CN112522253A - 一种具有亚细胞靶向功能的纳米探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有亚细胞靶向功能的纳米探针及其应用。本发明的纳米探针，包括：亚细胞靶向探针、纳米颗粒和核酸探针；其中，亚细胞靶向探针和纳米颗粒之间通过共价偶合的方式连接，纳米颗粒和核酸探针之间通过共价偶合的方式连接。本发明以纳米颗粒为载体，通过亚细胞器靶向探针修饰，然后DNA功能化等方法构建了一种纳米探针，将该探针运用到细胞中，还可以靶向到亚细胞器内，并实现亚细胞内靶标如miRNA的检测。该纳米探针实现了对活细胞中亚细胞内部靶标的检测，检测方法简单，灵敏，不需要复杂的样品处理步骤、无需酶参与就可实现扩增反应，反应条件温和，分析方法对靶标具有良好的选择性。

Description

一种具有亚细胞靶向功能的纳米探针及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有亚细胞靶向功能的纳米探针及其应用。

背景技术

细胞是一个内部高度有序、组织复杂的结构，由各种亚细胞结构组成，包括细胞核、线粒体、溶酶体、自噬体、内质网、高尔基体等，研究细胞内这些亚细胞结构生物体的结构、功能等是揭示生命本质的重要途径。

线粒体是细胞内的一个重要亚细胞器，具有重要的生物学功能，参与多种疾病的产生和发展。例如，线粒体中的MicroRNAs不仅影响线粒体的代谢，还参与线粒体介导的细胞凋亡、调控线粒体的数目及形态等相关生理功能。因此，对线粒体中的相关物质的检测和定位对于了解相关生物过程有重要的意义。

传统的线粒体内miRNA的检测方法主要是通过微阵列芯片法，Northern印迹技术，反转录PCR法等，这些方法不仅需要对亚细胞器的提取、细胞固定，甚至需要酶参与，既不能保持细胞存活，也不能维持其原有的细胞成分，甚至不能提供亚细胞分辨率，因此无法进一步了解miRNA在亚细胞的定位和功能以及miRNA在细胞内的细微变化。

发明内容

本发明旨在解决上述现有技术问题之中的至少一种。为此，本发明提供了一种具有亚细胞靶向功能的纳米探针及其应用。

因此，本发明的目的之一在于提供一种纳米探针。

本发明的另一目的在于提供一种所述纳米探针的应用。

本发明所采用的技术方案如下文所述。

本发明的一个方面提供了一种纳米探针，包括：亚细胞靶向探针、纳米颗粒和核酸探针；其中，所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒之间通过共价偶合的方式连接，所述纳米颗粒和所述核酸探针之间通过共价偶合的方式连接。

根据本发明的一些实施方式，所述纳米颗粒优选为无机纳米颗粒。

本发明构建了一种特定结构的纳米探针，其中，亚细胞靶向探针用来特异性靶向目标亚细胞结构，使得纳米探针进入细胞后直接靶向到目标亚细胞结构；纳米颗粒是纳米探针能够进入细胞、进入线粒体的运输载体，也是协助亚细胞靶向探针实现靶向功能的重要物质核酸探针是用来特异性靶向亚细胞结构中的待测靶标。简而言之，细胞通过胞吞作用使纳米探针进入细胞内部，然后在亚细胞靶向探针的作用下靶向目标亚细胞结构，之后由于纳米探针和亚细胞结构之间的膜电位差值之间的静电作用，使得纳米探针进入亚细胞结构内部，最后在核酸探针的作用下，将纳米探针靶向到待测靶标，实现待测靶标的检测、定位或成像。

本发明的纳米探针能够靶向活细胞中亚细胞结构内部的目标物质，即能够在不破坏细胞结构的基础上，进入细胞内部的亚细胞结构中，实现细胞器中的目标物的灵敏检测、成像研究和/或准确定位。避免了细胞亚细胞的分离、酶扩增等繁琐的步骤。在活细胞内部检测，为研究亚细胞内部目标物的分布以及评估其水平提供了一个很有前途的工具，能够帮助了解目标物的亚细胞定位、功能和细微变化。

根据本发明的一些实施方式，所述纳米探针包括：

第一纳米探针，包括：亚细胞靶向探针、纳米颗粒和第一核酸探针；其中，所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒之间通过共价偶合的方式连接，所述纳米颗粒和所述第一核酸探针之间通过共价偶合的方式连接；

第二纳米探针，包括：亚细胞靶向探针、纳米颗粒和第二核酸探针；其中，所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒之间通过共价偶合的方式连接，所述纳米颗粒和所述第二核酸探针之间通过共价偶合的方式连接；

其中，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针为发夹结构，且两者可以发生杂交链反应。

根据本发明的一些实施方式，所述核酸探针(第一核酸探针和第二核酸探针)的具体核酸序列根据待测靶标进行设计；设计原则可以参考本领域HCR的常规设计原则。

杂交链反应(hybridization chain reaction,HCR)是一种简单高效的等温扩增技术，以核酸探针之间竞争杂交作为能量来源，自组装成一种核酸纳米结构，实现信号的放大。HCR的组成元件包括：引发探针和两条可杂交互补并带有粘性末端的发夹型DNA(H1和H2)。若无引发序列存在时，两条发夹型DNA可以稳定存在，一旦存在引发探针，发夹H1的二级结构被引发探针打开，H1释放的茎端会将发夹H2的二级结构打开，H2释放的茎端与引发探针的序列相同，又会打开H1的二级结构，H1和H2如此循环往复的被相互打开，最后形成一条含有缺口的杂交长双链共聚。本发明基于恒温下无酶参与的杂交链反应，将第一核酸探针和第二核酸探针设置为发夹结构，其能够在待测靶标的触发下引发杂交链反应，从而实现信号的放大。

根据本发明的一些实施方式，所述核酸探针上还修饰有荧光基团。

根据本发明的一些实施方式，所述第一核酸探针上修饰第一荧光基团，所述第二核酸探针上修饰第二荧光基团，且所述第一荧光基团和所述第二荧光基团之间可以发生荧光共振能量转移。

荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)是指两个不同的荧光发色基团，其中一个荧光发色基团(供体)的发射光谱与另一荧光发色基团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，当供体分子被激发后，受体与供体相距一定合适的距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量通过偶极子的介导转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。本发明在第一核酸探针和第二核酸探针上分别修饰第一荧光基团和第二荧光基团，在两个探针发生HCR后，两个荧光基团会因为靠近，导致荧光共振能量转移，从而实现对亚细胞器中待测靶标的成像分析检测。而且通过亚细胞器染色及FRET信号的共定位成像分析，实现对活细胞中亚细胞器内待测目标屋顶额灵敏检测、准确定位及成像研究。

根据本发明的一些实施方式，所述第一荧光基团-第二荧光基团可以选自Cy5-Cy3、Cy7-Cy5、Alexa488-Cy3、FITC-Rhodamine等。

根据本发明的一些实施方式，所述纳米颗粒带有正电荷。

本发明中纳米探针是通过与生物膜之间的膜电位差值的静电作用穿过生物膜，而当纳米颗粒为正电荷时，其穿过生物膜将更加容易。

根据本发明的一些实施方式，所述纳米颗粒为硅纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒、金纳米颗粒或银纳米团簇，优选为硅纳米颗粒。

纳米颗粒作为转运载体和协助靶向功能，此处优选为硅纳米颗粒。硅纳米粒子是一类生物相容性好、原料易得、制备方法简单，且易于功能化修饰的新型纳米材料。表面带有氨基的硅纳米粒子水溶性好、生物毒性低、易于与各种小分子或生物大分子反应，广泛开拓了硅纳米粒子的应用范围及领域。

根据本发明的一些实施方式，所述纳米颗粒的粒径为1～20nm，优选为4～10nm。

纳米颗粒的如果太大会导致过膜困难，太小则容易被排斥出来。因此选择合适的大小，可以起到更好的效果。

根据本发明的一些实施方式，所述亚细胞可以选自线粒体、溶酶体、自噬体、内质网或高尔基体。

根据本发明的一些实施方式，所述亚细胞靶向探针包括4-羧丁基三苯基溴化膦(TPP，靶向线粒体)、3-吗啉-4-基丙酸盐酸盐(靶向溶酶体)、4-(2-羟乙基)吗啉(靶向溶酶体)、TAT肽(靶向细胞核)、硫酸软骨素(靶向高尔基体)等。

本发明中，可以根据亚细胞种类的不同，筛选合适的亚细胞靶向探针。

本发明另一方面还提供了上述纳米探针在检测、定位或成像亚细胞内部待测靶标中的应用。

本发明通过构建可以穿膜并靶向亚细胞的纳米探针，实现了对亚细胞内部待测靶标的灵敏检测、准确定位及成像研究。与传统的探针相比，该纳米探针设计简单，且应用时避免了细胞亚细胞分离、酶扩增等繁琐的操作步骤，具有检测灵敏，无需酶参与，可在活细胞内检测的优点。

根据本发明的一些实施方式，当待测靶标为miR-494时，所用的纳米探针为：

第一纳米探针，亚细胞靶向探针-纳米颗粒-第一核酸探针-第一荧光基团；第二纳米探针，亚细胞靶向探针-纳米颗粒-第二核酸探针-第二荧光基团；

其中，所述第一核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，且所述第一荧光基团与所述第二荧光基团之间可以发生荧光共振能量转移。

根据本发明的一些实施方式，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针的摩尔比为1～4:1～4。优选为1:1。

根据本发明的一些实施方式，当亚细胞为线粒体时，所述亚细胞靶向探针为TPP。

本发明另一方面还提供了所述纳米探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒通过偶合反应连接起来，得到连接有亚细胞靶向探针的纳米颗粒；

(2)将所述核酸探针与所述连接有亚细胞靶向探针的纳米颗粒进行偶合反应，即得纳米探针。

根据本发明的一些实施方式，所述亚细胞靶向探针带有羧基反应位点，所述纳米颗粒带有氨基反应位点。

根据本发明的一些实施方式，所述核酸探针带有羧基反应位点。

本发明另一方面还提供了所述纳米探针检测活细胞中亚细胞器内部靶标的方法，包括将纳米探针与细胞共培养的步骤。

根据本发明的一些实施方式，在纳米探针与细胞共培养之前，还包括用转运载体将靶标的cDNA序列转入细胞的步骤。将靶标的cDNA序列转入细胞可以使细胞质中的靶标被反应掉，使得纳米探针进入细胞后不会与细胞质中的靶标反应，而是进入细胞后靶向亚细胞器，然后进入亚细胞器并与靶标反应。

本发明的有益效果：

本发明以氨基纳米颗粒为载体，通过亚细胞器靶向修饰，然后DNA功能化等方法构建了一种无需转运载体、无酶参与，且恒温下即可实现信号扩增的纳米探针，将该探针运用到细胞中，还可以靶向到亚细胞器内，并实现亚细胞内靶标如miRNA的检测。该方法较现有的细胞内miRNA检测方法，具有以下优点：

1、对靶标的检测方法简单，灵敏，不需要复杂的样品处理步骤、无需酶参与就可实现扩增反应，反应条件温和，分析方法对靶标具有良好的选择性。

2、实现对活细胞亚细胞内靶标的检测。根据亚细胞器的特点，设计具有亚细胞靶向的纳米探针，并将两种标记探针运送到细胞内，同时保证纳米粒子具有较小的粒径和正电荷的性质可以进入亚细胞器。在纳米粒子表面进行DNA功能化修饰，保证进入线粒体的探针可以实现信号放大，且小粒径纳米颗粒的存在不影响HCR反应，进而实现亚细胞器内miRNA的检测。

3、设计方法具有普适性，根据靶标的序列，设计不同的发卡探针即可实现不同靶标的检测。

4、均相恒温检测条件。方法为均相反应，且在恒温条件下无需精确热循环仪器，方法表现出良好精确性，重复性和稳定性，适宜发展为试剂盒并向市场推广。

附图说明

图1为纳米探针在线粒体内miRNA原位成像检测示意图；

图2为MALDI-TOF-TOF-MS表征谱图；

图3为MTSiNs和DNA-MTSiNs透射电镜图；

图4为DNA-MTSiNs及H1-Cy5，H2-Cy3的聚丙烯酰氨凝胶电泳表征图；

图5为DNA-MTSiNs在不同波长激发下的荧光发射光谱图；

图6为HCR反应的荧光光谱图和PAGE图；

图7为不同条件下HCR反应的FRET图和PAGE图；

图8为DNA-MTSiNs探针在不同条件下的HCR反应荧光光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；

图9为不同条件下的HCR的荧光光谱图和FRET效率图；

图10为细胞与DNA-MTSiNs共孵育24h的细胞毒性图；

图11为DNA-MTSiNs亚细胞成像图；

图12为H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs共同在细胞内线粒体中成像图；

图13为DNA-MTSiNs探针的亚细胞成像图；

图14为荧光共定位分析图；

图15为H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP在细胞内成像图；

图16为不同设计探针在HeLa细胞中的成像图；

图17为DNA-MTSiNs探针的亚细胞成像图。

具体实施方式

本发明一些实施方式中，选择亚细胞器线粒体作为目标亚细胞结构，选择miRNA作为靶标，研究了纳米探针对活体细胞中线粒体内部miRNA的检测。

MicroRNAs(miRNAs)是一类真核生物中广泛存在的内源性非编码RNA，由18-25个核苷酸组成。miRNA通过抑制靶mRNA翻译或促进其降解调控生物体生理病理过程，是一种重要的疾病诊断标志物。线粒体是细胞内非常重要的细胞器，线粒体是双层膜结构，个体大小不一、且在细胞内分布不均匀，给线粒体内miRNA的检测带来困难。实现活细胞中线粒体内miRNA的检测不仅需要探针可以进入活细胞，并且还要在细胞内准确靶向到线粒体，实现在线粒体内miRNA的检测。常规细胞内miRNA的检测方法大多需要细胞固定、酶参与、处理步骤繁琐，无法实现对活细胞亚细胞器内miRNA的检测。而本发明克服了上述问题，根据线粒体的结构及膜电位性质，采用水溶性、且易于修饰的纳米颗粒为载体，并对其进行线粒体靶向基团TPP修饰。在基于具有线粒体靶向作用的纳米颗粒(MTSiNs)的基础上，通过EDC/NHS偶合反应将两条含有羧基反应位点的DNA发卡探针分别修饰到上述纳米颗粒上，得到两个DNA功能化纳米探针(DNA-MTSiNs)。在纳米粒子载体作用下，修饰探针可以进入细胞，在线粒体靶向基团靶向作用下，探针可以靶向线粒体，根据探针与线粒体膜电位之间的静电作用，探针可以进入线粒体，且小粒径、带正电荷的硅纳米粒子更有利于进入线粒体。当检测目标物存在时，将触发两个纳米探针链杂交反应，实现信号扩增放大，从而对分析目标物实现高灵敏检测，因此可以实现在活细胞的细胞器线粒体中miRNA检测。如图1所示，为纳米探针在线粒体内miRNA原位成像检测示意图，其中(a)为纳米颗粒与线粒体靶向探针共价偶合再被核酸探针修饰形成纳米探针示意图，(b)为纳米探针进入细胞，并进一步靶向到线粒体示意图，(c)为纳米探针在线粒体内靶标的触发下发生HCR扩增反应示意图。可以看出，基于构建的纳米探针的纳米载体优势，探针可以不需要转运试剂而被细胞吞噬，由于纳米探针具有线粒体靶向基团，且合成的硅纳米粒子颗粒较小的优势，因此纳米荧光探针会继续靶向进入线粒体，并在线粒体内目标物触发下引发链杂交反应(HCR)，实现荧光信号放大。

以下结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

其中，HPLC纯化的核酸探针由上海生工生物工程公司合成，DEPC处理水、PBS(pH7.4)缓冲溶液、DMEM高糖基细胞培养液、RPMI Medium1640细胞培养液、均购自上海生物科技有限公司(上海，中国)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基亚砜(DMSO)、氯化钠、乙二胺、乙腈均购自阿拉丁试剂有限公司(上海，中国)。Mito-Tracker Green购买于碧云天生物试剂有限公司，4-羧丁基三苯基溴化膦(TPP)、丙烯酰胺40％、过硫酸铵、TEMED购于美国Sigma-Aldrich试剂公司(美国)。UNIQ-10Spin Column Oligo DNA Purification Kit购买于上海生物工程技术有限公司。实施例中使用的部分物质的核苷酸序列如表1所示。

表1实施例中用到的核苷酸序列

实施例1.带有线粒体靶向探针的硅纳米颗粒(MTSiNs)制备

准确称取0.6g TPP，加入1mL二甲基亚砜(DMSO)磁力搅拌溶解，溶解完全后，再分别将0.3g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，0.36g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入上述澄清的溶液中，继续搅拌30min。然后继续加入90mg/mL纯化的硅纳米粒子(SiNPs)，将混合反应液放入37℃的水浴锅中反应30min后，再置于50℃水浴锅中水浴反应10h，即可得到修饰产物(MTSiNs)。

纯化：按乙腈：MTSiNs体积比10:1的比例，充分萃取后离心分离，转速10000rpm，离心10min，将提纯的产物进行55℃真空干燥24h。

实施例2.DNA功能化靶向线粒体纳米探针(DNA-MTSiNs)制备

在制备MTSiNs的基础上，首先将两条DNA发卡核酸链H1-Cy5和H2-Cy3用灭菌水DEPC溶解成浓度为100μM母液并于4℃冰箱保存备用。移取20μL H1-Cy5(10μM)溶液到1.0mLEP试管中，然后向试管中分别加入20μL EDC(10mM)，10μL NHS(1mM)，室温下活化30min，再加入50μL 1.0mg/mL的MTSiNs溶液，混合均匀后，使用锡纸包裹试管，室温下避光继续反应过夜。

纯化：反应结束后，反应混合溶液使用核酸纯化小柱进行纯化获得H1-Cy5-MTSiNs。按照相同的操作步骤得到DNA功能化的探针H2-Cy3-MTSiNs，制备的探针置于-20℃保存备用。

实施例3.DNA-MTSiNs探针表征

1、DNA-MTSiNs探针的质谱表征

MTSiNs表面富含氨基，为了能在MTSiNs表面继续修饰DNA发卡探针，实验设计在两条发卡探针的末端均修饰有羧基，通过EDC/NHS偶合反应，发卡探针可被修饰在线粒体靶向的纳米载体上。

以饱和3-HPA(3-羟基吡啶甲酸)水溶液，柠檬酸氢二铵溶液为基质，通过MALDI-TOF-MS，对修饰产物进行了表征。

如图2所示，为MALDI-TOF-MS表征图谱，其中，H1-Cy5的分子量为15663，修饰后变化为15974，分子量相差331；H2-Cy3的分子量为15614，修饰后变化为15944，分子量相差330。说明在纳米颗粒载体上所修饰的DNA的量基本相同，从分子量差值上推测，每个纳米颗粒载体上可能修饰了不止一条DNA，在质谱图上给出的是DNA分子量的一个平均化结果，因此才导致分子量差值较小。

2、DNA-MTSiNs探针的TEM表征

用去离子水将H1-Cy5-MTSiNs，H2-Cy3-MTSiNs，MTSiNs溶解然后超声波分散30min，将分散液滴加在超薄碳支持膜铜网上(300目)，静置，待溶剂(去离子水)挥发后，真空箱干燥12h。转移至透射电子显微镜观察粒径、形貌结构及高分辨形貌。工作电压300kV。利用高分辨透射电镜观察制备的靶向线粒体纳米粒子及DNA功能化纳米探针的粒径及形貌。

如图3所示为MTSiNs和DNA-MTSiNs透射电镜图，其中，(a)为MTSiNs的透射电镜图，可以看出，MTSiNs基本呈现规则球形，粒径较小，并具有良好分散性；(b)为H1-Cy5-MTSiNs的透射电镜图，(c)为H2-Cy3-MTSiNs透射电镜图，可以清晰的观察到在纳米粒子的周围分布着一层“云”状阴影，这是由于DNA修饰在纳米粒子表面后随机分布导致，对靶向纳米载体，即使修饰了DNA后，纳米载体自身的形状和粒径大小并无改变，还是呈现规则球形。并且分散性良好，没有发生团聚现象。

3、DNA-MTSiNs探针的聚丙烯酰氨凝胶电泳表征

聚丙烯酰氨凝胶电泳具有极高分辨率，范围覆盖10-3000bp的DNA片段。在适当条件下，可以区分碱基个数相差几个DNA。为了进一步验证DNA发卡探针成功修饰到纳米粒子表面，实验分别选择单独的DNA发卡探针作为对照，利用垂直板对修饰的DNA功能化的探针进行了凝胶电泳分析。

结果如图4所示，其中，泳道1，2，3，4分别对应于H1-Cy5-MTSiNs，H1-Cy5，H2-Cy3-MTSiNs和H2-Cy3。根据DNA分子量大小，在每个泳道中迁移速率不同，分子量小的单纯DNA链跑在泳道最下端，修饰后的产物，由于分子量较大而迁移速率减慢，因此电泳条带显示在较上端。与单独H1-Cy5，H2-Cy3发卡探针相比，修饰后DNA功能化探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs由于分子量增大，因此，两者的电泳条带均落后于未修饰发卡探针。电泳实验结果也再次说明H1-Cy5，H2-Cy3发卡探针已被成功修饰到MTSiNs表面。

4、DNA-MTSiNs探针的荧光光谱分析

由于发卡探针H1-Cy5和H2-Cy3表面分别修饰了不同激发荧光团，另一方面，MTSiNs也是一种具有优越的荧光性能的纳米材料。当将两者通过EDC/NHS偶合反应连接在一起时，可以通过荧光光谱的变化验证偶合反应是否成功。

荧光发射光谱如图5所示，其中，(a)为H1-Cy5-MTSiNs分别在350和600nm激发下荧光发射光谱，可以看出，在600nm激发时，在668nm处有非常强的发射峰，为H1-Cy5发射峰；对H1-Cy5-MTSiNs在350nm下激发时，可以观察到在445和668nm均出现了发射峰，分别对应于MTSiNs和H1-Cy5的发射峰。(b)为H2-Cy3-MTSiNs分别在350和538nm激发下荧光发射光谱，在538nm激发下，只在566nm处出现了H2-Cy3发射峰；当对H2-Cy3-MTSiNs在350nm下激发时，可以看到分别在445和566nm处出现了MTSiNs和H2-Cy3的发射峰。通过荧光光谱分析可以证明发卡探针H1-Cy5，H2-Cy3已经被成功修饰到了MTSiNs表面。

实施例4.核酸探针HCR反应的可行性分析和条件优化

1、核酸探针(H1-Cy5,H2-Cy3)HCR可行性分析

首先利用PBS(pH＝7.4)将两条发卡探针H1-Cy5，H2-Cy3分别稀释成1.0μM的溶液备用，目标链(Target)的浓度也配成1.0μM备用。按照表2配置各组溶液，将H1-Cy5，H2-Cy3终浓度控制为200nM，MgSO₄终浓度为10μM，目标链的终浓度为200nM，在37℃水浴反应3h，然后在荧光光谱仪上测试反应液的荧光强度。

表2 HCR反应试剂及体积

取反应后溶液至微量石英比色皿中进行荧光光谱检测。设置Cy3通道激发波长为538nm，发射波长范围为555～700nm，激发和发射狭缝均设置为10nm。Cy5通道激发波长为635nm，发射波长范围为655～800nm，激发和发射狭缝设置为10nm和5nm。设置FRET通道激发波长为538nm，发射波长范围为650～750nm，激发和发射狭缝均设置为10nm。

HCR反应完成后，对反应后的产物进行了聚丙烯酰氨凝胶电泳分析。

测试结果如图6所示，其中(a)为各组溶液反应后荧光光谱图，可以看出，当有目标链时，会触发了HCR反应发生，并发生了强烈的荧光共振能量转移(FRET)，荧光共振能量转移的效率(F_A/F_D)达到85％，F_D代表受体不存在时供体的荧光强度；F_A代表供体存在时受体的荧光强度；显而易见，没有目标链时，H2-Cy3与H1-Cy5之间几乎不产生FRET荧光信号，背景信号较低，较低的背景信号不会对产生的荧光信号造成干扰。说明只有目标链时，才可以打开发卡探针，引发链杂交反应，使荧光信号得到放大。(b)为各组溶液反应后的聚丙烯酰氨凝胶电泳分析，其中i泳道代表组别4，ii泳道代表组别3，iii泳道代表组别1，iv泳道为组别2，可以看出，在加入目标链(Target)的i泳道，出现较多条带，说明目标链触发了HCR反应，产生了杂交链反应片段。而在ii，iii和iv泳道中几乎只有一条明亮的条带，说明没有目标链时，HCR反应很难发生。

2、核酸探针(H1-Cy5,H2-Cy3)HCR反应条件优化

(1)核酸探针反应比例和反应时间优化

在HCR反应可行性基础上(即在表2中组别3和4的基础上)，实验对DNA发卡探针H1-Cy5、H2-Cy3用量比例进行了考察和优化。设置反应时间为3h，固定探针H1-Cy5的浓度，设置探针H1：H2比例依次为4：1，3：1，2：1，1：1，1：2，1：3，1：4。在37℃条件下反应3h，反应结束后对反应溶液进行荧光强度测试，并进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)分析。

反应时间是HCR反应的一个关键因素，反应时间长短会影响反应的最终效率，分别考察了反应时间为1h、2h、3h、4h、5h和6h的荧光强度变化，并进行聚丙烯酰氨凝胶电泳分析。

如图7所示，为不同条件下HCR反应FRET图和PAGE图；其中，(a)为不同核酸比例HCR反应后FRET效率图，Target为有目标链存在时，Blank为无目标链存在时，可以看出，H1-Cy5/H2-Cy3为1：1时，反应效率最高，之后随着反应中能量供体H2-Cy3增加，反应效率又有逐渐增强的趋势，为了达到最佳反应效率，后续反应中选择比例为1：1。(b)为不同核酸比例HCR反应后的聚丙烯酰氨凝胶电泳图，泳道1为marker，2-8为核酸探针不同比例泳道，当两个发卡DNA探针比例为1：1时，反应最彻底，而在其他比例条件下，DNA探针会有一定量剩余。为了节约生物样品，保持最佳反应效率，实验选择H1-Cy5：H2-Cy3比例为1：1。(c)为不同反应时间HCR反应后FRET效率图，Target为有目标链存在时，Blank为无目标链存在时，可以看出，反应开始3个小时内，反应速率随反应时间的延长而逐渐增加，之后继续延长反应时间，反应速率变缓，甚至当反应时间延长到5个小时后，反应效率反而出现下降趋势，为了得到最佳的反应效率，反应时间选择3h。(d)为不同反应时间的HCR反应后聚丙烯酰氨凝胶电泳图，可以看到，泳道1为DAN marker，泳道2-7依次为反应时间1h，2h，3h，4h，5h，6h，在不同反应时间内，反应体系均发生了HCR扩增反应，有非常明显的扩增产物产生。

综合考虑，实验在后续反应中选择H1-Cy5：H2-Cy3比例为1:1，反应时间为3h。

实施例5.纳米探针(DNA-MTSiNs)HCR反应的相关分析

1、纳米探针(H1-Cy5-MTSiNs,H2-Cy3-MTSiNs)HCR反应的可行性分析

为了更进一步证明所构建的DNA功能化纳米探针H1-Cy5-MTSiNs，H2-Cy3-MTSiNs也可以发生HCR反应而能应用于下一阶段实际样品的分析，实验通过荧光光谱分析和聚丙烯酰胺凝胶电泳对所构建的H1-Cy5-MTSiNs，H2-Cy3-MTSiNs纳米探针进行了分析方法可行性验证。

根据前期已优化好的条件，选择所构建的浓度接近的两个探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs，然后加入MgSO₄，目标链target，在37℃下反应3h。

如图8所示为DNA-MTSiNs探针在不同条件下HCR反应荧光光谱图和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图；(a)和(b)中，i.H1-Cy5-MTSiNs+H2-Cy3-MTSiNs+target，ii.H1-Cy5-MTSiNs+H2-Cy3-MTSiNs，iii.H1-Cy5-MTSiNs，iv.H2-Cy3-MTSiNs；(a)为荧光光谱图，可以看出，DNA功能化探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs依然可以发生HCR反应，并且背景信号较低；(b)为PAGE图，通过分析可知，在target存在时，target可以触发DNA功能化探针产生HCR反应，因此有明显扩增产物生成。这一实验结果表明，构建的DNA功能化探针在HCR反应中是可行的，同时为在实际样品中反应奠定了基础。

2、纳米探针(H1-Cy5-MTSiNs,H2-Cy3-MTSiNs)对目标链检测的灵敏性和特异性分析

制备DNA功能化探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs；配制一系列不同浓度目标链(100fM，500fM，1pM，100pM，500pM，1nM，10nM，1μM)，并将DNA功能化探针终浓度固定在200-500nM之间，分别移取5μL探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs，然后依次分别加入不同浓度目标链target，5μLMgSO₄溶液，然后用PBS缓冲溶液定容溶液总体积为50μL，使检测目标终浓度依次为0，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，1nM，10nM，100nM，设置反应温度为37℃，反应时间3h。

一个好的分析方法除了要求分析简单，快捷，灵敏度高，还要求对分析目标物的高选择性，即特异性。实验设计了含有A，G，C三个单碱基错配的目标链A-mismatched，G-mismatched，C-mismatched。根据表格3设计的实验条件，控制溶液的总体积为50μL，在37℃条件下恒温反应3h。

表3选择性反应试剂及体积

如图9所示，为不同条件下HCR的荧光光谱图和FRET效率图；具体地，(a)为在各种不同浓度miR-494存在下荧光光谱图，可以看出，在668处的峰高从下至上目标链浓度依次为0，1fM，10fM，100fM，1pM，10pM，100pM，1nM，10nM，100nM；也就是说，随着target浓度增加，FRET信号逐渐增强；(b)为FRET效率对浓度对数作图的线性拟合方程，在检测浓度1fM-10pM范围内，检测target浓度对数与FRET荧光响应之间有良好线性关系，线性拟合方程为F＝0.08424+0.02401lgC，线性相关系数R²＝0.9923，检测限为0.34fM；(a)和(b)表明，与其他扩增分析方法相比，本方法不需要复杂设计，操作简单，不需要酶参与，方法检测限也具有一定的可比性。(c)为特异性试验的荧光光谱图，其中，i.H1-Cy5，ii.H2-Cy3，iii.H1-Cy5+H2-Cy3，iv.A-mismatched，v.G-mismatched，vi.C-mismatched，vii.H1-Cy5+H2-Cy3+miR-494；(d)为特异性试验中各组的FRET效率图，从(c)和(d)中可以看出，错配碱基序列目标物几乎没有触发HCR反应，因此发生荧光共振能量转移效率非常低，明显低于目标链target产生的FRET荧光信号，说明本文实验所设计的发卡探针对目标链具有很强的选择性。

实施例6.纳米探针的细胞毒性分析

为了验证制备DNA功能化探针细胞毒性，实验选择人宫颈癌细胞HeLa为测试对象，将HeLa细胞按照每孔细胞密度为7×10³进行种入96孔板。在5％CO₂，37℃培养箱中过24h观察细胞状态。将制备的H1-Cy5-MTSiNs用1×PBS溶液配制成不同初始浓度梯度(0，1590，3280，6560nM)溶液，同时将H2-Cy3-MTSiNs用1×PBS溶液配制成不同初始浓度梯度(0，1680，3350，6700nM)的溶液。待细胞孵育24h后，按每孔10μL加入不同浓度DNA-MTSiNs，同时补入90μL细胞培养液继续培养24h，根据MTT法测定DNA-MTSiNs对细胞存活率的影响。

实验结果如图10所示，其中，(a)为不同浓度H1-Cy5-MTSiNs细胞毒性分析，(b)为不同浓度H2-Cy3-MTSiNs细胞毒性分析，可以看出，制备的两种探针与细胞共同孵育24h后，细胞存活率依然超过95％，说明DNA-MTSiNs对细胞几乎不产生毒性。DNA-MTSiNs超低的细胞毒性为后续细胞实验的开展提供了良好平台。

实施例7.纳米探针的细胞成像可行性分析

实验选择HeLa细胞进行铺板培养，将DNA功能化探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs分别加入到HeLa细胞的不同培养皿中(纳米探针的终浓度为500nM)，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养3h，取出培养液，用37℃温育的1×PBS洗涤细胞3次，再向每个培养皿中分别加10μL DMSO溶解的线粒体染料Mito-TrackerGreen，然后补至150μL无血清培养基，在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养30min后，4℃预冷的1×PBS洗涤细胞3次，然后用激光共聚焦扫描显微镜进行成像观察。

如图11所示，DNA-MTSiNs亚细胞成像图，其中(a)为H1-Cy5-MTSiNs亚细胞成像图，可以看出，线粒体染色Mito-Track Green通道中有明亮蓝色荧光，说明细胞的线粒体已被成功染色，在H1-Cy5-MTSiNs通道中可以观察到有明亮红色荧光信号，在H1-Cy5-MTSiNs与Mito-Track Green的Merge通道中可以看到红色和蓝色荧光信号有明显重合区域，说明修饰探针H1-Cy5-MTSiNs可以进入细胞并同时靶向到线粒体内。(b)为H2-Cy3-MTSiNs亚细胞成像图，Mito-Track Green通道中有明亮蓝色荧光，也可以看到H2-Cy3-MTSiNs绿色荧光信号，在H2-Cy3-MTSiNs与Mito-Track Green的Merge通道中可以看到蓝色和绿色荧光信号有明显重合区域，说明H2-Cy3-MTSiNs可以进入细胞并同时靶向了线粒体。而在两者的FRET通道中均没有出现荧光信号，实验结果表明只有单个探针存在无法实现对目标物检测。

进一步的，实验将H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs两个探针和HeLa细胞一起孵育时间，37℃孵育3h，然后再用Mito-Track Green对线粒体进行染色30min，用预冷的PBS洗涤细胞三次，激光共聚焦扫描显微镜下成像。

如图12所示，可以看到探针H2-Cy3-MTSiNs和H1-Cy5-MTSiNs分别在Cy3通道和Cy5通道出现明亮绿色和红色荧光信号；在线粒体染色Mito-Track Green通道中有明亮蓝色荧光，说明细胞的线粒体已被成功染色，在FRET通道看到有黄色荧光信号，说明两个探针进入细胞后在细胞内miR-494的存在下引发了HCR反应，并发生了能量共振转移，产生FRET信号；对FRET通道和Mito-Track Green通道进行叠加，可以在Merge通道中看到FRET黄色荧光信号和Mito-Track Green蓝色荧光信号有部分良好的重叠(图中虚线椭圆区域)，说明HCR反应是在线粒体内发生，Bright为细胞的明场，可以看到细胞的形态。

实施例8.纳米探针的亚细胞内部靶标成像的优化

本发明选择的靶标miR-494除了在HeLa细胞的线粒体内存在之外，也存在于HeLa细胞质内。为了避免探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs在进入细胞后能够不受细胞质内miR-494的干扰，而能够靶向进入线粒体并实现线粒体内miR-494检测。采用脂质体Lipo3000转运方式首先向细胞内转运miR-494互补链cDNA的方法使细胞质中miR-494与cDNA发生碱基配对反应，形成双链DNA(dsDNA)，然后再将探针H1-Cy5-MTSiNs，H2-Cy3-MTSiNs与细胞一起孵育。同时以不转运cDNA进入HeLa细胞的实验作对比。

如图13所示，其中Mito-Track Green通道中有明亮蓝色荧光，Cy3通道为明亮绿色荧光，Cy5通道为红色荧光，FRET通道为黄色荧光，Merge通道为FRET通道的黄色和Mito-Track Green通道的蓝色荧光的叠加；(a)为无cDNA时纳米探针亚细胞成像图，(a)所示，当探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs进入细胞后，由于细胞质中也存在检测目标物miR-494，因此，在探针靶向线粒体过程中，细胞质内miR-494会触发HCR反应，从而在细胞质中产生大量FRET信号，并且因为HCR反应的触发，导致细胞质中还存在大量探针。(b)为加入cDNA后纳米探针亚细胞成像图，细胞内发生FRET信号明显减弱，通过对FRET荧光区域与Mito-Track Green荧光染色区域的荧光共定位分析，可以发现FRET信号和的荧光信号有非常高叠加。

如图14所示，我们对FRET信号与Mito-Track Green荧光信号进行共定位荧光分析，通过分析，(a)图为在图13的(a)组Merge通道的选定荧光成像区域，共定位分析的皮尔逊相关系数为0.84，说明有探针已经进入线粒体，并在线粒体内发生了HCR反应；(b)图为在图13的(b)组Merge通道的选定荧光成像区域，共定位分析的皮尔逊相关系数为0.92。说明通过调控降低细胞质中miR-494含量，提高探针在线粒体内检测目标物的几率的方法是可行的，可以实现对亚细胞器线粒体内miRNA准确成像检测。

实施例9.纳米探针中纳米颗粒作用探讨

为了验证MTSiNs纳米粒子构建DNA功能化探针中的载体功能。实验采用乙二胺(EDA)作为连接DNA发夹探针与TPP中间体，采用EDC/NHS共价偶联反应制备了一种复合探针(DNA-EDA-TPP)。然后将H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP探针与HeLa细胞孵育3h，用激光共聚焦成像记录荧光信号。

结果如图15所示，可以看到除了能观察到Mito-Track Green通道中线粒体染色的蓝色荧光和Merge通道中Mito-Track Green和FRET叠加后仅有的蓝色荧光，在Cy3通道、Cy5通道和FRET通道均无荧光。也就是说，在细胞中几乎看不到探针H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP的荧光信号，说明H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP在和细胞孵育一段时间之后，并没有进入细胞，Bright通道为细胞明场图。实验结果表明，在设计DNA功能化探针时，MTSiNs纳米粒子作为DNA运输载体非常必要。

进一步地，为了验证H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP在细胞内是否能够靶向线粒体，实验用脂质体Lipo3000分别将cDNA(500nM)，H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP转运到HeLa细胞并孵育3h。

为了验证在硅纳米粒子上修饰TPP对线粒体具有靶向能力，实验将cDNA，单独H1-Cy5和H2-Cy3发卡探针分别通过脂质体转运到HeLa细胞，37℃孵育3h。

结果如图16所示，其中(a)和(b)中，Mito-Track Green通道中有明亮蓝色荧光，Cy3通道为明亮绿色荧光，Cy5通道为红色荧光，FRET通道几乎无荧光；Merge通道为FRET通道和Mito-Track Green通道的叠加，仅有蓝色荧光；(a)为加入cDNA后，H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP在细胞中成像；可以看出，在脂质体转运作用下，在细胞质中可以分别观察到H1-Cy5-EDA-TPP红色荧光信号和H2-Cy3-EDA-TPP绿色荧光信号；同时，由于过量cDNA加入，导致在细胞内几乎看不到FRET荧光信号，在线粒体染色区域，除了微弱背景干扰，几乎不产生FRET信号。这是由于TPP和EDA分子相对DNA发夹个体较小，容易被复杂的DNA发夹覆盖或包裹，导致H1-Cy5-EDA-TPP和H2-Cy3-EDA-TPP探针无法靶向线粒体，实验结果也再次说明在构建线粒体靶向的DNA功能化探针中，硅纳米粒子的作用不可替代，小分子的中间连接体不能运载DNA探针进入细胞，也不能使DNA探针靶向线粒体。(b)为加入cDNA后，H1-Cy5和H2-Cy3在细胞中的成像；从Cy3通道和Cy5通道分别可以观察到强烈的绿色荧光信号和红色荧光信号，而在细胞线粒体染色区域内几乎观察不到FRET荧光信号的存在，这是由于加入cDNA反应了细胞质内miR-494之后，由于单独的H1-Cy5和H2-Cy3探针没有线粒体靶向功能，因此无法靶向进入线粒体，导致不能产生FRET荧光信号。

上述实验结果表明，硅纳米粒子在DNA功能化的纳米探针中的作用必不可少，不仅可以作为DNA转运载体，同时也为线粒体靶向修饰提供了修饰位点。TPP具有较强的线粒体靶向功能，没有靶向修饰的DNA探针无法靶向到线粒体。

实施例10.纳米探针中在不同细胞中的成像

为了进一步评估DNA-MTSiNs在线粒体miR-494成像检测中的可行性，实验还选择了肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7和正常的乳腺细胞MCF-10A三种不同细胞进行了亚细胞成像分析。根据文献报道，在宫颈癌细胞HeLa线粒体内存在miR-494，而在肺癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7和正常乳腺细胞MCF-10A线粒体内是否存在miR-494还未有相关文献报道。按照亚细胞成像操作方法，实验首先向三种细胞中分别用脂质体将cDNA转运进入细胞质内，然后再将探针H1-Cy5-MTSiNs和H2-Cy3-MTSiNs分别加入到细胞培养皿中继续孵育。

结果如图17所示，Mito-Track Green通道中有蓝色荧光，Cy3通道为绿色荧光，Cy5通道为红色荧光，FRET通道几乎无荧光；Merge通道为FRET通道和Mito-Track Green通道的叠加，仅有蓝色荧光；其中(a)为A549细胞，(b)为MCF-10A细胞，(c)为MCF-7图；可以看出，miR-494的表达水平和分布在不同细胞系中有显著差异。尽管单个探针的荧光信号可以从A549，MCF-7和MCF-10A细胞中观察到，但在FRET通道中几乎看不到荧光信号，说明探针在上述三种细胞线粒体内没有检测目标物miR-494，因此没有触发HCR反应。这一结果与之前报道的只有HeLa细胞线粒体中含有miR-494结果一致。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种具有亚细胞靶向功能的纳米探针及其应用

<130> 111

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

agagaagaca acacggacaa cctgactgaa taggttgtcc gtgttgtc 48

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

aggttgtccg tgttgtcttc tctgacaaca cggacaacct attcagtc 48

<210> 3

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

agguuguccg uguugucuuc ucu 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

aggttgtccg tgttgtcttc tct 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

agagaagaca acacggacaa cct 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

aggttgtccg tggtgtcttc tct 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

aggttgtccg tgctgtcttc tct 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

aggttgtccg tgatgtcttc tct 23

Claims (10)

1.一种纳米探针，其特征在于，包括：亚细胞靶向探针、纳米颗粒和核酸探针；其中，所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒之间通过共价偶合的方式连接，所述纳米颗粒和所述核酸探针之间通过共价偶合的方式连接。

2.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述纳米探针包括：

第一纳米探针，包括：亚细胞靶向探针、纳米颗粒和第一核酸探针；其中，所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒之间通过共价偶合的方式连接，所述纳米颗粒和所述第一核酸探针之间通过共价偶合的方式连接；

第二纳米探针，包括：亚细胞靶向探针、纳米颗粒和第二核酸探针；其中，所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒之间通过共价偶合的方式连接，所述纳米颗粒和所述第二核酸探针之间通过共价偶合的方式连接；

其中，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针为发夹结构，且两者可以发生链杂交反应。

3.根据权利要求2所述的纳米探针，其特征在于，所述第一核酸探针上修饰第一荧光基团，所述第二核酸探针上修饰第二荧光基团，且所述第一荧光基团和所述第二荧光基团之间可以发生荧光共振能量转移；优选地，所述第一荧光基团-第二荧光基团选自Cy5-Cy3、Cy7-Cy5、Alexa488-Cy3、FITC-Rhodamine。

4.根据权利要求1至3任一项所述的纳米探针，其特征在于，所述纳米颗粒带有正电荷；优选地，所述纳米颗粒为硅纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒、金纳米颗粒或银纳米团簇，更优选为硅纳米颗粒；优选地，所述纳米颗粒的粒径为1～20nm，优选为4～10nm。

5.根据权利要求1至3任一项所述的纳米探针，其特征在于，所述亚细胞可以选自线粒体、溶酶体、自噬体、内质网或高尔基体。

6.根据权利要求1至3任一项所述的纳米探针，其特征在于，所述亚细胞靶向探针选自4-羧丁基三苯基溴化膦、3-吗啉-4-基丙酸盐酸盐、4-(2-羟乙基)吗啉、TAT肽或硫酸软骨素。

7.如权利要求1至6任一项所述的纳米探针在检测、定位或成像亚细胞内部待测靶标中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，当待测靶标为miR-494时，所用的纳米探针为：第一纳米探针，亚细胞靶向探针-纳米颗粒-第一核酸探针-第一荧光基团；第二纳米探针，亚细胞靶向探针-纳米颗粒-第二核酸探针-第二荧光基团；其中，所述第一核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，且所述第一荧光基团与所述第二荧光基团之间可以发生荧光共振能量转移。

9.如权利要求1至6任一项所述的纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将所述亚细胞靶向探针和所述纳米颗粒通过偶合反应连接起来，得到连接有亚细胞靶向探针的纳米颗粒；

(2)将所述核酸探针与所述连接有亚细胞靶向探针的纳米颗粒进行偶合反应，即得纳米探针。

10.如权利要求1至6任一项所述的纳米探针检测、定位或成像活细胞中亚细胞器内部靶标的方法，其特征在于，包括将纳米探针与细胞共培养的步骤；优选地，在纳米探针与细胞共培养之前，还包括用转运载体将靶标的cDNA序列转入细胞的步骤。

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