CN105004703B - 利用dapi嵌入和释放模拟dna纳米折纸结构作为药物载体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过DNA滚环扩增技术以及DNA折纸术构建的DNA纳米折纸结构，同时利用有DNA双链结合特性以及细胞膜穿透特性的荧光染料DAPI对DNA纳米折纸结构进行标记跟踪，实现实时监控以及模拟DNA纳米折纸结构作为药物载体的载药、缓释过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像等领域。
Description
技术领域
本发明属于DNA纳米技术发展、纳米材料功能化及应用领域，涉及一种通过DNA滚环扩增技术以及DNA折纸术构建的DNA纳米折纸结构，同时利用有DNA双链结合特性以及细胞膜穿透特性的荧光染料DAPI对DNA纳米折纸结构进行标记跟踪，实现实时监控以及模拟DNA纳米折纸复合结构作为药物载体的载药、缓释过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像等领域。
背景技术
近年来，恶性肿瘤已成为全球范围内严重危害人类健康及生命的重大疾病之一。调查数据显示，在发展中国家，癌症的死亡率在所有疾病的死亡率中位居第二位。世界各国投入大量的人力、物力用于肿瘤的预防、诊断和治疗。近年来快速发展的纳米生物技术，为目前抗肿瘤药物载体领域提供了强有力的手段。纳米材料作为新一代的药物载体的研究正蓬勃发展，它本身能改善药物的水溶性、提高药物的稳定性以及实现药物缓慢控制释放、靶向定位、以及多靶向治疗等。目前利用纳米颗粒或纳米结构作为抗肿瘤药物载体进行抗肿瘤的研究中，使用较多的如高分子纳米材料、脂质体以及金属纳米粒子等，并且已有很多纳米药物运载系统成功应用的先例，但不可否认的是，在药物的高效负载、靶向输运、集治疗和检测于一体的多功能药物载体的研究里仍然存在诸多问题，比如脂质体的粒径分布可能影响载体进入细胞的效率，另外一些金属纳米粒子存在生物安全方面的争议等。因此，近几年国际上基于DNA纳米技术的DNA纳米折纸结构成为新一代的抗肿瘤药物载体的相关研究备受瞩目。
DNA折纸术作为一种精确高效的自组装技术，自2006年Rothemund发明以来在生物医药、高灵敏度检测、纳米光电子器件、等离子体光子学领域展现出巨大的应用潜力，近年来受到广泛关注。而目前进行DNA折纸时，多利用含7249个碱基的噬菌体单链M13 DNA作为脚手架链，同时需设计几百条几个碱基不等的特定序列单链DNA作为订书钉链，然后再通过特定的折纸程序，进行不同二维纳米结构的组装。在这过程中，实验设计和操作复杂，订购试剂耗资昂贵。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供一种利用DAPI嵌入和释放模拟DNA纳米折纸结构作为药物载体的方法。
一种利用DAPI嵌入和释放模拟DNA纳米折纸结构作为药物载体的方法，其特征在于，通过DNA滚环扩增技术得到长单链DNA作为支架链，加入订书钉链后进行折纸得到二维DNA纳米折纸结构，具备DNA双链强力结合能力的荧光染料嵌入其中，通过嵌入后荧光强度的增高以及DNA纳米折纸复合结构降解后染料释放导致荧光强度下降过程监控DNA纳米折纸结构的稳定性并模拟其作为抗肿瘤药物载体的药物负载及缓释过程。
所述的DNA滚环扩增技术，环模板为一碱基数为96的闭合单链DNA，且序列为：5’-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCT GACTTC-3’。
所述的订书钉链共三条，每条都能与长单链DNA进行互补杂交，且序列分别为，订书钉链1：5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’；订书钉链2：CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG；订书钉链3： TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT。
所述的支架链加入订书钉链后得到二维DNA纳米折纸结构，制备条件是：高温95℃，三分钟，后每降0.2℃，持续20s，直至4℃。
所述的二维DNA纳米折纸结构，长度可达微米级，宽度为16nm。
所述的具备DNA双链强结合能力的荧光染料，嵌入双链之前荧光微弱，而嵌入后则荧光值大大增强，且能穿透细胞膜的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）。
所述的DNA纳米折纸复合结构与DAPI形成的复合结构或通过电纺技术所得的DNA纳米折纸结构膜与DAPI形成的复合结构。
本发明通过DNA滚环扩增技术使得短链DNA延伸成长单链DNA，后将其作为脚手架链，加入三条订书钉即可通过DNA折纸术制备具有一定宽度的DNA纳米折纸结构。因此纳米折纸结构由双链结构组成，因此可结合有双链强力嵌入特性的荧光染料DAPI（4’,6-diamidino-2-phenylindole，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚）。通过DAPI嵌入DNA纳米折纸结构后荧光强度的增强以及DNA纳米折纸结构降解后释放DAPI导致的荧光强度下降模拟DNA纳米折纸结构作为抗肿瘤药物载体的药物负载及缓释过程。
附图说明
图1：不同浓度DAPI溶液中加入与不加入DNA纳米折纸结构两组荧光值高低比较结果。由结果可以看出，加入DNA纳米折纸结构的实验组荧光值有明显的增强。
具体实施方式
实施例1：
16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)，phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（100μM，序列依次为：
5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’
5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’）各1μL，2μL TAE 缓冲液（10×，125mM Mg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。10μL产物稀释到90 μLMilli-Q 水中，取5μL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Milli-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
实施例2：
16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)，phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（1μM，序列依次为：
5’CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5’CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，各1μL，2μL TAE 缓冲液（10×，125mMMg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。取10μL制备的DNA纳米折纸结构，加入10μL 0.5mg/mL DAPI溶液后室温下反应10min后加入80μLmilliQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计（激发波长/发射波长：364nm/454nm ）测试其荧光强度；同时取20μL 0.5mg/mL DAPI溶液后并加入80μLmilliQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计（激发波长/发射波长：340nm/488nm ）测试溶液荧光强度，比较两组荧光强度大小判断DAPI嵌入DNA纳米折纸结构后荧光增强效果。
实施例3：
16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)，phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（1μM，序列依次为：
5’CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5’CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，各1μL，2μL TAE 缓冲液（10×，125mMMg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。取10μL制备的DNA纳米折纸结构，加入10μL 0.5mg/mL DAPI溶液后室温下反应10min后加入80μLmilliQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计（激发波长/发射波长：364nm/454nm ）测试其荧光强度；另取1.5μL扩增产物长单链DNA，加入10μL 0.5mg/mL DAPI溶液后室温下反应10min后加入88.5μLmilliQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计（激发波长/发射波长：364nm/454nm ）测试其荧光强度；比较DNA纳米折纸结构/DAPI以及长单链DNA/DAPI两溶液的荧光强度。
实施例4：
16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)，phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（1μM，序列依次为：
5’CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5’CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，各1μL，2μL TAE 缓冲液（10×，125mMMg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。取6个离心管，每一管加入10μL制备的DNA纳米折纸结构，分别加入10μL 0μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL、0.5mg/mL、5mg/mL DAPI溶液后室温下反应10min后加入80μLmilliQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计（激发波长/发射波长：364nm/454nm ）测试6组溶液荧光强度，判断嵌入DNA纳米折纸结构的最适DAPI浓度。
实施例5：
16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)，phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（1μM，序列依次为：
5’CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5’CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，各1μL，其中订书钉2的5’为生物素修饰），2μL TAE 缓冲液（10×，125mM Mg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温95°C后梯度降温至25°C。18μL产物中加入2μL1mg/mL链霉亲和素后，37°C水浴中连接2h。取10μL DNA纳米折纸结构/链酶亲和素复合物，加入10μL 50μg/mL DAPI溶液混合均匀并室温下反应10min 后于4°C待用。利用点样仪，将100μg/mL 生物素标记的二抗固定在醛基玻片表面，4°C固定连接后，PBS缓冲液（10mM，pH7.4）清洗后氮气吹干。滴加20μL DNA纳米折纸结构/链酶亲和素复合物/DAPI溶液，37°C环境下孵育1h。PBST（0.1% Tween 20）清洗液冲洗三次后，氮气吹干。荧光显微镜下观察荧光微点阵。
实施例6：
16μL引物DNA（1μM，序列为5’CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’）中依次加入12μL环DNA（2μM，序列为：5’TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μL，10 mM)， RCA buffer (4μL，10×)，phi29 polymerase 4μL，10 U/μL)，混合溶液终体积为40μL。然后30°C 水浴中扩增30 min。所得产物40μL 经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3μL，加入milliQ水12μL，加入订书链1-3（1μM，序列依次为：
5’CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5’CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5’TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3’，各1μL，2μL TAE 缓冲液（10×，125mMMg2+），总体积为20μL，溶液充分混合均匀后置入高温 95°C后梯度降温至25°C。10μL DNA纳米折纸结构溶液中加入10μL 50μg/mL DAPI溶液混合均匀并室温下反应10min。DNA纳米折纸结构/DAPI复合物溶液加入细胞培养液100μL后混合均匀加入到细胞培养皿中，37oC，5.0%二氧化碳的细胞培养箱中与细胞作用2小时后，加入4%多聚甲醛固定30min，激光共聚焦荧光显微镜下观察并成像，检验随着DNA纳米折纸结构的降解，释放的DAPI是否能够穿过细胞膜进行细胞核染色。
<110> 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种利用DAPI嵌入和释放模拟DNA纳米折纸结构作为药物载体的方法
<140>
<141>
<160> 4
<210> 1
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tatgcccagc cctgtaagat gaagatagcg cacaatggtc ggattctcaa ctcgtattct 60
caactcgtat tctcaactcg tctctgccct gacttc 96
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagccctgta agatgaagat agcgtctatg cc 32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccctgactca caatggtcgg attccgtctc tg 32
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctcaacttc aactcgtatt ctcaactcgt at 32
Claims (1)
1.一种利用DAPI嵌入和释放模拟DNA纳米折纸结构作为药物载体的方法，其特征在于，通过DNA滚环扩增技术得到长单链DNA作为支架链，加入订书钉链后进行折纸得到二维DNA纳米折纸结构，具备DNA双链强力结合能力的荧光染料嵌入其中，通过嵌入后荧光强度的增高以及DNA纳米折纸复合结构降解后染料释放导致荧光强度下降过程监控DNA纳米折纸结构的稳定性并模拟其作为抗肿瘤药物载体的药物负载及缓释过程；
所述的DNA滚环扩增技术，环模板为一碱基数为96的闭合单链DNA，且序列为：5’-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCT GACTTC-3’；
所述的订书钉链共三条，每条都能与长单链DNA进行互补杂交，且序列分别为，订书钉链1：5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’；订书钉链2：CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG；订书钉链3： TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT；
所述的支架链加入订书钉链后得到二维DNA纳米折纸结构，制备条件是：高温95℃，三分钟，后每降0.2℃，持续20s，直至4℃；
所述的二维DNA纳米折纸结构，长度可达微米级，宽度为16nm；
所述的具备DNA双链强结合能力的荧光染料，嵌入双链之前荧光微弱，而嵌入后则荧光值大大增强，且能穿透细胞膜的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）；
所述的DNA纳米折纸复合结构与DAPI形成的复合结构或通过电纺技术所得的DNA纳米折纸结构膜与DAPI形成的复合结构。
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