CN103076312A - 一种细胞荧光标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞荧光标记方法，将点击化学与荧光量子点技术相结合，通过点击化学修饰连接剂，使用纳米量子点对细胞进行荧光标记。该方法由于使用点击化学，使量子点与生物体共价连接，快速简便，且标记产物稳定，特异性好。

Description

一种细胞荧光标记方法

【技术领域】

本发明涉及生物荧光标记领域，具体涉及一种利用点击化学对细胞进行荧光标记的方法。

【背景技术】

探索和发现生物体内及生命过程中蛋白质、核酸、多肽等重要生物分子的高灵敏分析检测方法，是生物医学领域研究的热点和难点。生物标记技术是该领域不可或缺的研究手段。通用的生物标记方法可以分为放射性标记、显色标记、酶标记和荧光标记等。其中，荧光标记备受科研人员关注，而其检测灵敏度很大程度上取决于荧光标记探针的发光强度和光化学稳定性。

荧光半导体纳米材料量子点具有激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称、发光效率高、光化学稳定性好、不易发生光漂白、发射光颜色与粒径大小关联等优点，作为一种新型荧光标记物被广泛应用于蛋白质及DNA检测、细胞标记成像、活细胞生命动态过程示踪、活体动物体内肿瘤细胞靶向示踪等生物医学领域。

现有技术已存在使用荧光量子点标记DNA的方法，稳定荧光标记肝癌细胞的方法，由纳米或胶体微粒与亲和素、链霉亲和素或抗生物素构成的纳米探针，以及通过在病毒宿主细胞的培养基中添加生物素磷脂，而发展的囊膜病毒的生物素标记方法。

然而，现有的生物标记技术主要基于生物素与亲和素之间的非共价相互作用，虽然具有简便、快捷的优点，但是标记产物不稳定。另一种采用基于羧基与氨基的缩合反应的标记方法往往需要添加催化剂，并且由于生物体本身存在大量氨基与羧基，因此反应效率不高，特异性也不好。

点击化学（click chemistry）是2001年由诺贝尔化学奖获得者K.Barry Sharpless首次提出的一个模块化合成概念。它是一种选用易得原料，通过模块化的、可靠、高效率、高选择性的化学转变来实现碳杂原子连接，以低成本快速合成各类新化合物的组合化学新方法。

目前点击化学应用最为广泛的是铜离子催化的端基炔和叠氮化物Huisgen偶极环加成反应。而新型的基于环炔基-叠氮连接的不含铜的新型点击化学方法更为其生物医学应用奠定了良好基础。将点击化学与荧光纳米量子点结合起来可以构建一种稳定的纳米标记探针。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题在于现有生物标记产物不稳定、效率低、特异性差的缺点，提供一种基于点击化学的生物标记方法。

具体地，本发明提供一种细胞荧光标记方法，包括以下步骤：

A．使细胞与点击化学修饰连接剂结合：在含有细胞的培养液中，添加带有环炔基的点击化学修饰连接剂，室温反应，得到细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液，其中点击化学修饰连接剂的量为细胞摩尔量的10-100倍；

B．使用叠氮-荧光量子点复合物对细胞进行荧光标记：将叠氮-荧光量子点复合物加入步骤A得到的培养液中，室温孵育，得到荧光量子点标记的生物体培养液，其中叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的10-100倍。

一些实施方案中，步骤A中的反应可以进行30-60分钟。

一些实施方案中，步骤B中也可以孵育30-60分钟。

一些实施方案中，步骤A还可以包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的点击化学修饰连接剂，及/或离心收集细胞的操作。

一些实施方案中，步骤B还可以包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的叠氮-荧光量子点复合物，及/或离心收集荧光量子点标记的细胞的操作。

一些实施方案中，所述缓冲液可以为PBS缓冲液或者HEPES缓冲液。

一些实施方案中，所述点击化学修饰试剂可以为下式的化合物：

一些实施方案中，所述叠氮-荧光量子点复合物中的量子点可以选自CdSe、CdTe、CdS、ZnS、CuInSe、CuInS、InP、CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdSe，或它们的组合。

一些实施方案中，所述叠氮-荧光量子点复合物采用下式的叠氮修饰剂对量子点进行修饰：

一些实施方案中，所述培养液为DMEM培养液。

本发明利用点击化学的方法，将荧光量子点以共价的方式结合到细胞上，荧光标记稳定、高效，并且能够保持被标记物的活性。并且本发明的方法操作简便，快速易行，为细胞等生物体的长时间观察研究提供了适宜的实验方法。

【附图说明】

图1为根据本发明对细胞进行荧光量子点标记的原理示意图。

图2为本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的结构示意图。

图3为用于修饰量子点的叠氮聚合物N₃-PMAH的¹H NMR图谱。

图4示出本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的吸收和发射光谱。

图5示出本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的透射电镜图像。

图6A和6B分别为根据本发明对A549细胞和RAMOS淋巴瘤细胞进行荧光量子点标记后的荧光成像图。

【具体实施方式】

基于活体细胞的荧光标记，或活体荧光成像技术不需要杀死动物，可以对同一个动物进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的影响。更重要的是，该技术可以得到直观的成像图片，了解标记物在动物体内的分布和代谢情况，避免了传统的体外实验方法的诸多缺点，特别是在在癌症细胞转移及干细胞相关研究、药物制剂学、药物临床前研究中有不可估量的应用前景。

采用荧光量子点对生物体进行荧光标记，因其诸多优点，已得到越来越广泛的应用。然而，现有技术中将荧光量子点与生物体结合的方式主要基于非共价的相互作用，这种方法虽然简便快捷，但得到的荧光标记生物体不稳定，在应用上有很大限制。

另一种方式是基于羧基与氨基之间的缩合反应，以使量子点与生物体结合，进而对生物体进行荧光标记。尽管这种利用共价键的结合方式可以得到稳定的标记产物，但该标记方法通常需要使用催化剂，同样给应用带来极大不便。而且，由于生物体中通常存在有大量的氨基和羧基，使得量子点荧光标记的特异性大大降低，还影响了标记的效率。

本发明人利用点击化学高效率、高选择性的特点，将点击化学应用于细胞的量子点荧光标记。使得能够高效、高特异性地将荧光量子点与细胞相结合，获得稳定的共价连接的荧光标记细胞。

本发明利用点击化学对细胞进行荧光量子点标记的工作原理参见图1。通过环炔基-叠氮连接的点击化学方法，将荧光量子点与细胞膜表面蛋白上的氨基残基共价结合，以形成荧光量子点标记的细胞。

首先，形成细胞-点击化学修饰连接剂复合物。本发明中利用环炔基-叠氮的点击化学方法，将带有环炔基的点击化学修饰连接剂与细胞在培养液中反应一段时间，使得点击化学修饰连接剂与细胞膜表面蛋白上的氨基残基反应，得到细胞-点击化学修饰连接剂复合物。该过程通常反应30-60分钟。培养液可以是例如DMEM培养液。

本发明所用的点击化学修饰连接剂可以是下式（I）的化合物（DBCO-PEG4-NHS ester，购自Click Chemistry Tools公司）：

该化合物一端带有芳香环部分的环炔基，环炔基用来与偶氮基发生点击化学反应，环炔基两边的芳香环部分可以提高环炔与与偶氮基的反应活性；另一端为NHS可以与氨基反应；中间为聚乙二醇链，可以增加该化合物的水溶性。

之后，将叠氮-量子点复合物添加到含有细胞-点击化学修饰连接剂复合物的培养液中，孵育一段时间，例如通常为30分钟。该过程中，环炔基-叠氮点击化学反应发生，使得荧光量子点能够通过点击化学修饰连接剂，以共价方式标记到细胞表面。

图2为本发明的叠氮-量子点复合物结构示意图。从图中可见，本发明所用的量子点内核为CdSe/ZnS核壳型量子点，经叠氮基修饰后，量子点表面包覆一层带叠氮基的聚合物，叠氮基暴露于外，可以与环炔基化合物发生点击化学反应。

由于本发明的方法是在量子点表面修饰叠氮基，并利用叠氮基与环炔基发生点击化学反应，而点击化学反应与量子点本身并无直接关系。因此，本领域技术人员应理解，本发明的方法理论上适用于所有荧光量子点，其中核壳型的量子点具有更加稳定的光学性质。例如，本发明的荧光量子点可以使用CdSe、CdTe、CdS、ZnS、CuInSe、CuInS、InP等量子点或者CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdSe等核壳型的量子点等，或是它们的组合。

对量子点的叠氮修饰可以使用文献中的方法进行，例如在Journal of theAmerican Chemical Society 2012 134(20),8388-8391中所公开的方法。

修饰量子点所用的N₃-PMAH聚合物为下式（II）结构的化合物。

具体地，本发明的细胞荧光标记方法可以包括以下步骤：

A．使细胞与点击化学修饰连接剂结合：在细胞的培养液中，添加带有环炔基的点击化学修饰连接剂，反应，得到细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液。之后，还可以用pH在7.2-7.6的缓冲液超滤洗涤，以去除多余的点击化学修饰连接剂，并可以离心收集生物体，并加入新鲜的培养基，备用。

点击化学修饰连接剂的量可以为细胞摩尔量的10-100倍。细胞可以培养在DMEM培养液中。

B．使用叠氮-荧光量子点复合物对细胞进行荧光标记：将叠氮-荧光量子点复合物加入以上步骤得到的培养液中，孵育，得到荧光量子点标记的细胞培养液。

叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的10-100倍。

之后，也可以同样用pH在7.2-7.6的缓冲液超滤洗涤，以去除多余的点击化学修饰连接剂，并离心收集细胞，以备测试。孵育时间通常可以为，例如30-60分钟。

以上步骤中洗涤时使用的缓冲液可以是PBS缓冲液或者HEPES缓冲液。

实际操作中，细胞可以经一段时间的培养。例如，使用含10%小牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂/95%空气、饱和湿度的培养条件下培养。隔天更换培养液，每4~6天传代一次。使用前，首先用缓冲液将细胞洗3次，并换新鲜的不含小牛血清的DMEM培养基，

细胞表面虽然有多个氨基，但是通过与点击化学修饰连接剂分子连接后，转变为环炔基，转变的数量和加入的修饰试剂分子有关系，环炔基可以与量子点表面的叠氮基团发生连接反应。

每个量子点表面有多个叠氮基，原理上每个叠氮基团都可以连接一个点击化学修饰连接剂分子，由于量子点只有10nm左右大小，可以通过控制点击化学修饰连接剂分子与细胞的比例，来保证细胞表面量子点能接触到的范围内，仅有一个环炔基能够与量子点表面的叠氮基反应。

生物体系中通常不含有环炔基和叠氮基，如此，整个反应体系只有含有环炔基的细胞能和带有叠氮基的量子点反应，从而，本发明的标记方法具有明显的特异性。

对于相对复杂的生物体系如血液、人体组织等体系中，采用这种标记方法可以大大避免传统基于氨基和羧基反应的非特异性标记带来的伪信号。同时相对生物素-亲和素方法由于是化学键合，因此标记产物更加稳定。

由于本发明的生物体荧光标记是基于对细胞进行的荧光标记，因此，本发明的方法可以对细胞、干细胞、病毒、细菌等生物体进行荧光量子点标记。

结果可通过荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜观察。

本发明基于非铜离子催化的新型点击化学的生物体荧光量子点标记方法，反应条件温和、标记快速简便、重现性好，此外标记产物由于生成共价键，具有非常好的稳定性，同时还保持了被标记物的活性。在干细胞研究、病毒示踪、医学诊断学及生物医学活体成像等方面具有极大的应用前景。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例

原料与试剂

N₃-PMAH聚合物修饰剂：参照文献Journal of the American Chemical Society2012 134(20),8388-8391中所公开的方法合成。具体地，将聚马来酸酐（分子量1000，购自Polysciences,Inc）、组胺（购自西格玛奥德里奇公司）、叠氮基团末端的氨基化聚乙二醇N₃-PEG₈-CH₂CH₂NH₂（购自嘉兴博美生物技术有限公司）在二甲基亚砜（购自西格玛奥德里奇公司）中反应12小时得到。其¹H NMR图谱示于图3。

CdSe/ZnS核壳量子点：购自武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。

A549肺癌细胞、RAMOS淋巴瘤细胞：均从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心获得。

叠氮-量子点复合物

本发明所用的量子点内核为CdSe/ZnS核壳型量子点，外面包裹修饰有叠氮基团聚马来酸酐聚合物N₃-PMAH。其制备方法如下：

将CdSe/ZnS核壳量子点溶解于氯仿中，然后将聚合物N₃-PMAH溶解于二甲基亚砜，缓慢加入CdSe/ZnS核壳量子点的氯仿溶液。形成透明溶液。50℃加热2h，用旋转蒸发除去氯仿，再在90℃加热4h。降温后，加入氯仿/正己烷=1：1沉淀，6000g离心10min。丙酮洗3次。重新溶解于pH为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液，即得到叠氮-量子点复合物溶液。

图4为本发明所用叠氮-量子点复合物的吸收和发射光谱。从图中可见，本发明的叠氮-量子点复合物在300nm到590nm有连续的吸收光谱，而发射波长在600nm附近。也就是说用300nm到590nm之间任何波长的光源激发都可以将其激发而发射出600nm的红色荧光。这对于细胞的荧光标记而言，为荧光成像激发光的选择带来极大的方便。

图5示出本发明实施例中所用叠氮-量子点复合物的透射电镜图像。从图中可见，本发明的量子点粒径小于5nm，和一般的生物分子如蛋白质大小基本差异不大，不会影响细胞的自身功能。同时也能确保细胞表面只有1个环炔基能与量子点结合。

尽管本发明并未穷举，而仅使用了CdSe/ZnS量子点作为叠氮-量子点复合物的内核，应理解，本发明的方法适用于所有的荧光量子点，包括CdSe、CdTe、CdS、ZnS、CuInSe、CuInS、InP等量子点，或是CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdSe等的核壳型量子点，以及它们的任意组合。

实施例1：A549肺癌细胞标记

A549肺癌细胞培养：培养液为含10%小牛血清的DMEM培养基，培养条件：37℃，5%CO₂/95%空气，饱和湿度，隔天更换培养液，每4~6天传代一次。

A549肺癌细胞与点击化学修饰连接剂的结合：首先用PBS缓冲液将细胞洗3次，换新鲜的不含小牛血清的DMEM培养基，然后将摩尔量为细胞摩尔量10倍的点击化学修饰连接剂DBCO-PEG4-NHS ester加入细胞培养液，在室温下振荡反应30分钟，然后用PBS缓冲液洗去多余的修饰试剂，加入新鲜的培养基，备用。

用叠氮-量子点复合物对A549肺癌细胞进行荧光标记：将摩尔量为细胞摩尔量10倍的叠氮-量子点复合物加入以上步骤得到的细胞培养液中，孵育30分钟，用PBS缓冲液洗去多余的叠氮-量子点，得到量子点标记的细胞溶液。

这样的用量是为了保证修饰试剂和量子点在一定范围内过量，以提高标记效率。

用荧光显微镜可以观察到细胞上有明显的荧光信号，如图6A所示。细胞采用明场模式观察，得到的细胞图象为黑白；而量子点发出的荧光信号采用488nm的激光激发，收集590nm到630nm波长范围的红色荧光信号。可以看到量子点的红色荧光信号和细胞得到很好的重叠。说明细胞已经成功得到标记。

实施例2：RAMOS淋巴瘤细胞标记

RAMOS淋巴瘤细胞培养：培养液为含12%胎牛血清的DMEM培养基，培养条件：37℃，5%CO₂/95%空气，饱和湿度，隔天更换培养液，每4~6天传代一次。

RAMOS淋巴瘤细胞与点击化学修饰连接剂的结合：首先用PBS缓冲液将细胞洗3次，离心收集细胞，换新鲜的不含小牛血清的DMEM培养基，然后将摩尔量为细胞摩尔量30倍的点击化学修饰连接剂加入细胞培养液，反应30分钟，然后用PBS缓冲液洗去多余的修饰试剂，加入新鲜的培养基，备用。

用叠氮-量子点复合物对RAMOS淋巴瘤细胞进行荧光标记：将摩尔量为细胞摩尔量30倍的叠氮-量子点复合物加入第二步得到的细胞培养液中，孵育30分钟，用PBS洗去多余的叠氮-量子点，离心收集得到量子点标记的细胞溶液。

这样的用量是为了保证修饰试剂和量子点在一定范围内过量，以提高起标记效率。由于RAMOS淋巴瘤细胞是悬浮细胞，为保证其标记效率，修饰剂和量子点的用量会比前面的细胞用量多。

应理解，根据本发明的方法，针对不同的细胞，或为适应不同的情况，点击化学修饰连接剂及叠氮-量子点复合物的用量可以在细胞摩尔量10-100倍范围内变化，并可由本领域技术人员根据实际情况进行选择和调整。

用荧光显微镜可以观察到细胞上有明显的荧光信号，如图3B所示。细胞采用明场模式观察，得到的细胞图象为黑白；而量子点发出的荧光信号采用488nm的激光激发，收集590nm到630nm波长范围的红色荧光信号。可以看到量子点的红色荧光信号和细胞得到很好的重叠。说明细胞已经成功得到标记。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞荧光标记方法，包括以下步骤：

A．使细胞与点击化学修饰连接剂结合：在含有细胞的培养液中，添加带有环炔基的点击化学修饰连接剂，室温反应，得到细胞-点击化学修饰连接剂复合培养液，其中点击化学修饰连接剂的量为细胞摩尔量的10-100倍；

B．使用叠氮-荧光量子点复合物对细胞进行荧光标记：将叠氮-荧光量子点复合物加入步骤A得到的培养液中，室温孵育，得到荧光量子点标记的生物体培养液，其中叠氮-荧光量子点复合物的量为细胞摩尔量的10-100倍。

2.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤A中反应30-60分钟。

3.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤B中孵育30-60分钟。

4.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤A还包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的点击化学修饰连接剂，及/或离心收集细胞的操作。

5.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，步骤B还包括用pH为7.2-7.6的缓冲液洗涤，以去除多余的叠氮-荧光量子点复合物，及/或离心收集荧光量子点标记的细胞的操作。

6.根据权利要求4或5所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液或者HEPES缓冲液。

7.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述点击化学修饰试剂为下式的化合物：

8.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述叠氮-荧光量子点复合物中的量子点选自CdSe、CdTe、CdS、ZnS、CuInSe、CuInS、InP、CdSe/ZnS、CdTe/CdS、CdTe/CdSe，或它们的组合。

9.根据权利要求8所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述叠氮-荧光量子点复合物采用下式的叠氮修饰剂对量子点进行修饰：

10.根据权利要求1所述的细胞荧光标记方法，其特征在于，所述培养液为DMEM培养液。

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