CN111965148B - 一种基于硅纳米粒子荧光传感的microRNA检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于硅纳米粒子荧光传感的microRNA检测方法及其应用。本发明设计得到一种粒径小、表面带正电的修饰纳米硅纳米粒子，其具有善并提高“On‑off‑on”策略传感性能的效果，通过该修饰纳米硅纳米粒子的荧光猝灭剂，在加入检测目标物后，荧光回升明显，在45min内的回升效率达到70％以上，采用该荧光猝灭剂实施核苷酸检测，检出限更低(26pM)，检测灵敏度更高，并可做到活细胞分析，检测速度更快，方法稳定，有很好的准确性，重现性好，可发展成为试剂盒及其相关方面推向市场。

Description

一种基于硅纳米粒子荧光传感的microRNA检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种基于硅纳米粒子荧光传感的microRNA检测方法及其应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一种机体内源性表达的单链小分子RNA，位于基因组非编码区，本身不具有开放阅读框(open reading frame，ORF)，具有高度保守性，时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，不编码任何蛋白质，长度仅为20～24nt。成熟的miRNA5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基，由具有发夹状结构的约70-90nt的单链RNA前体经过Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex，RISC)作用于靶点mRNA，通过对mRNA剪切或抑制其翻译过程而调控基因的表达。
有研究指出，miRNA在细胞生长、发育、分化、死亡等生物过程中起着重要的作用，同时，miRNA参与了血细胞生成、胰岛素分泌、神经系统构成和人类癌细胞生长等不同的过程，因此，非常有必要开发出有效的检测工具来测定miRNA。目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(quantitative Real-TimePCR)。Northern印迹分析的不足之处在于：Northern分析的过程涉及大量人工操作，对检验人员的技术要求较高，并且每次仅有一条miRNA探针与一个RNA印迹杂交，因此，它不适用于大规模的临床筛选检测。微点阵分析的不足之处在于：需要足够的RNA样本，无法区分差异很小的miRNA，检测分辨率低，难以达到临床检测要求。实时定量PCR需要进行RNA反转录及后续扩增，往往只能进行相对定量或者定性分析，难以达到临床绝对定量检测要求。
基于现有的miRNA检测的局限性，开发出一种新型的miRNA检测方法，成为当下临床miRNA检测研究的一大热点。“On-off-on”荧光传感策略通常是将有荧光标记的探针首先吸附在淬灭剂上，淬灭探针荧光，提供低背景信号；当有分析物时，探针与分析物反应，使探针离开猝灭剂，产生浓度依赖的荧光恢复。“On-off-on”策略具有简单、灵敏度高、操作方便、成本低等优点，但其十分受限于纳米材料的选择。在基于纳米材料的“On-off-on”传感策略中，纳米材料对荧光探针的快速、超高效率的淬灭将导致荧光恢复很慢或无法恢复。而且，目前现有技术中使用的纳米材料，其较大的纳米材料表面会带来较低的探针负载效率，从而导致荧光恢复过程中受到非特异性吸附的干扰而降低检测效率和检测性能。
因此，为了解决现有技术中的上述技术缺陷，开发一种简便，快捷，无毒，高灵敏，高选择性的硅基纳米传感器，对提高“On-off-on”传感平台的分析性能以及小分子检测方面具有重大意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种修饰硅纳米粒子的制备方法；
本发明的另一目的在于提供一种荧光猝灭剂；
本发明的另一目的在于提供上述荧光猝灭剂在核苷酸检测中的应用；
本发明的另一目的在于提供上述的制备方法制备的修饰硅纳米粒子在细胞成像中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种修饰硅纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
将(4-羧丁基)-三苯基溴化膦溶解于二甲基亚砜中，再与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合；
加入硅量子点，加热，即得修饰硅纳米粒子。
二甲亚砜用来溶解(4-羧丁基)-三苯基溴化膦(TPP)，并且在纯化过程中可以和乙腈互溶，便于溶剂的去除。
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺是氨基和羧基发生偶联反应常用的偶联试剂，适用于本发明的水相反应。
本发明中的制备方法制备得到的修饰硅纳米粒子(TSiNP)在红外光谱1102cm-1处有Si-O的特征吸收峰，在2900cm-1附近有酰胺键的红外吸收峰，同时在690-710cm-1、730-770cm-1处有单取代苯环的特征吸收峰。
本发明中的制备方法制备得到的TSiNP的粒径主要分布在4nm左右，通过x-射线光电子能谱分析可知，TSiNP含有C(61.1％)、O(12.8％)、N(11.7％)和Si(9.6％)四种元素，在294.8、405.5、538.8和108.0eV处出现四个主要峰，分别对应于C1s、N 1s、O 1s和Si 2p。当然，对于C、O、N和Si四种元素以及四个主要峰的合理误差范围内的修饰硅纳米粒子亦在本发明的保护范围之内。
硅纳米材料是一类新型的具有良好的生物相容性，优越的光学性能，无毒，且水溶性好的纳米材料，尤其氨基硅纳米粒子具有尺寸小，无毒，可自主进入细胞，并可对其表面进行功能修饰等优点。而且，纳米材料的荧光淬灭能力强，并可以被细胞吞噬，利用荧光标记单链DNA(ssDNA)作为探针，吸附在纳米材料上构建“On-off-on”荧光传感策略，可以成为细胞内核酸分析的有效工具。
(4-羧丁基)-三苯基溴化膦(TPP)是一种带正电荷的分子，具有靶向亚细胞器的作用，本发明选择TPP分子作为修饰基团，通过调整反应比例来实现对硅纳米粒子表面电荷的调控。
进一步地，按质量份计，上述(4-羧丁基)-三苯基溴化膦0.5-1.0份，上述二甲基亚砜0.5-1.1份，上述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.2-0.5份，上述N-羟基琥珀酰亚胺0.30-0.40份，上述硅量子点0.05-0.1份。
本发明的第二个方面，提供：
一种荧光猝灭剂，该荧光猝灭剂由上述制备方法制得的修饰硅纳米粒子制得。
本发明中的荧光猝灭剂是利用“On-off-on”荧光传感策略，将有荧光标记的探针首先吸附在淬灭剂上，淬灭探针荧光，提供低背景信号；当有分析物时，探针与分析物反应，使探针离开猝灭剂，产生浓度依赖的荧光恢复。本发明的荧光猝灭剂简单、灵敏度高、操作方便、成本低，可以广泛用于药物、生物分子、食品污染物和环境污染物等的检测。
本发明的第三个方面，提供：
上述荧光猝灭剂在核苷酸检测中的应用。
本发明中的荧光猝灭剂是利用“On-off-on”荧光传感策略，将有荧光标记的探针首先吸附在淬灭剂上，淬灭探针荧光，提供低背景信号；当有分析物时，探针与分析物反应，使探针离开猝灭剂，产生浓度依赖的荧光恢复。本发明的荧光猝灭剂简单、灵敏度高、操作方便、成本低，可以广泛用于药物、生物分子、食品污染物和环境污染物等的检测。
进一步地，上述核苷酸包括microRNA。
进一步地，上述核苷酸检测包括以下步骤：
设定激发和发射波长，调整入射和出射狭缝宽度，调整电压；
取修饰硅纳米粒子溶液，加入探针；
加入核苷酸进行检测，根据荧光强度对上述核苷酸定性和定量分析。
进一步地，上述核苷酸检测还包括在加入探针后，避光静置。
进一步地，上述探针为带有负电荷的荧光探针。
在本发明的实施例中，该带有负电荷的荧光探针为ssDNA-Cy5探针，当然，可以根据实际需求，合理的选择其他本领域可替代的探针。
带负电的ssDNA-Cy5探针(probe)通过静电相互作用可以被吸收或靠近修饰硅纳米粒子的表面，通过表面的荧光能量转移，probe的荧光信号被淬灭并构建成修饰硅纳米粒子结合探针(probe@TSiNP)，当检测目标物存在时，检测目标物与probe@TSiNP发生反应，产生荧光回升的信号。而TSiNP尺寸小、可调表面正电荷的特点，在当检测目标物存在时，会与Probe@TSiNP反应形成dsDNA，由于dsDNA的构象变化以及dsDNA与TSiNPs之间的弱相互作用，导致dsDNA可以脱离TSiNPs的表面，使被淬灭的Cy5荧光信号得到恢复。
进一步地，上述发射波长为620-800nm。
进一步地，上述激发波长为600nm。
进一步地，上述入射狭缝和出射狭缝的宽度均为10nm。
进一步地，上述电压设定为700V。
本发明的第四个方面，提供：
上述的制备方法制备的修饰硅纳米粒子在细胞成像中的应用。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的修饰纳米硅纳米粒子粒径小、表面带正电，可以改善并提高“On-off-on”策略的传感性能；
2.本发明中的荧光猝灭剂，在加入检测目标物后，荧光回升明显，在45min内的回升效率达到70％以上，采用该荧光猝灭剂实施核苷酸检测，检出限更低(26pM)，检测灵敏度更高，并可做到活细胞分析；
3.本发明中的检测方法，检测速度更快，缩短了分析检测时间，且方法稳定，有很好的准确性，重现性好，可发展成为试剂盒及其相关方面推向市场。
附图说明
图1为本发明TSiNP的分析图，其中a为紫外光谱；b为红外光谱；c为荧光激发和发射光谱；d为透射电镜图；
图2为本发明TSiNP的粒径分布图；
图3为本发明TSiNP的分析图，其中(a)为X-射线光电子能谱全谱；(b)为碳分峰；(c)为氮分峰；(d)为硅分峰；
图4为基于修饰硅纳米粒子的细胞内miRNA的荧光检测原理图((a)：“On-off-on”原理；(b)：表面电荷和纳米尺寸对传感性能的影响；(c)：合成TSiNP；(d)：细胞内miRNA成像检测)；
图5显示了TSiNP1-5的传感性能，其中，a：TSiNP1-5的Zeta电势；b：淬灭效率；c：动态淬灭效率及淬灭速率回升效率；(d)回升效率；(e)紫外-可见光光谱；(f)动态回升效率及回升速率；
图6为本发明的反应时间优化，(a)淬灭时间；(b)回升时间；
图7为本发明的用量、温度和pH优化，(a)淬灭体系加入TSiNP2前后的荧光光谱(I-X分别为0、10、20、40、60、80、100、150、200、250μg/mL)及淬灭效率(内插图)；(b)probe，probe@TSiNP2和probe@TSiNP2+目标检测物在不同温度下的荧光强度；(c)不同温度下的淬灭效率及回升效率；(d)pH对probe@TSiNP2的影响；
图8为本发明的特异性实验，(a)不同浓度目标检测物存在下的荧光光谱；(b)荧光强度与目标检测物浓度的线性拟合；(c)probe@TSiNP2对目标检测物和单碱基错配目标物的特异性；(d)目标检测物及单碱基错配存在下的荧光回升效率；
图9为传统材料对“On-off-on”策略的传感性能影响，其中，(a)：不同粒径纳米金的荧光淬灭效率；(b)：纳米金的动态淬灭效率及淬灭速率；(c)：目标检测物存在时，不同粒径纳米金淬灭体系的荧光回升效率；(d)：目标检测物存在时，不同粒径纳米金动态荧光回升效率及回升速率(AuNPs、probe和目标检测物浓度分别为5、50和50nM)；
图10为SiNPs和CQDs在“On-off-on”策略中的传感性能，(a)：Probe，SiNPs和CQDs的Zeta电势；(b)：SiNPs和CQDs的淬灭效率；(b)：SiNPs的恢复效率；
图11为本发明的细胞成像可行性，(a)TSiNP2；(b)probe，蓝色为TSiNP2通道，红色为Cy5通道，比例尺＝20μm；
图12为Probe@TSiNP2探针在不同孵育时间下的细胞成像((a)：1h；(b)：2h；(c)：3h；(d)：4h；(e)：5h)，柱状图为Cy5通道内的平均荧光强度；
图13为probe@TSiNP2探针分别在HeLa、A549、MCF-10A三种不同细胞内的荧光成像((a)：HeLa；(b)：A549；(c)：MCF-10A；比例尺＝20μm)。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
本发明中所使用的试剂：
(4-羧丁基)-三苯基溴化膦购自Sigma-Aldrich，美国；
二甲基亚砜购自阿拉丁试剂公司，中国；
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HCL)购自Sigma-Aldrich，美国；
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自Sigma-Aldrich，美国；
硅量子点为本发明按照本领域常规方法自制得到；
制备方法如下：
将3.682g柠檬酸三钠溶解于80mL去离子水中，持续充入氮气20分钟以去除氧气。然后将20mL氨丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)缓慢加入上述溶液继续充入氮气搅拌10min，将上述溶液装入聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中，200℃加热2h，然后冷水冷却。用1kda透析膜透析后，所得产物溶液首先旋转蒸发去除大部分溶剂，然后55℃真空干燥24h即得到硅量子点。
表1本发明中所用寡核苷酸序列
Figure BDA0002579356390000061
实施例1修饰硅纳米粒子(TSiNP)的合成
按照下述组分质量称取：
(4-羧丁基)-三苯基溴化膦(TPP)0.6g，二甲基亚砜1.1g，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC HCL)0.3g，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.36g。
TsiNP的合成方法包括以下步骤：
按照实施例1上述组分质量称取(4-羧丁基)-三苯基溴化膦(TPP)，加入二甲基亚砜溶解，直至澄清，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续搅拌30min，然后加入90mg/mL的纯化的硅量子点，将混合反应液放入37℃的水浴锅中反应30min后，置于50℃水浴锅中水浴反应10h，即可得到TSiNP。
实施例2 TSiNP的结构表征
对实施例1得到的TSiNP进行紫外-可见光谱分析。
结果如图1所示。由于硅纳米粒子(SiNP)在紫外区域无明显吸收峰，反应物4-羧丁基三苯基溴化膦在200-300nm之间有非常强而明显的紫外吸收峰，而通过对TSiNP的紫外吸收光谱分析可以看出，TSiNP中同时看到有两种反应物的紫外吸收，说明4-羧丁基三苯基溴化膦已被成功修饰到硅纳米粒子的表面(图1a)。
对实施例1得到的TsiNP进行红外光谱分析。
利用红外光谱对修饰产物进行官能团结构分析，从图1b可以看出，1102cm-1处为Si-O的特征吸收峰，在2900cm-1附近有产物中新生成的酰胺键的红外吸收峰，同时在690-710cm-1，730-770cm-1处有单取代苯环的特征吸收峰，结果表明TPP已成功修饰到硅纳米粒子的表面。
对实施例1得到的TSiNP进行荧光光谱分析。
从荧光光谱分析可以看出，产物TSiNP具有硅纳米材料的荧光性能，荧光发射峰型对称，无明显的拖尾现象，说明制备的产物颗粒比较均一，在溶液中分散均匀，可以发出蓝色的荧光(图1c)。
对实施例1得到的TSiNP进行透射电镜分析。
从透射电镜分析图上，可以看出产物TSiNP在水中分散均匀，基本呈现规则的球形，无明显团聚(图1d)。
通过粒径分析软件jada5对粒径进行统计，修饰产物的粒径主要分布在4nm左右(图2)。
对实施例1得到的TSiNP进行x-射线光电子能谱分析。
通过x-射线光电子能谱分析可知，TSiNPs含有C(61.1％)、O(12.8％)、N(11.7％)和Si(9.6％)四种元素，在294.8、405.5、538.8和108.0eV处出现四个主要峰，分别对应于C1s、N 1s、O 1s和Si 2p(图3)。
上述实验结果相互佐证，表明TPP在硅纳米粒子上得到了成功的修饰。
实施例3 TSiNP溶液配制
分别用PBS(pH＝7.4)配制一系列浓度为1.0mg/mL的TSiNP，分别标记为TSiNP1、TSiNP2、TSiNP3、TSiNP4、TSiNP5(简称：TSiNP1-5)，probe浓度为1.0μM，固定probe的浓度(50nM)。
然后分别0、1、2、4、6、8、10、15、20、25μL的TSiNP1，用PBS溶液定容至总体积为100μL，选择激发波长600nm，发射波长620～800nm，入射狭缝10nm，出射狭缝10nm，电压700V进行测定。采用同样的方式处理TSiNP2-5，进行测定。随后，对淬灭后的荧光恢复性能进行优化，继续分别配制一系列浓度相同的probe@TSiNP1-5。目标miRNA的浓度为1.0μM，逐渐改变miRNA的加入体积，使其终浓度分别为0，0.1，0.5，1.0，5，10，20，30，40，50nM，溶液总体积固定为100μL，进行测试。
实施例4“On-off-on”策略检测miRNA方法优化
本发明中的“On-off-on”策略反应机理：
带负电的ssDNA-Cy5探针(probe)通过静电相互作用可以被吸收或靠近纳米材料(NMs)的表面，通过表面的荧光能量转移，probe的荧光信号被淬灭并构建成probe@NMs探针。当检测目标物存在时，检测目标物与probe@NMs发生反应，产生荧光回升的信号。在此过程中，可能存在有以下三种情况发生：
(i)probe被纳米材料吸附淬灭后，检测目标物存在时，检测目标物只和probe@NMs发生反应，与互补链通过碱基互补配对作用形成双链DNA(dsDNA)，荧光回升。
(ii)由于纳米材料自身淬灭能力较强，当遇到检测目标物时，即使形成了杂交的dsDNA，但依然牢固被吸附，荧光难以回升。
(iii)较大的纳米表面使得即使有检测目标物存在时，由于纳米材料表面大量未被ssDNA占据的空间，检测目标物有很大几率被继续吸附到纳米材料表面，无法形成dsDNA，从而导致荧光难以回升。
发明人设计合成了合成小尺寸，表面正电荷可调的(4-羧丁基)-三苯基膦离子(TPP)修饰的硅基纳米粒子TSiNP。检测目标物存在时，与Probe@TSiNPs反应形成dsDNA，由于dsDNA的构象变化以及dsDNA与TSiNPs之间的弱相互作用，导致dsDNA可以脱离TSiNP的表面，使被淬灭的Cy5荧光信号得到恢复。因此，构建了基于probe@TSiNPs探针的“On-off-on”策略。具体步骤如图4所示。
本发明中对本发明猝灭剂在时间、温度、猝灭剂用量以及pH等4个方面在“On-off--on”分析策略中的影响作出探究，并以此制定出最优组合。
时间：在“On-off--on”分析策略中，反应时间在整个体系中是一个关键因素，淬灭反应时间过长或过快均会影响整个传感策略的分析检测性能，因此本实验对反应时间进行了考察和优化。
温度：温度在淬灭反应和荧光恢复的过程中也是一个重要的因素，荧光淬灭行为与温度也有密切关系。选择不同温度进行了淬灭行为和荧光恢复的考察。根据最佳的淬灭效率和恢复效率选择适宜的温度。
淬灭剂用量：固定probe浓度，逐渐改变加入淬灭剂的浓度，通过荧光强度和淬灭剂浓度之间的关系，分析并计算出淬灭效率。
pH：probe@TSiNP淬灭体系在分析体系中的稳定性会影响到整个传感平台的分析性能。因此对probe@TSiNP在不同酸碱性条件下的稳定性进行了考察。
按照实施例1制备合成TSiNP。按照实施例3制备TSiNP1-5.
取5μL(1.0μM)probe，分别加入TSiNP1-5(1.0mg/mL)10μL，然后用PBS补足100μL，避光静置一小时后测定体系在600nm激发下的荧光强度。如图5所示，加入TSiNP1-5后，随着TSiNP1-5表面正电荷的增加，probe的荧光淬灭效率逐渐升高，在加入TSiNP1-5浓度达到饱和时，probe的荧光淬灭也接近于一个平衡状态，淬灭速率与TSiNPs表面的正电荷量成正比。当加入检测目标物后，体系的荧光又被恢复，其中probe@TSiNP2体系的荧光回升效率最高(图5d)。而带正电较多的TSiNP3、TSiNP4和TSiNP5的荧光回升性能却出现了下降。
发明人推测这是由于TSiNP3-5表面较多的TPP分子导致和probe反应时形成了一种化合物，在有检测目标物存在时，形成的化合物阻碍了和probe的链杂交反应，因此导致荧光信号无法回升或回升较弱。
为了进一步验证该假想，本发明又考察了淬灭前后体系的紫外光谱的变化，从图5e可以发现probe@TSiNP3-5的紫外光谱发生了明显的红移现象。这说明在发生荧光淬灭的过程中，probe和淬灭剂TSiNP3-5之间的确生成了新的化合物。图5f为TSiNP1-5淬灭体系的动态荧光回升，可知带电量适宜的TSiNP2的回升速率最快，综合考虑“On-off-on”传感的分析性能和检测灵敏性，实验选择TSiNP2纳米粒子为最优淬灭剂。
时间优化实验
取5μL probe，加入TSiNP2 10μL，然后用PBS补足100μL，混合均匀，实时测定在发射波长668nm的荧光强度。如图6所示，随着时间延长，荧光强度逐渐被减弱，1h后基本趋于稳定，因此选择最佳的淬灭时间是1h。按照上述操作，测定加入检测目标物后荧光回升的实时荧光变化。加入检测目标物后，荧光回升在短时间内上升非常明显，在45min后回升效率已接近72％，继续延长反应时间回升效率增加趋于缓慢，为了避免长时间光激发造成的荧光的衰减，因此选择回升时间为45min。
TSiNP用量优化
取一系列相同浓度的probe，然后分别加入浓度相同体积分别为0，1，2，4，6，8，10，15，20，25μL的TSiNP2。如图7a所示，随着TSiNP2的增加，probe的荧光逐渐被减弱，淬灭效率逐渐增加。当加入10μL TSiNP2时，荧光淬灭效率约为72％，之后逐渐达到平衡状态。在基于“On-off-on”策略平台中，为了达到较低的信号背景，同时为了防止过量TSiNP2和目标检测物发生反应，实验选择10μL作为后续实验的加入体积进行分析检测。
温度优化
取5μL probe，加入TSiNP2 10μL，然后用PBS补足100μL，分别在4，15，25，37℃下进行反应，同时分别做四个温度下不加TSiNP2的空白对照。按照上述操作，分别进行了四个温度下的荧光回升实验。从图7b中可以看出在37℃条件下，probe@TSiNP2的淬灭荧光强度最低，在加入检测目标物后荧光回升强度最强。从图7c中可以看出在37℃时，淬灭效率及回升效率是最佳的，因此实验选择37℃为最佳回升温度。
pH优化
为了在检测体系中保证probe@TSiNP2淬灭体系使用的稳定性和良好的分析性能，实验选择了pH5.0～8.0(包含细胞内液和细胞外液环境pH)进行考察probe@TSiNP2的稳定性。从图7d中可以看出，在pH5.0～8.0范围内，荧光强度变化很小，基本呈现一种稳定的状态，说明所构建的探针在pH5.0～8.0是非常稳定的，并可以运用于生物环境体系。
实施例5性能检测分析
按照实施例3的方法，构建一系列相同浓度的淬灭体系探针probe@TSiNP2，放置在37℃恒温反应1h。然后配制一系列不同浓度的目标检测物溶液，分别加入到已经淬灭的反应体系中，混合均匀后，继续在37℃下反应45min。加入不同浓度的目标检测物，用PBS定容至100μL。以空白组(不加入目标检测物)荧光强度为参比，记录每组实验回升的荧光强度。如图8a，b所示，随着加入目标检测物浓度的增加，荧光回升强度逐渐升高，当加入目标检测物为50nM时，荧光回升效率达到71.2％。
线性拟合方程为：
F＝1062.65+137.67c
(R2＝0.9907)，检出限为26pM。
实施例6特异性实验
为了对本方法的特异性进行验证，以检测的目标检测物为对照，同时设计了含错配碱基的单链A-mismatched(A-错配)、G-mismatched(G-错配)、C-mismatched(C-错配)。实验过程中所用probe用量固定，检测目标物和单个碱基错配链的浓度均为1μM，实验条件为优化的最佳实验条件，实验结果如图8c，d所示。只有加入检测的目标物后，荧光回升效果最佳，含有碱基错配的单链加入后，其荧光回升和对照实验相差不大。说明该方法具有很好的区分单碱基错配的能力，选择性好。同时，实验结果进一步证实了荧光恢复需要完全的碱基对匹配，互补链必须完全从TSiNP2表面分离才能恢复Cy5的荧光。
实施例7传统材料对“On-off-on”策略的传感性能影响
本实施例中probe用量为5μL(1.0μM)，然后分别加入10μL不同粒径的纳米金AuNPs-20，AuNPs-12和AuNPs-5，然后用PBS补足100μL，避光静置一小时后测定体系在600nm激发下的荧光强度。从图9中可以看出，纳米粒子的粒径对荧光淬灭性能有较大的影响，其中AuNPs-5在具有较小面积时就可以达到和AuNPs-20，AuNPs-12相似的淬灭效率(图9a)。由于AuNPs-20，AuNPs-12具有较大的表面积，因此，在淬灭反应的起始阶段，尺寸大的纳米金具有明显的优势，随着时间的延长，在淬灭达到饱和阶段时，三种尺寸的纳米金在淬灭效率上非常接近(图9b)。在随后的荧光回升实验中，如图9c所示，小尺寸的AuNPs-5，由于在前阶段淬灭中的probe与纳米金表面之间的饱和结合，因此，在回升过程中表现出较AuNPs-20和AuNPs-12的明显优势。而且从起始的回升速率表现中也可以看出小尺寸表现出的优越性(图9d)。
进一步地，本发明考察了尺寸相近，表面带电性不同的SiNPs和CQDs在“On-off-on”策略中的传感性能。如图10a所示Probe和CQDs均带负电，SiNPs带正电，从图10b中可以看出带负电的CQDs对带负电的probe几乎没有淬灭作用，而带正电较低的SiNPs对probe的有一定的淬灭作用，但淬灭效率还不到30％。
实施例8细胞成像可行性分析
为了实现probe@TSiNP2探针在细胞内的分析检测性能，首先对方法的可行性进行了实验验证。分别将TSiNP2、probe分别与HeLa细胞进行孵育相同的时间，然后在激光共聚焦扫描显微镜下观察荧光信号，参数设置为：TSiNP2为405nm蓝色激光，发射波长445nm，收光范围(425-480nm)；Cy5为633nm红色激光，发射波长668nm，收光范围(650-750nm)。从图11a中可以看到，对于TSiNP2纳米粒子，有非常明亮的蓝色荧光出现，说明TSiNP2纳米粒子可以容易进入细胞，并具有非常好的荧光性质。从图11b中可以看到，在probe的红色荧光通道中几乎观察不到有Cy5的荧光信号，说明在相同的时间内probe自身很难进入细胞，必须要借助运输载体的辅助。
本发明进一步对HeLa细胞中miRNA的成像时间做出探究。
HeLa细胞中miRNA的成像时间
首先将TSiNP2与probe共同孵育1h，构建一个淬灭的probe@TSiNP2探针，然后将probe@TSiNP2探针加入HeLa细胞培养液继续和HeLa细胞进行孵育1-5h。然后用PBS清洗三次，在激光共聚焦扫描显微镜下观察荧光信号，实验参数设置同上(TSiNP2为405nm蓝色激光，发射波长445nm，收光范围(425-480nm)；Cy5为633nm红色激光，发射波长668nm，收光范围(650-750nm))。从图12可以看到在孵育时间1h内，只能观察到微弱的TSiNP2的蓝色荧光和释放的Cy5的红色荧光信号。说明在较短时间内进入细胞内的探针数量还不足。随着孵育时间的延长，可以观察到TSiNP2的蓝色荧光和释放的Cy5的红色荧光随时间延长而越来越强。当孵育时间达到4h时，荧光强度几乎达到最大，再继续增加孵育时间到5h时，荧光强度增加非常缓慢，在这个时间段内，细胞依然保持良好的形态和生理状态。
实施例9不同细胞成像
本发明进一步对宫颈癌细胞HeLa、肺癌系细胞A549、乳腺正常细胞MCF-10A三种不同细胞进行了荧光成像分析。将probe@TSiNP2探针分别和三种细胞在5％CO2，37℃培养箱中共同孵育4h，然后用预冷的PBS洗涤三次，在激光共聚焦显微镜下观察细胞成像效果。从图13a中我们观察到，在宫颈癌细胞HeLa中，能够观察到几乎整个细胞都呈现出明亮的红色荧光，说明检测目标物在整个细胞中均有分布。从图13b可以看出，在肺癌细胞A549中，红色的荧光信号主要集中在细胞核的区域，这一结果意味着检测目标物可能主要分布在细胞核中。从图13c中可以看到，红色的荧光主要分布在细胞膜的区域，说明检测目标物在正常乳腺细胞MCF-10A中的分布主要在离细胞膜比较近的区域。这一结果说明在不同类型肿瘤细胞中，检测目标物在细胞中的分布区域有较大差异。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种基于硅纳米粒子荧光传感的microRNA检测方法及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
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<212> RNA
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agguuguccg uguugucuuc ucu 23
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Claims (3)

1.一种microRNA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
设定激发和发射波长，调整入射和出射狭缝宽度，调整电压；
取修饰硅纳米粒子溶液，加入探针，形成修饰硅纳米粒子结合探针；
加入microRNA进行检测，microRNA与修饰硅纳米粒子结合探针发生反应，产生荧光回升的信号，根据荧光强度对所述microRNA定性和定量分析；
所述修饰硅纳米粒子的制备方法为：将（4-羧丁基）-三苯基溴化膦溶解于二甲基亚砜中，再与1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合；加入硅量子点，加热，即得修饰硅纳米粒子；
按质量份计，所述（4-羧丁基）-三苯基溴化膦0.5-1.0份，所述二甲基亚砜0.5-1.1份，所述1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.2-0.5份，所述N-羟基琥珀酰亚胺0.3-0.4份，所述硅量子点0.05-0.1份；
所述探针为带有负电荷的荧光标记单链DNA；
所述回升时间为45min；所述回升温度为37℃；所述检测的pH为5.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述microRNA检测还包括在加入探针后，避光静置。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发射波长为620-800 nm。
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