体Corn的G-4链体结构，从而本来无荧光的DFHO产生荧光；最终能够通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测，以及通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
参照图1，为本发明的原理图，其中带括号的标号含义为：(1)引物探针OB；(2)引物探针LB；(3)引物探针SB；(4)底物探针S；(5)target miRNA；即目标miRNA；(6)染料探针F；(7)Waste。其中不带括号的数字表示相同序列及互补序列，如1和1-为互补序列。
由图1所示，利用OB、LB、SB杂交合成了底物探针S，将S和F作为反应物，当TargetmiRNA存在时，在熵驱动的作用下，Target RNA可以不断的催化熵驱动的链取代反应，使链F取代S中的OB和SB两条链，从而使OB和LB从基质中游离到溶液中，游离的OB与DFHO结合，形成了RNA适配体Corn的G-4链体结构，从而使本来不发光的DFHO产生荧光。
参照图2，为凝胶电泳验证目标物诱导的熵驱动扩增过程，其中标号含义为：1-OB；2-SB；3-LB 4-F；5-Target；6-S；7-S+F+Target；8-20bp marker。由图2可知，OB,SB,LB共同孵育后，形成了具有更大分子量的产物S，且S与F和target miRNA发生了熵驱动的链取代反应，在OB和SB的位置出现新条带，证明了该反应的可行性。
参照图3，不同物质的荧光光谱图，其中，1-7分别为DFHO,SB,LB,F,target,S,F+target+S的荧光吸收光谱，由图可知，单独的SB、LB、F、target、S和DFHO都仅仅有微弱的背景荧光，但是当F、target RNA和S共同孵育后，体系的荧光有明显的增强，证明了该反应发生后生成的OB链，可以形成Corn的G4链体结构，从而引发DFHO小分子的荧光增强，进一步证明了该体系的可行性。
需要理解的是，通过更改探针识别靶标区域的碱基，能够扩大探针的识别范围，测定活细胞中其他核酸目标物，利用识别过程中探针间共振耦合过程中光信号的变化，建立成像信号和靶分子间的定性和定量关系，能够实现实时、无损、定量的实时监测肿瘤细胞内的其他核酸靶标，如miRNA与非编码RNA，甚至可以扩展肿瘤以外的生物学领域，如实现具有生物学意义的RNA/RNA相互作用的体内可视化分析。
实施例3
本发明还提供一种用于miRNA检测和成像的试剂盒，其包括如上所述的组合物。
在优选的实施例中，该试剂盒还包括TE缓冲液、不含RNA酶的离心管、MgCl2溶液、opti-MEM培养基、lipo3000溶液。
在优选的实施例中，该试剂盒用于目标miRNA检测或成像的方法包括以下步骤(目标miRNA和各探针序列如实施例2所示)：
1)合成底物探针S：
分别用TE缓冲液(Tris-HCl 10mM，EDTA1mM)配制浓度为100μM的引物探针OB溶液、引物探针SB溶液和引物探针LB溶液，然后将三种引物探针溶液各移取80μL加入到1.5ml不含RNA酶的离心管中，混合均匀后再加入2.4μL 1M的MgCl2溶液，加热至95℃，并保持5分钟，之后冷却至室温，最后用DNA纯化试剂盒纯化后，干燥得到底物探针S的干粉；
体外验证实验：
分别用TKMg缓冲液(Tris-HCl 10mM,,K+100mM,,Mg2+10mM)配制10μM的底物探针S溶液、染料探针F溶液和目标miRNA(Target miRNA)溶液，各移取100μL混合，37℃孵育2小时，加入0.6μL的DFHO溶液(10mM)，测定荧光光谱。
2)制备质粒包裹的底物探针S和染料探针F：
分别取底物探针S干粉、染料探针F用opti-MEM培养基溶解并配制成浓度为20μg/mL的底物探针S溶液和染料探针F溶液，另取lipo3000溶液用opti-MEM培养基稀释35倍，将探针S溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到A混合液，将染料探针F溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到B混合液，静置15min备用；
3)对包含目标miRNA的细胞进行培养：
将MCF-7细胞用RPMI-1640培养液培养，培养液中添加了10％的胎牛血清、80U/mL的青霉素和0.08mg/mL的链霉素；细胞置于含有5％CO2的37℃的培养箱中培养；将融合度大于90％的细胞以5×105浓度接种1mL到培养皿中，在培养箱中培养过夜。
4)对培养后的细胞进行目标miRNA检测或成像：
将A混合液、B混合液与培养后的细胞混合孵育5小时，之后用PBS溶液清洗3次去除多余的探针，加入500μL DFHO，在细胞培养箱中孵育30min，然后用PBS清洗3遍出去多余的DFHO；再加入核染料继续孵育10min，然后再用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液；
最后通过检测细胞的荧光强度，实现目标miRNA的检测；或者通过采用共聚焦显微镜采集细胞的荧光图像实现目标miRNA成像。其中，RNA适配体Corn的G-4链体结构和核染料的激发波长分别是488nm和405nm，故在这两种激发光下进行成像，从而能得到目标miRNA的荧光图像以及细胞核的荧光图像。
参照图4，为目标miRNA成像激光照射时间与荧光强度的关系，从图中可以看出，用激光持续照射孵育了探针组合物的MCF-7细胞(即步骤4中用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液之后的细胞)，600s后体系的荧光强度仅下降30％，证明该系统的光稳定性良好。
参照图5，为miRNA-141成像共聚焦图，其中，上面一排细胞为MCF-7阳性细胞，下面一排为MCF-10A阴性细胞；从左至右的四列依次为：激发光波长405nm下的荧光图像、激发光波长488nm下的荧光图像、明场图像、左边第1列和第2列的融合图像；从图5可以看出，在micro-141低表达的MCF-10A细胞中，体系只显示微弱的荧光，但是在MCF-7细胞中，体系有明显的黄色荧光，证明本发明可以很好的体现miR-141的分布和含量，区分正常细胞和癌细胞。
RNA探针相比于传统生物探针而言，具有纯度高，合成周期短，易于改造的特点，鉴于Corn-DFHO优异的光稳定性，将其应用于细胞中miRNA的监测，可以在很大程度上解决传统Fish成像中存在光稳定性和细胞固定化的问题，成为活细胞内基因空间分布与动态运动研究的有效手段。同时，为了扩大探针的识别范围，通过更改探针识别靶标区域的碱基，测定活细胞中其他核酸目标物，利用识别过程中探针间共振耦合过程中光信号的变化，建立成像信号和靶分子间的定性和定量关系，实现实时、无损、定量的实时监测肿瘤细胞内的其他核酸靶标，如miRNA与非编码RNA，甚至可以扩展肿瘤以外的生物学领域，如实现具有生物学意义的RNA/RNA相互作用的体内可视化分析。在实时动态观察RNA/DNA和RNA/蛋白质复合物功能，揭示肿瘤形成机制、早期诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 苏州科技大学
<120> miRNA检测与成像方法、组合物以及试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
cgaagaagga ggtctgagga ggtcactg 28
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
ccacatacat catattaact taacactgtc tggtaa 36
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ccatctttac cagacagtgt taagttcagt gacctcctca gacc 44
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ggtctgagga ggtcactgaa cttaacactg tctggtaa 38

Claims (9)

1.一种miRNA检测方法，其特征在于，该方法为：在细胞内环境下，当待检测的目标miRNA存在时，该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成RNA适配体Corn的G-4链体结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光，从而通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测。
2.一种miRNA成像方法，其特征在于，该方法为：在细胞内环境下，当目标miRNA存在时，该目标miRNA诱导底物探针和染料探针发生熵驱动的循环反应，生成RNA适配体Corn的G-4链体结构，使得体系中本来无荧光的DFHO产生荧光，从而通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
3.一种用于miRNA检测和成像的组合物，其特征在于，其用于采用权利要求1的方法对目标miRNA进行检测和/或采用如权利要求2的方法对目标miRNA进行成像。
4.根据权利要求3所述的用于miRNA检测和成像的组合物，其特征在于，目标miRNA为miRNA-141，序列为：
5’-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3’；
该组合物包括：
引物探针OB，其序列为：
5’-CGAAGAAGGA GGTCTGAGGAGGTCACTG-3’；
引物探针SB，其序列为：
5’-CCACATACATCATATT AACT TAACACTGTCTGGTAA-3’；
引物探针LB，其序列为：
5’-CCATCTTTACCAGACAGTGTTAAGTTCAGTGACCTCCTCAGACC-3’；
以及染料探针F，其序列为：
5’-GGTCTGAGGAGGTCACTGAACTTAACACTGTCTGGTAA-3’；
其中，引物探针OB、SB、LB用于杂交合成底物探针S，底物探针S和染料探针F作为反应物，当目标miRNA存在时，在熵驱动的作用下，目标miRNA不断的催化熵驱动的链取代反应，使染料探针F取代底物探针S中的引物探针OB和SB两条链，从而使引物探针OB从底物探针S中游离到反应体系的溶液中，游离的引物探针OB与反应体系中加入的DFHO结合，形成RNA适配体Corn的G-4链体结构，从而本来无荧光的DFHO产生荧光；最终能够通过检测体系的荧光强度实现目标miRNA的检测，以及通过荧光成像系统实现目标miRNA的成像。
5.一种用于miRNA检测和成像的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求4所述的组合物。
6.根据权利要求5所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括TE缓冲液、不含RNA酶的离心管、MgCl2溶液、opti-MEM培养基、lipo3000溶液。
7.根据权利要求6所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于目标miRNA检测或成像的方法包括以下步骤：
1)合成底物探针S：
分别用TE缓冲液配制引物探针OB溶液、引物探针SB溶液和引物探针LB溶液，然后将三种引物探针溶液加入到不含RNA酶的离心管中，混合均匀后再加入MgCl2溶液，加热，之后冷却至室温，最后用DNA纯化试剂盒纯化后，干燥得到底物探针S的干粉；
2)制备质粒包裹的底物探针S和染料探针F：
分别取底物探针S干粉、染料探针F用opti-MEM培养基溶解并配制成底物探针S溶液和染料探针F溶液，另取lipo3000溶液用opti-MEM培养基稀释，将探针S溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到A混合液，将染料探针F溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到B混合液，静置备用；
3)对包含目标miRNA的细胞进行培养；
4)对培养后的细胞进行目标miRNA检测：
将A混合液、B混合液与培养后的细胞混合进行孵育，之后用PBS溶液清洗去除多余的探针，再加入DFHO溶液继续孵育，然后再用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液；
最后检测细胞的荧光强度，实现目标miRNA的检测；或者通过采集细胞的荧光图像实现目标miRNA成像。
8.根据权利要求7所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于目标miRNA检测或成像的方法包括以下步骤：
1)合成底物探针S：
分别用TE缓冲液配制引物探针OB溶液、引物探针SB溶液和引物探针LB溶液，然后将三种引物探针溶液加入到不含RNA酶的离心管中，混合均匀后再加入MgCl2溶液，加热至95℃，并保持5分钟，之后冷却至室温，最后用DNA纯化试剂盒纯化后，干燥得到底物探针S的干粉；
2)制备质粒包裹的底物探针S和染料探针F：
分别取底物探针S干粉、染料探针F用opti-MEM培养基溶解并配制成底物探针S溶液和染料探针F溶液，另取lipo3000溶液用opti-MEM培养基稀释，将探针S溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到A混合液，将染料探针F溶液与稀释后的lipo3000溶液混合均匀得到B混合液，静置15min备用；
3)对包含目标miRNA的细胞进行培养；
4)对培养后的细胞进行目标miRNA检测或成像：
将A混合液、B混合液与培养后的细胞混合孵育5小时，之后用PBS溶液清洗去除多余的探针，再加入DFHO溶液继续孵育30min，然后再用PBS溶液清洗去除多余的DFHO溶液；
最后通过检测细胞的荧光强度，实现目标miRNA的检测；或者通过采用共聚焦显微镜采集细胞的荧光图像实现目标miRNA成像。
9.根据权利要求7或8所述的用于miRNA检测和成像的试剂盒，其特征在于，所述步骤3)中的细胞为包含目标miRNA的MCF-7细胞，进行细胞培养的方法为：将MCF-7细胞用RPMI-1640培养液培养，培养液中添加了胎牛血清、青霉素和链霉素；细胞置于含有5％CO2的37℃的培养箱中培养；将融合度大于90％的细胞以5×105浓度接种培养皿中，在培养箱中培养过夜。
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