CN108310397A - 一种具有sers/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂及其制备方法，以多功能抗癌适配体AS1411为模板，生成被AS1411保护的银纳米簇(AS1411‑Ag)，然后将其通过静电作用与修饰过的带正电荷的石墨烯量子点（GOD）组装复合在一起，最后再通过π‑π作用吸附具有芳环结构的抗癌药物，构筑具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411‑Ag。本发明设计、构建一种对选定肿瘤集靶向（分子水平）、双模态成像诊断（SERS和荧光）和治疗于一体的诊疗功能纳米复合物，解决不同的成像技术存在技术单一的技术问题，同时又能实现肿瘤的早期靶向诊断和同步原位治疗这一中心目标。

Description

一种具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂及 其制备方法
技术领域
本发明涉及纳米技术，特别涉及一种具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂及其制备方法。
背景技术
癌症已成为危害人类健康的第一大杀手，提高其早期诊断的准确性是攻克肿瘤的关键，如果在早期筛查和早期诊断的基础上进行同步的早期治疗，即实现“诊疗一体化”，可以大幅度提高肿瘤患者的治愈率、生活质量、生存期及生存率。因此，研发新型多功能诊疗制剂（Theranostic Agent）具有重要的意义。
纳米技术的出现为癌症诊疗一体化的实现带来了新的希望，应用纳米技术来攻克癌症就是将纳米技术运用于癌症发生发展的全过程，提供一个集癌症诊断、准确指出恶性细胞人体内的位置、向恶性细胞准确投递抗癌药物并确定这些药物是否有效地杀死这些恶性细胞于一体的治疗系统。其中，分子成像技术是癌症诊疗一体化的核心和重要基础。2004年，Gao等（Nat. Biotechnol., 2004, 22: 969-976）首次对小动物体内肿瘤进行了活体成像，他们用聚合物纳米颗粒层和聚乙二醇包覆量子点，并将其附着在前列腺特异性的单克隆抗体上，然后将这种量子点注射到有前列腺肿瘤的裸鼠循环系统。通过荧光成像分析技术发现，量子点主要聚集在肿瘤周围。荧光成像分析可得到实体瘤敏感的多色荧光图，获得肿瘤大小和定位信息。Nasongkla等（Nano Lett., 2006, 6: 2427-2430）对载有超顺磁性铁氧化物的聚合物胶束进行了系统研究，发现其在癌细胞双重靶向输运和磁共振成像（MRI）方面有很好的应用前景，对于恶性肿瘤的诊断具有重要意义。然而，目前所使用的成像技术均有一个共同的缺点：灵敏度低、准确性差，尤其不能对肿瘤部位的边界进行很明确的确定，不利于肿瘤的切除与治疗。
相对于其他成像技术而言，表面增强拉曼光谱技术（SERS）因其灵敏度高、可进行实时监测、对样品限制少和不破坏样品等优点，在一些重大疾病的诊断和基础研究中有着良好的应用潜力。目前有关SERS的活体成像研究，大都利用生物相容性好、毒性低的贵金属纳米材料作为SERS基底，通过主动靶向或被动靶向的方式聚集在肿瘤部位，利用SERS成像技术确定肿瘤的位置及其边界。Nie课题组（Nat. Biotechnol., 2008, 26: 83-90）将DTTC标记金纳米粒子，用聚乙二醇修饰，通过共价偶联表皮生长因子受体抗体进行特异性识别，成功地在异种移植了癌细胞（Tu686）裸鼠肿瘤皮下1-2 cm处检测到了明显不同的SERS信号。利用这个方法可以确定肿瘤边界，区分出肿瘤组织与邻近正常组织，这是其他成像技术所不能达到的。Gambhir课题组（ACS Nano, 2012, 6: 10366-10377）同样也将SERS探针分子DTTC负载在金纳米棒表面，通过被动靶向使其聚集在裸鼠的肿瘤部位，通过SERS成像技术区分肿瘤部位和周边的非病变组织，同时在SERS技术的指引下，成功切除肿瘤，达到治疗效果。但是SERS检测积分时间较长、成像速度较慢，这成为活体快速检测技术的一大障碍。而快速、便捷的荧光成像技术正好弥补这一缺陷，因此，同时具有SERS和荧光活性的双模态成像技术应运而生。
发明内容
本发明提供了一种具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂及其制备方法。本发明提出了以与癌细胞表面核仁素(nucleolin)特异性结合的多功能抗癌适配体AS1411为模板，生成被AS1411保护的银纳米簇（AS1411-Ag），然后将其通过静电作用与修饰过的带正电的石墨烯量子点(GQDs)组装复合在一起，最后再通过π-π作用吸附具有芳环结构的抗癌药物，构筑具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag。
实现本发明的技术方案是：一种具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂，诊疗试剂由苯环类抗癌药物、石墨烯量子点和以AS1411为模板制备的银纳米簇制成，其中石墨烯量子点与银纳米簇复合成GOD/AS1411-Ag纳米材料，通过π-π堆垛作用将苯环类抗癌药物负载在GOD/AS1411-Ag纳米材料上制成诊疗试剂。
所述苯环类抗癌药物为阿霉素或甲氨蝶呤。
所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，步骤如下：
（1）将AS1411溶于钾离子缓冲溶液得到AS1411溶液，在混合冰浴下，将硝酸银溶液加入到AS1411溶液中，震荡反应20-30 min后得到混合溶液，向混合溶液中加入硼氢化钠溶液，避光条件下于恒温摇床反应3-5 h得到AS1411银纳米簇；
（2）将石墨粉加入到硫酸和硝酸的混合溶液中，超声反应2-3.5 h后于100 ℃条件下搅拌反应24 h；反应结束后，冷至室温，用去离子水稀释至500-1000mL，调节pH值为8，旋转蒸发除去水和无机盐，将所得的滤液在透析袋中透析4天得到石墨烯量子点溶液；将氢氧化钠和氯乙酸钠加入到石墨烯量子点溶液中，超声反应2-4h，然后在透析袋中透析4天，得到表面羧基化的GOD水溶液；
（3）将含氨基的阳离子高分子溶液逐滴加入到步骤（2）中得到的表面羧基化的GOD水溶液中，超声混合5-10 min后，分两次加入EDC.HCl，室温搅拌反应24-248 h，然后再依次加入尿素和氯化钠，继续反应30-60 min后离心5-10 min，最后将上层溶液转移至透析袋中透析4天，得到聚阳离子修饰的GQD水溶液；
（4）将步骤（1）得到的AS1411银纳米簇与步骤（3）中的聚阳离子修饰的GQD水溶液分别稀释后混合，在恒温培养摇床上反应2-4 h得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料；
（5）向步骤（4）得到的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料中加入含苯环类抗癌药物溶液，避光条件下反应4-24 h，然后将反应液转移到透析袋中透析4天，得到诊疗试剂。
所述步骤（1）中钾离子缓冲溶液的pH为7.4，钾离子缓冲溶液为KCl/K3PO4缓冲溶液或K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液。
所述步骤（1）中AS1411溶液的浓度为0.05-1 mg/mL；硝酸银、AS1411和硼氢化钠的摩尔比为6：1：1。
所述步骤（2）中硫酸和硝酸的体积比为3:1，氢氧化钠和氯乙酸钠的质量比为1:1，1 ml石墨烯量子点溶液中加入0.3-0.5 g氢氧化钠。
所述步骤（3）中含氨基的阳离子高分子溶液为浓度为6 mg/mL的聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸或多臂氨基聚乙二醇溶液；以10ml步骤（2）中得到的表面羧基化的GOD水溶液为基准，含氨基的阳离子高分子溶液的加入量为10mL，EDC两次的加入量为120mg，尿素和氯化钠的加入量均为1.0-1.5g。
所述步骤（4）中将1-5μL AS1411银纳米簇与1-10μL聚阳离子修饰的GQD水溶液分别稀释至1ml后混合。
所述步骤（5）中含苯环类抗癌药物溶液的浓度为1mg/mL，GOD/AS1411-Ag复合纳米材料与含苯环类抗癌药物溶液的体积比为1：（0.2-0.5）。
所述透析袋的截留分子量为8000-14000。
本发明的有益效果是：（1）传统的荧光探针分子荧光寿命低，在长时间光照条件下容易发生光漂白；（2）半导体量子点荧光寿命长，化学和光学稳定性好，但是其生物毒性较高，有一定的生物安全隐患；（3）现有的SERS/荧光的双模态探针只是将荧光探针分子和SERS探针分子简单组合在一起，得到的体系成分复杂，且荧光探针分子的信号与SERS探针分子的信号容易相互干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1制备的GOD/AS1411-Ag的结构示意图。
图2为实施例1制备的GOD(a)和GOD/AS1411-Ag/DOX(b)的溶液照片。
图3为实施例1制备的AS1411-Ag(a)，GOD(b)和GOD/AS1411-Ag(c)的TEM照片。
图4为实施例1制备的AS1411-Ag的荧光图谱。
图5为实施例1制备的GOD的荧光图谱。
图6为实施例1制备的GOD/AS1411-Ag的荧光图谱。
图7为实施例1制备的GOD/AS1411-Ag/DOX与HeLa细胞共同孵育后的激光共聚焦荧光成像照片。
图8为实施例1制备的GOD/AS1411-Ag/DOX中阿霉素和GOD的SERS光谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将AS1411溶于pH值为7.4的KCl/K3PO4缓冲溶液，使AS1411的浓度为1mg/mL，然后按照硝酸银与AS1411的摩尔比为6:1的条件，在混合冰浴（(0-4 ℃）下，将5μL硝酸银溶液加入到20μLAS1411溶液中，震荡反应20分钟后，向混合溶液中加入5μL硼氢化钠溶液（硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:1），避光条件下于恒温摇床反应4小时得到AS1411保护的银纳米簇（AS1411-Ag）。
将300mg天然石墨粉加入到60mL硫酸和20mL硝酸的混合溶液中，超声反应2小时后于100℃条件下搅拌反应24h。反应结束后，冷至室温,用去离子水稀释至800mL，用碳酸钠溶液调节pH值为8，然后通过旋转蒸发除去多余的水以及无机盐，最后将所得的滤液在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天得到焦黄色的石墨烯量子点溶液GOD。称取3 g 氢氧化钠和3 g氯乙酸钠加入到10mL GQD溶液中，超声反应2h，然后在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天除去未反应的小分子离子，得到表面羧基化的GOD水溶液。
将浓度为6mg/mL的聚乙烯亚胺PEI（分子量为25K）溶液逐滴加入到10mL羧基化的GOD水溶液中，超声混合5分钟后，分两次加入120mg的EDC，室温搅拌反应24h，然后再依次加入1.2 g尿素和1.2 g氯化钠，继续反应30分钟后13000 rmp条件下离心5分钟，最后将上层溶液转移至100 K的透析袋中透析4天以除去未反应完的PEI，得到稳定的带正电荷的聚乙烯亚胺修饰的GQD水溶液（PEI-GOD）。
将5μLAS1411保护的银纳米簇溶液与10μLPEI-GQD溶液分别稀释至1mL后混合，放在恒温培养摇床上反应2小时得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料。
向2mL上述制备的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料溶液中加入0.5mL浓度为1mg/mL的阿霉素溶液，避光条件下反应4小时，然后将反应液转移到透析袋中除去未反应的阿霉素，最后得到负载有抗癌药物阿霉素的同时具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag/DOX。
本发明是以与癌细胞表面的核仁素(nucleolin)特异性结合的多功能抗癌适配体AS1411为模板，生成被AS1411保护的银纳米簇，然后将其通过静电作用与聚阳离子高分子修饰过的石墨烯量子点(GQD)组装复合在一起（产物结构式如图1所示），最后再通过π-π作用吸附具有芳环结构的抗癌药物，构筑具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag。
图2a是所制备的GQD水溶液的照片，GQD水溶液为橙黄色，经几个月的放置并没有出现分层或者沉淀的现象，性质较稳定，经PEI修饰后，与带负电的银簇通过静电作用复合得到GOD/AS1411-Ag，图2b是负载上抗癌药物DOX的GOD/AS1411-Ag溶液照片，溶液呈现红色，药物负载率为83.75%。
图3分别是所制备的AS1411-Ag(a)，GOD(b)和GOD/AS1411-Ag(c)的TEM照片，从图中可以清晰的看出，AS1411-Ag和GQD的粒径尺寸都比较均匀，大概均为2 nm-3 nm左右，分散性较好，两者复合之后，粒径增加至15nm左右，但是分散性仍然较好。图4、5、6是所制备的AS1411-Ag，GOD和GOD/AS1411-Ag的荧光图谱，AS1411-Ag在325nm的激发下出现了位于420nm处的发射峰，在510nm的激发下出现了位于680nm处的发射峰；GQD的荧光光谱呈现激发波长依赖型的荧光特性，比如当激发光波长为300nm时，荧光发射峰位于432nm处，当激发光波长为400nm时，荧光发射峰位于512nm处，当激发光波长为500nm，荧光发射峰位于610nm处；AS1411-Ag和GQD复合后，GOD/AS1411-Ag的荧光光谱仍然呈现激发波长依赖型的荧光特性，但是由于AS1411-Ag的存在，位于300nm和510nm波长的激发下，其荧光发射峰与GOD相比均发生了蓝移，分别蓝移至410nm和620nm，而其他波长激发下的荧光光谱与GOD相比没有发生变化，这说明AS1411-Ag和GQD成功地复合在一起，并且GOD/AS1411-Ag的荧光很好地保留了GOD和AS1411-Ag的荧光性能，有利于对细胞的荧光成像检测(如图7所示)。图7中绿色为银簇所发射的荧光，两个红色分别是GOD和阿霉素的荧光。当GOD/AS1411-Ag负载上抗癌药物DOX后，由于复合材料中银的拉曼增强效应，如图8所示，SERS图谱中可以检测到DOX位于464cm-1的峰和石墨烯位于1338cm-1的D带峰。以上的结果表明，实施例1中得到的GOD/AS1411-Ag/DOX能够同时用于靶向肿瘤细胞的荧光和拉曼的双模态成像检测及同步治疗。
实施例2
将AS1411溶于pH值为7.4的KCl/K3PO4缓冲溶液，使AS1411的浓度为1mg/mL，然后按照硝酸银与AS1411的摩尔比为6:1的条件，在混合冰浴（0-4 ℃）下，将5μL硝酸银溶液加入到20μL AS1411溶液中，震荡反应20分钟后，向混合溶液中加入5μL硼氢化钠溶液（硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:1），避光条件下于恒温摇床反应4小时得到AS1411保护的银纳米簇（AS1411-Ag）。
将300mg天然石墨粉加入到60mL硫酸和20mL硝酸的混合溶液中，超声反应2小时后于100℃条件下搅拌反应24h。反应结束后，冷至室温,用去离子水稀释至800mL，用碳酸钠溶液调节pH值为8，然后通过旋转蒸发除去多余的水以及无机盐，最后将所得的滤液在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天得到焦黄色的石墨烯量子点溶液GOD。称取3 g 氢氧化钠和3 g氯乙酸钠加入到10mL GQD溶液中，超声反应2h，然后在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天除去未反应的小分子离子，得到表面羧基化的GOD水溶液。
将浓度为6mg/mL的聚乙醇氨（PEG-NH2）（分子量为10K）溶液逐滴加入到10mL羧基化的GOD水溶液中，超声混合5分钟后，分两次加入120mg的EDC，室温搅拌反应24h，然后再依次加入1.2 g尿素和1.2 g氯化钠，继续反应30分钟后13000 rmp条件下离心5分钟，最后将上层溶液转移至100 K的透析袋中透析4天以除去未反应完的聚乙醇氨，得到稳定的带正电荷的聚乙醇氨修饰的GQD水溶液（PEG-GOD）。
将5μL AS1411保护的银纳米簇溶液与10μL PEG-GQD溶液分别稀释至1mL后混合，放在恒温培养摇床上反应2小时得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料。
向2mL上述制备的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料溶液中加入0.5mL浓度为1mg/mL的阿霉素溶液，避光条件下反应4小时，然后将反应液转移到透析袋中除去未反应的阿霉素，最后得到负载有抗癌药物阿霉素的同时具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag/DOX。
实施例3
将AS1411溶于pH值为7.4的KCl/K3PO4缓冲溶液，使AS1411的浓度为1mg/mL，然后按照硝酸银与AS1411的摩尔比为6:1的条件，在混合冰浴（0-4 ℃）下，将5μL硝酸银溶液加入到20μL AS1411溶液中，震荡反应20分钟后，向混合溶液中加入5μL硼氢化钠溶液（硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:1），避光条件下于恒温摇床反应4小时得到AS1411保护的银纳米簇（AS1411-Ag）。
将400mg天然石墨粉加入到75mL硫酸和25mL硝酸的混合溶液中，超声反应2小时后于100℃条件下搅拌反应24h。反应结束后，冷至室温,用去离子水稀释至1000mL，用碳酸钠溶液调节pH值为8，然后通过旋转蒸发除去多余的水以及无机盐，最后将所得的滤液在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天得到焦黄色的石墨烯量子点溶液GOD。称取3 g 氢氧化钠和3 g氯乙酸钠加入到10mL GQD溶液中，超声反应2h，然后在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天除去未反应的小分子离子，得到表面羧基化的GOD水溶液。
将浓度为6mg/mL的脱乙酰壳聚糖溶液逐滴加入到10mL羧基化的GOD水溶液中，超声混合5分钟后，分两次加入120mg的EDC，室温搅拌反应24h，然后再依次加入1.2 g尿素和1.2 g氯化钠，继续反应30分钟后13000 rmp条件下离心5分钟，最后将上层溶液转移至100K的透析袋中透析4天以除去未反应完的壳聚糖，得到稳定的带正电荷的壳聚糖修饰的GQD水溶液。
将5μL AS1411保护的银纳米簇溶液与10μL壳聚糖修饰的GQD溶液分别稀释至1mL后混合，放在恒温培养摇床上反应2小时得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料。
向2mL上述制备的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料溶液中加入0.5mL浓度为1mg/mL的甲氨蝶呤溶液，避光条件下反应4小时，然后将反应液转移到透析袋中除去未反应的甲氨蝶呤（MTX），最后得到负载有抗癌药物甲氨蝶呤的同时具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag/MTX。
实施例4
将AS1411溶于pH值为7.4的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液，使AS1411的浓度为1mg/mL，然后按照硝酸银与AS1411的摩尔比为6:1的条件，在混合冰浴（0-4 ℃）下，将5μL硝酸银溶液加入到20μL AS1411溶液中，震荡反应20分钟后，向混合溶液中加入5μL硼氢化钠溶液（硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:1），避光条件下于恒温摇床反应4小时得到AS1411保护的银纳米簇（AS1411-Ag）。
将300mg天然石墨粉加入到60mL硫酸和20mL硝酸的混合溶液中，超声反应2小时后于100℃条件下搅拌反应24h。反应结束后，冷至室温,用去离子水稀释至800mL，用碳酸钠溶液调节pH值为8，然后通过旋转蒸发除去多余的水以及无机盐，最后将所得的滤液在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天得到焦黄色的石墨烯量子点溶液GOD。称取3 g 氢氧化钠和3 g氯乙酸钠加入到10mL GQD溶液中，超声反应2h，然后在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天除去未反应的小分子离子，得到表面羧基化的GOD水溶液。
将浓度为6mg/mL的聚ε-赖氨酸（分子量为70K）溶液逐滴加入到10mL羧基化的GOD水溶液中，超声混合5分钟后，分两次加入120mg的EDC，室温搅拌反应24h，然后再依次加入1.2 g尿素和1.2 g氯化钠，继续反应30分钟后13000 rmp条件下离心5分钟，最后将上层溶液转移至100 K的透析袋中透析4天以除去未反应完的PLS，得到稳定的带正电荷的聚ε-赖氨酸修饰的GQD水溶液（PLS-GOD）。
将5μL AS1411保护的银纳米簇溶液与10μL PLS-GQD溶液分别稀释至1mL后混合，放在恒温培养摇床上反应2小时得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料。
向2mL上述制备的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料溶液中加入0.5mL浓度为1mg/mL的阿霉素溶液，避光条件下反应4小时，然后将反应液转移到透析袋中除去未反应的阿霉素，最后得到负载有抗癌药物阿霉素的同时具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag/DOX。
实施例5
将AS1411溶于pH值为7.4的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液，使AS1411的浓度为0.05mg/mL，然后按照硝酸银与AS1411的摩尔比为6:1的条件，在混合冰浴（0-4 ℃）下，将5μL硝酸银溶液加入到20μL AS1411溶液中，震荡反应25 min后，向混合溶液中加入5μL硼氢化钠溶液（硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:1），避光条件下于恒温摇床反应3小时得到AS1411保护的银纳米簇（AS1411-Ag）。
将300mg天然石墨粉加入到60mL硫酸和20mL硝酸的混合溶液中，超声反应3小时后于100℃条件下搅拌反应24h。反应结束后，冷至室温，用去离子水稀释至500mL，用碳酸钠溶液调节pH值为8，然后通过旋转蒸发除去多余的水以及无机盐，最后将所得的滤液在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天得到焦黄色的石墨烯量子点溶液GOD。称取4 g 氢氧化钠和4 g氯乙酸钠加入到10mL GQD溶液中，超声反应3h，然后在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天除去未反应的小分子离子，得到表面羧基化的GOD水溶液。
将浓度为6mg/mL的聚ε-赖氨酸（分子量为70K）溶液逐滴加入到10mL羧基化的GOD水溶液中，超声混合5分钟后，分两次加入120mg的EDC.HCl，室温搅拌反应24h，然后再依次加入1..0 g尿素和1.0 g氯化钠，继续反应30分钟后13000 rmp条件下离心5分钟，最后将上层溶液转移至100 K的透析袋中透析4天以除去未反应完的PLS，得到稳定的带正电荷的聚ε-赖氨酸修饰的GQD水溶液（PLS-GOD）。
将1μL AS1411保护的银纳米簇溶液与1μL PLS-GQD溶液分别稀释至1mL后混合，放在恒温培养摇床上反应2小时得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料。
向2mL上述制备的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料溶液中加入0.4mL浓度为1mg/mL的阿霉素溶液，避光条件下反应4小时，然后将反应液转移到透析袋中除去未反应的阿霉素，最后得到负载有抗癌药物阿霉素的同时具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag/DOX。
实施例6
将AS1411溶于pH值为7.4的K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液，使AS1411的浓度为0.08mg/mL，然后按照硝酸银与AS1411的摩尔比为6:1的条件，在混合冰浴（0-4 ℃）下，将5μL硝酸银溶液加入到20μL AS1411溶液中，震荡反应-30 min后，向混合溶液中加入5μL硼氢化钠溶液（硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:1），避光条件下于恒温摇床反应5小时得到AS1411保护的银纳米簇（AS1411-Ag）。
将300mg天然石墨粉加入到60mL硫酸和20mL硝酸的混合溶液中，超声反应3.5小时后于100℃条件下搅拌反应24h。反应结束后，冷至室温，用去离子水稀释至800mL，用碳酸钠溶液调节pH值为8，然后通过旋转蒸发除去多余的水以及无机盐，最后将所得的滤液在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天得到焦黄色的石墨烯量子点溶液GOD。称取5 g 氢氧化钠和5 g氯乙酸钠加入到10mL GQD溶液中，超声反应4h，然后在截留分子量为8000-14000的透析袋中透析4天除去未反应的小分子离子，得到表面羧基化的GOD水溶液。
将浓度为6mg/mL的聚ε-赖氨酸（分子量为70K）溶液逐滴加入到10mL羧基化的GOD水溶液中，超声混合5分钟后，分两次加入120mg的EDC.HCl，室温搅拌反应48h，然后再依次加入1.5 g尿素和1.5 g氯化钠，继续反应30分钟后13000 rmp条件下离心5分钟，最后将上层溶液转移至100 K的透析袋中透析4天以除去未反应完的PLS，得到稳定的带正电荷的聚ε-赖氨酸修饰的GQD水溶液（PLS-GOD）。
将3μL AS1411保护的银纳米簇溶液与5μL PLS-GQD溶液分别稀释至1mL后混合，放在恒温培养摇床上反应2小时得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料。
向2mL上述制备的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料溶液中加入1mL浓度为1mg/mL的阿霉素溶液，避光条件下反应4小时，然后将反应液转移到透析袋中除去未反应的阿霉素，最后得到负载有抗癌药物阿霉素的同时具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂GOD/AS1411-Ag/DOX。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂，其特征在于：诊疗试剂由苯环类抗癌药物、石墨烯量子点和以AS1411为模板制备的银纳米簇制成，其中石墨烯量子点与银纳米簇复合成GOD/AS1411-Ag纳米材料，通过π-π堆垛作用将苯环类抗癌药物负载在GOD/AS1411-Ag纳米材料上制成诊疗试剂。
2.根据权利要求1所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂，其特征在于：所述苯环类抗癌药物为阿霉素或甲氨蝶呤。
3.权利要求1或2所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）将AS1411溶于钾离子缓冲溶液得到AS1411溶液，在混合冰浴下，将硝酸银溶液加入到AS1411溶液中，震荡反应20-30 min后得到混合溶液，向混合溶液中加入硼氢化钠溶液，避光条件下于恒温摇床反应3-5 h得到AS1411银纳米簇；
（2）将石墨粉加入到硫酸和硝酸的混合溶液中，超声反应2-3.5 h后于100 ℃条件下搅拌反应24 h；反应结束后，冷至室温，用去离子水稀释至500-1000mL，调节pH值为8，旋转蒸发除去水和无机盐，将所得的滤液在透析袋中透析4天得到石墨烯量子点溶液；将氢氧化钠和氯乙酸钠加入到石墨烯量子点溶液中，超声反应2-4h，然后在透析袋中透析4天，得到表面羧基化的GOD水溶液；
（3）将含氨基的阳离子高分子溶液逐滴加入到步骤（2）中得到的表面羧基化的GOD水溶液中，超声混合5-10 min后，分两次加入EDC.HCl，室温搅拌反应24-48 h，然后再依次加入尿素和氯化钠，继续反应30-60 min后离心5-10 min，最后将上层溶液转移至透析袋中透析4天，得到聚阳离子修饰的GQD水溶液；
（4）将步骤（1）得到的AS1411银纳米簇与步骤（3）中的聚阳离子修饰的GQD水溶液分别稀释后混合，在恒温培养摇床上反应2-4 h得到GOD/AS1411-Ag复合纳米材料；
（5）向步骤（4）得到的GOD/AS1411-Ag复合纳米材料中加入含苯环类抗癌药物溶液，避光条件下反应4-24 h，然后将反应液转移到透析袋中透析4天，得到诊疗试剂。
4.根据权利要求3所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中钾离子缓冲溶液的pH为7.4，钾离子缓冲溶液为KCl/K3PO4缓冲溶液或K2HPO4/KH2PO4缓冲溶液。
5.根据权利要求3所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中AS1411溶液的浓度为0.05-1 mg/mL；硝酸银、AS1411和硼氢化钠的摩尔比为6：1：1。
6.根据权利要求3所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中硫酸和硝酸的体积比为3:1，氢氧化钠和氯乙酸钠的质量比为1:1，1 ml石墨烯量子点溶液中加入0.3-0.5 g氢氧化钠。
7.根据权利要求3所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中含氨基的阳离子高分子溶液为浓度为6 mg/mL的聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚赖氨酸或多臂氨基聚乙二醇溶液；以10ml步骤（2）中得到的表面羧基化的GOD水溶液为基准，含氨基的阳离子高分子溶液的加入量为10mL，EDC两次的加入量为120mg，尿素和氯化钠的加入量均为1.0-1.5g。
8.根据权利要求3所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中将1-5μL AS1411银纳米簇与1-10μL聚阳离子修饰的GQD水溶液分别稀释至1ml后混合。
9.根据权利要求3所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中含苯环类抗癌药物溶液的浓度为1mg/mL，GOD/AS1411-Ag复合纳米材料与含苯环类抗癌药物溶液的体积比为1：（0.2-0.5）。
10.根据权利要求3所述的具有SERS/荧光双模态靶向肿瘤细胞成像的诊疗试剂的制备方法，其特征在于：所述透析袋的截留分子量为8000-14000。
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