CN104749369A - 一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法 - Google Patents

一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，包括以下步骤：将含有叠氮基团的胆碱类似物和具有细胞膜结构的生物体共培养，经新陈代谢后得到胆碱类似物修饰的生物体；通过点击化学反应，用DBCO基团修饰的荧光标记物对所述胆碱类似物修饰的生物体进行标记，使得荧光标记物标记在生物体的细胞膜表面。上述用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，采用含有叠氮基团的胆碱类似物对生物体进行修饰，这种方法对生物体的活性影响较小。此外，上述荧光标记方法采用一步法标记，相对于两步法操作更简单、效率更高。

Description

一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法
技术领域
本发明属于生物标记技术领域，尤其涉及一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法。
背景技术
目前，细胞治疗（包括干细胞和免疫细胞）被广泛用于肿瘤、自身免疫病、移植等多个临床治疗领域。研究细胞在体内的迁移和分布，对于细胞治疗的临床应用和提升至关重要。现有的细胞标记方法，主要是通过荧光染料、抗体（免疫学荧光标记）、报告基因和荧光素等相关标记技术来研究细胞形态、细胞融合、细胞动力学、细胞迁移等细胞功能，并且一些技术需要结合组织病理学相关切片技术，在不同时间点将组织从动物中取出进行切片，染色标记，研究目标细胞在某个时间点在体内各种生理变化情况。然而这种标记细胞的方法却无法实现对活细胞在体内的实时跟踪，限制了靶细胞在活体内的研究。为解决传统示踪方法的不足，急需研究开发出能用于活体示踪的活细胞标记方法，采用这些方法可对同一实验对象在不同时间点进行比较，标记跟踪活细胞在体内的迁移及相关变化，所得的数据信息更加详尽。这明显减少了实验动物数量，同时又为细胞与医药研究领域提供了指导。而这种动态的活体示踪，需要开发出一种高效，稳定的活细胞标记技术来实现。
运用于活细胞的标记方法主要有：荧光染料标记，荧光素和荧光蛋白，普通量子点活细胞示踪以及一些光学成像等影像技术，但由于它们都有各自的缺陷，每种单一成像模式都不能提供完美的光学信号。其中，目前的量子点活细胞示踪技术，是通过细胞吞噬，或载体携带进入细胞，会对细胞的生理活性产生影响，不利于目标细胞研究。普通光学成像是运用生物发光剂（染料）和内源性荧光报告基因或者是运用外源性探针检测分子监测目标物的生化过程，但都有其固有的局限性，在可见光范围内光子容易被组织吸收和散射，很难穿透深层组织，因而只能用于体外研究或者不能实时动态观察靶细胞。在影像学领域中急切需要研究出一种标记简单，穿透力强，光学分辨率高的无创伤的标记/示踪方法。近年来，近红外荧光成像技术已经被广泛应用，其基本原理是以特定波谱范围的激发光源照射近红外荧光探针，此时荧光探针会被激发出不同光谱特性的光子信号。与可见光相比近红外荧光可穿透更深层的组织，特异性强，灵敏度高的特点，在体内外标记示踪过程有着广泛的应用前景。
现有荧光标记技术中，将荧光探针与生物分子结合的方式主要基于非共价的连接方式，这种方法虽然相对简便快捷，但得到的荧光标记生物分子不够稳定，示踪时间短，在应用上有很大限制。另一种连接方式是运用羧基与氨基间的缩合反应，可实现对生物分子的荧光标记。尽管这种方法是利用共价键的结合方式获得较为稳定的标记产物，但这类标记方法通常需要特定的催化剂进行催化，这给该方法的应用推广带来困难。而且在含有蛋白的生物分子和环境中，通常会存在有大量的氨基和羧基等基团，这使得染料和量子点荧光标记的特异性出现降低，同时还会影响对目标生物分子的标记效率。因此，为解决上述问题，以点击化学反应为基础将荧光探针标记到生物体上已开始应用于生物标记领域，因其共价键连接非常稳定，而且由于生物体系中不含有环炔基和叠氮基团，而点击化学反应中，只有含有叠氮基的细胞能和带有环炔基的染料或量子点反应，反应速度较快，不受反应体系中的其他因素干扰，具有很强的高效性与特异性。
通常，以点击化学为基础的荧光标记方法采用两步法，首先使细胞与带有环炔基的点击化学修饰连接剂结合，然后用叠氮-荧光标记物复合物对细胞进行荧光标记。但是，这种标记方法对细胞毒性大从而对细胞的活性影响较大，活性低不利于生物活体标记和检测。而且两步法标记比较繁琐，效率低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种用含有叠氮基团的胆碱类似物修饰具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，以解决现有的以点击化学为基础的荧光标记方法对生物体活性影响较大的技术问题。
进一步地，本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高的一步法荧光标记，以解决现有的两步法标记操作繁琐、效率低的技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，包括以下步骤：
将含有叠氮基团的胆碱类似物和具有细胞膜结构的生物体共培养，经新陈代谢后得到胆碱类似物修饰的生物体；
通过点击化学反应，用DBCO基团修饰的荧光标记物对所述胆碱类似物修饰的生物体进行标记，使得荧光标记物标记在生物体的细胞膜表面。
上述用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，采用含有叠氮基团的胆碱类似物对生物体进行修饰，这种方法对生物体的活性影响较小。该含有叠氮基团的胆碱类似物一端是胆碱分子，另一端带有一个叠氮基团，其中，胆碱属于细胞膜的组成成分，参与生物体的生物代谢，对生物体的活性影响小；与大体积的DBCO基团相比较，叠氮基团的体积较小，对生物体的活性影响较小。此外，上述荧光标记方法，首先将含有叠氮基团的胆碱类似物和生物体进行共培养修饰，再用DBCO基团修饰的荧光标记物对修饰后的生物体进行标记，采用一步法标记，相对于两步法操作更简单、效率更高。
附图说明
图1为本发明荧光标记原理示意图；
图2为本发明实施例1中的Raw cell264.7细胞标记荧光染料后的荧光成像图；
图3为本发明实施例2中的树突状细胞标记荧光染料后的荧光成像图；
图4为本发明实施例3中的树突状细胞标记荧光量子点后的荧光成像图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，包括以下步骤：
S01.用胆碱类似物修饰生物体：将含有叠氮基团的胆碱类似物和具有细胞膜结构的生物体共培养，经新陈代谢后得到胆碱类似物修饰的生物体；
S02.用DBCO基团修饰的荧光标记物进行标记：通过点击化学反应，用DBCO基团修饰的荧光标记物对所述胆碱类似物修饰的生物体进行标记，使得荧光标记物标记在生物体的细胞膜表面。
上述用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，采用含有叠氮基团的胆碱类似物对生物体进行修饰，这种方法对生物体的活性影响较小。该含有叠氮基团的胆碱类似物一端是胆碱分子，另一端带有一个叠氮基团，其中，胆碱属于细胞膜的组成成分，参与生物体的生物代谢，对生物体的活性影响小；与大体积的DBCO基团相比较，叠氮基团的体积较小，对生物体的活性影响较小。此外，上述荧光标记方法，首先将含有叠氮基团的胆碱类似物和生物体进行共培养修饰，再用DBCO基团修饰的荧光标记物对修饰后的生物体进行标记，采用一步法标记，相对于两步法操作更简单、效率更高。
具体地，在步骤S01中，含有叠氮基团的胆碱类似物优选为具有以下结构通式（I）的化合物：
N3（CH2）nN（CH3）2（CH2）2OH   （I），
其中，n为1～3的正整数。
在具体实施例中，含有叠氮基团的胆碱类似物可以为：
（1）N3（CH2）2N（CH3）2（CH2）2OH，2-叠氮-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基胆碱（azidoethyl-choline，AE-Cho)；
（2）N3（CH2）3N（CH3）2（CH2）2OH，3-叠氮-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-铵盐（azidopropyl-choline，AP-Cho)；
（3）（CH3）3N（CH2）2OHCCH，羟基戊-4-烯基（三甲基）铵，（propargyl-choline，propargyl-Cho)。
上述含有叠氮基团的胆碱类似物的制备方法可参照文献Analyticalchemistry201385（10），5263–5270中所公开的方法合成，具体制备方法请参见下文实施例中的原料与试剂内容。
上述含有叠氮基团的胆碱类似物，一端带有一个叠氮基团，用于点击化学反应；另一端是胆碱分子，可参与细胞的脂类代谢。采用上述含有叠氮基团的胆碱类似物对生物体进行修饰，这种方法对生物体的活性影响较小，其中，胆碱属于细胞膜的组成成分，参与生物体的生物代谢，对生物体的活性影响小；与大体积的DBCO基团相比较，叠氮基团的体积较小，对生物体的活性影响较小。
在步骤S01中，含有叠氮基团的胆碱类似物的用量优选为具有细胞膜结构的生物体摩尔量的10-100倍。在上述优选的用量范围内，可以保证胆碱类似物修饰试剂在一定范围内过量以提高对细胞的标记效率，但又不影响细胞的生物学活性。此外，每个细胞表面有多个叠氮基，原理上每个叠氮基团都可以连接一个DBCO基团修饰的荧光标记物，由于荧光标记物非常小，可以通过控制胆碱类似物与细胞的比例，来保证细胞表面荧光标记物能接触到的范围内，仅有一个叠氮基团能够与荧光标记物的环炔基进行点击化学反应。
在步骤S01中，上述含有叠氮基团胆碱类似物的浓度优选为0.1-10μg/mL/106细胞。
在步骤S02中，DBCO基团修饰的荧光标记物优选为DBCO基团修饰的荧光染料和/或DBCO基团修饰的量子点。
在具体实施例中，DBCO基团修饰的荧光染料为DBCO-Fluor488、DBCO-TAMRA、DBCO-Cy3、DBCO-Sulforhodamine B、DBCO-Sulforhodamine101、DBCO-Cy5、DBCO-Cy5.5、DBCO-Cy7和DBCO-Fluor525中的至少一种。上述DBCO基团修饰的荧光染料可以市购得到。
其中，DBCO-Fluor488的结构式如下：
上述结构式的化合物一端为带有芳香环部分的环炔基，其中，环炔基可与叠氮基发生点击化学反应，环炔基两边的芳香环部分可以提高环炔基与叠氮基的反应活性；另一端为与NHS相连的荧光基团。
在具体实施例中，DBCO基团修饰的量子点中的量子点为CdSe、CdTe、CdS、ZnS、CuInSe、CuInS、InP、CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdSe中的至少一种。
上述DBCO基团修饰的量子点（DBCO-QDs）的制备方法可参照文献Nanoscale,2011,3(11),4724-4732和Analytical chemistry201385（10），5263–5270以及专利201210417040.7中所公开的方法,具体制备方法请参见实施例中的原料与试剂内容。
获得所述DBCO基团修饰的荧光标记物使用的DBCO基团修饰剂优选为DBCO-PEG4-NHS。上述DBCO基团修饰剂可以市购得到。
其中，DBCO基团修饰剂DBCO-PEG4-NHS的结构式如下：
在步骤S02中，DBCO基团修饰的荧光标记物的用量优选为具有细胞膜结构的生物体摩尔量的10-100倍。在上述优选的用量范围内，可以保证DBCO基团修饰的荧光标记物在一定范围内过量以提高对细胞的标记效率，但又不影响细胞的生物学活性。在步骤S02中，DBCO基团修饰的荧光标记物的浓度为0.1-5μg/mL/106细胞。该优选浓度能检测到阳性结果。
本发明荧光标记原理示意图如图1所示。由于本发明的荧光标记方法是基于对细胞膜进行的荧光标记，因此，本发明的方法可以对具有细胞膜结构的生物体进行荧光标记。在具体实施例中，具有细胞膜结构的生物体可以为活细胞、囊膜病毒、活体组织或细菌。
以下通过实施例对本发明进行进一步说明。
原料与试剂
（1）胆碱类似物AE-Cho的制备：
参照文献Analytical chemistry201385（10），5263–5270中所公开的方法合成。具体制备方法如下：
将1,2二溴乙烷和叠氮化钠加入到二甲基甲酰胺（DMF）中进行反应，冷却至室温；将其放在饱和氯化钠的冰水混合物上，用冰冷的戊烷萃取3次，有机层经过冷盐水洗涤后用饱和Na2SO4和负压蒸干浓缩成叠氮-二溴乙烷。然后将产物加入含有二甲基乙醇胺的四氢呋喃（THF）中，0℃氩气搅拌反应；经二乙醚洗涤与真空干燥后得到纯净的白色粉末（AE-Cho）。
（2）DBCO基团修饰的荧光染料：DBCO-Fluor488（购自Click Chemistry Tools公司）
（3）DBCO基团修饰的量子点（DBCO-QD）的制备：
以下实施例中所用的DBCO-QD，其中，量子点内核均为CdTeSe/ZnS核壳型量子点。
DBCO聚合物对量子点的修饰方法参照文献Analytical chemistry201284,8364-8370中所公开的方法合成。
量子点（QDs）可参照文献Nanoscale,2011,3(11),4724-4732和Analyticalchemistry201385（10），5263–5270以及专利201210417040.7中所公开的方法合成。
具体制备方法如下：
将已合成好的QD-NH2（制备方法请参见文献Nanoscale,2011,3(11),4724-4732）与点击化学连接剂DBCO-PEG4-NHS(购于click chemistry tools公司)混合后加入磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2-7.6）中,室温孵育，残留的DBCO-PEG4-NHS通过NAP-5(购自通用电器医疗集团生命科学部)除盐柱去除。标记过的DBCO-QD通过1%的琼脂糖胶凝胶电泳鉴定，备用。
（4）活细胞培养
Raw cell264.7（小鼠腹腔巨噬细胞）将Raw cell264.7培养在含有β-巯基乙醇的DMEM完全培养基中。
将树突状细胞从C57/BL6小鼠的骨髓中分离取出，获取的树突状细胞用含细胞因子的X-VIVO培养基每隔两天半量换液培养。
实施例1
S11.用胆碱类似物对Raw cell264.7细胞进行修饰：首先用PBS缓冲液将Rawcell264.7细胞洗两次，更换上述对应的新鲜的培养基，然后将终浓度为1μg/mL的胆碱类似物修饰试剂AE-Cho与Raw cell264.7细胞共培养，具体是在37℃的5%CO2培养箱中孵育24h，然后用PBS缓冲液洗去多余的胆碱类似物修饰试剂，加入新鲜的培养基，备用。其中，Raw cell264.7细胞与胆碱类似物的摩尔用量比为1:10。
S12.用DBCO基团修饰的荧光染料标记Raw cell264.7细胞：将上述S11步骤中得到的胆碱类似物修饰后的细胞用PBS缓冲液洗涤两次，去除残留的胆碱类似物修饰试剂；然后将摩尔量为Raw cell264.7细胞摩尔量10倍的DBCO基团修饰的荧光染料DBCO-Fluor488加入以上细胞培养液中，37℃孵育1小时，进行点击化学反应；然后用PBS缓冲液洗去残留的荧光染料标记物，得到荧光染料标记的活细胞溶液。其中，荧光染料标记物的浓度为1μg/mL。
实施例2
S21.用胆碱类似物对树突状细胞进行修饰：首先用PBS缓冲液将树突状细胞洗两次，更换上述对应的新鲜的培养基，然后将终浓度为0.5μg/mL的胆碱类似物修饰试剂AE-Cho与树突状细胞共培养，具体是在37℃的5%CO2培养箱中孵育24h，然后用PBS缓冲液洗去多余的胆碱类似物修饰试剂，加入新鲜的培养基，备用。其中，树突状细胞与胆碱类似物的摩尔用量比为1:10。
S22.用DBCO基团修饰的荧光染料标记树突状细胞：将上述S21步骤中得到的胆碱类似物修饰后的细胞用PBS缓冲液洗涤两次，去除残留的胆碱类似物修饰试剂；然后将摩尔量为树突状细胞摩尔量10倍的DBCO基团修饰的荧光染料DBCO-Fluor488加入以上细胞培养液中，37℃孵育1小时，进行点击化学反应；然后用PBS缓冲液洗去残留的荧光染料标记物，得到荧光染料标记的活细胞溶液。其中，荧光染料标记物的浓度为1μg/mL。
实施例3
S31.用胆碱类似物对树突状细胞进行修饰：首先用PBS缓冲液将树突状细胞洗两次，更换上述对应的新鲜的培养基，然后将终浓度为0.5μg/mL的胆碱类似物修饰试剂AE-Cho与树突状细胞共培养，具体是在37℃的5%CO2培养箱中孵育24h，然后用PBS缓冲液洗去多余的胆碱类似物修饰试剂，加入新鲜的培养基，备用。其中，树突状细胞与胆碱类似物的摩尔比为1:10。
S32.用DBCO基团修饰的量子点标记树突状细胞：将上述S31步骤中得到的胆碱类似物修饰后的细胞用PBS缓冲液洗涤两次，去除残留的胆碱类似物修饰试剂；然后将摩尔量为树突状细胞摩尔量10倍的DBCO基团修饰的量子点加入以上细胞培养液中，37℃孵育1小时，进行点击化学反应；然后用PBS缓冲液洗去残留的荧光量子点标记物，得到荧光量子点标记的活细胞溶液。其中，荧光量子点标记物的浓度为1μg/mL。
以下为实施例1-3中荧光标记后的细胞的荧光成像图谱分析：
通过激光共聚焦显微镜（Laica）可观察到实施例1中荧光染料标记后的Raw cell264.7细胞的细胞膜上有明显的荧光信号，如图2所示。其中，细胞采用明场模式观察，得到的细胞图像为彩色；而荧光染料发出的荧光信号采用488nm波长激光激发，收集到500nm到550nm波长范围的绿色荧光信号。从图中可以看出，荧光染料的绿色荧光信号均匀的分布在Raw cell264.7细胞的细胞膜上，说明具有活性的Raw cell264.7细胞已被荧光染料成功标记。
通过激光共聚焦显微镜（Laica）可观察到实施例2中荧光染料标记后的树突状细胞的细胞膜上有明显的荧光信号，如图3所示。其中，细胞采用明场模式观察，得到的细胞图像为彩色；而荧光染料发出的荧光信号采用488nm波长激光激发，收集到500nm到550nm波长范围的绿色荧光信号。从图中可以看出，荧光染料的绿色荧光信号均匀的分布在树突状细胞的细胞膜上，说明具有活性的树突状细胞已被荧光染料成功标记。
通过多光谱荧光显微镜可观察到实施例3中荧光量子点标记的树突状细胞的细胞膜上有明显的荧光信号，如图4所示。其中，细胞采用明场模式观察，得到的细胞图像为黑白；而荧光量子点发出的荧光信号采用蓝光激发，荧光量子点的红色荧光信号在650-900nm波长范围内收集。从图中可以看出，荧光量子点的红色荧光信号均匀的分布在树突状细胞的细胞膜上，说明具有活性的树突状细胞已被荧光量子点成功标记。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，包括以下步骤：
将含有叠氮基团的胆碱类似物和具有细胞膜结构的生物体共培养，经新陈代谢后得到胆碱类似物修饰的生物体；
通过点击化学反应，用DBCO基团修饰的荧光标记物对所述胆碱类似物修饰的生物体进行标记，使得荧光标记物标记在生物体的细胞膜表面。
2.如权利要求1所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，所述含有叠氮基团的胆碱类似物具有以下结构通式（I）：
N3（CH2）nN（CH3）2（CH2）2OH   （I），
其中，n为1～3的正整数。
3.如权利要求1所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，所述含有叠氮基团的胆碱类似物为2-叠氮-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基胆碱、3-叠氮-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-铵盐中的至少一种。
4.如权利要求1-3所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，在对生物体进行共培养代谢修饰的步骤中，所述含有叠氮基团的胆碱类似物的用量为具有细胞膜结构的生物体摩尔量的10-100倍。
5.如权利要求1-3所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，在对生物体进行荧光标记的步骤中，所述DBCO基团修饰的荧光标记物的用量为具有细胞膜结构的生物体摩尔量的10-100倍。
6.如权利要求1-3所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，所述DBCO基团修饰的荧光标记物为DBCO基团修饰的荧光染料和/或DBCO基团修饰的量子点。
7.如权利要求6所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，所述DBCO基团修饰的荧光染料为DBCO-Fluor488、DBCO-TAMRA、DBCO-Cy3、DBCO-Sulforhodamine B、DBCO-Sulforhodamine101、DBCO-Cy5、DBCO-Cy5.5、DBCO-Cy7和DBCO-Fluor525中的至少一种。
8.如权利要求6所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，所述量子点为CdSe、CdTe、CdS、ZnS、CuInSe、CuInS、InP、CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdSe中的至少一种。
9.如权利要求1-3所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，获得所述DBCO基团修饰的荧光标记物使用的DBCO基团修饰剂为DBCO-PEG4-NHS。
10.如权利要求1-3所述的用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，其特征在于，所述具有细胞膜结构的生物体为活细胞、囊膜病毒、活体组织或细菌。
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