CN105267966A - 一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型及其制备方法和应用，所述的纳米药物剂型包括载体GQD-SS-PEG和负载于GQD-SS-PEG上的光敏剂，其中光敏剂的负载量为5～9wt％，其通过以下步骤制备得到：(A)将EDC加到GQD溶液中，超声处理，再加入PEG-SS-NH₂，室温搅拌进行反应，再除去反应产物中的杂质，得到GQD-SS-PEG水溶液；(B)往GQD-SS-PEG水溶液中添加光敏剂DMSO溶液，混合后超声处理，然后在室温、黑暗条件下搅拌反应；(C)将步骤(B)的反应产物离心分离后，将所得上清液超滤除去未负载的光敏剂，即得到最终目的产物，所制得的药物剂型主要用于抑制肿瘤生长。与现有技术相比，本发明具有纳米药物剂型的光敏剂的靶向性强，药物治疗的有效性高，药物具有选择性杀伤特性等优点。

Description

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及光动力治疗领域，尤其是涉及一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型及其制备方法和应用。

背景技术

光动力治疗(PDT)是近年来发展起来的一种通过生物光敏化作用来损伤肿瘤组织的新型肿瘤疗法。其通过利用被肿瘤细胞所吸收的光敏剂，外加以特定波长的光照，从而诱发肿瘤细胞组织被破坏。与传统的手术、化疗、放疗等常规治疗手段相比，PDT的优点在于：(1)能选择性地消灭特定部位的原发和复发肿瘤，而不伤及正常组织；(2)可与化疗和放疗同时进行，且均具有一定的协同作用；(3)可缩小手术的范围和改善患者的愈后。PDT与其他疗法相比，虽然有着明显的优势，但目前仍存在着许多问题，其面临的主要挑战是：(1)光敏剂靶向选择性不强，在肿瘤部位的富集程度有限，治疗效果不理想；(2)光敏剂的非特异性免疫，导致正常组织细胞受损。

目前，光敏剂的纳米药物载体主要包括两大类：有机纳米载体、无机纳米药物载体。其中有机纳米载体主要有纳米脂质体、纳米乳、聚合物胶束；无机纳米药物载体主要有磁性Fe₃O₄纳米粒子、氧化硅纳米粒子、氧化石墨烯。相比于其它纳米载体而言，氧化石墨烯具有高的载药率、易于修饰靶向分子、荧光淬灭(可作为特异性激活的淬灭剂)等特点。而目前研究的光敏剂的特异性激活种类主要包括蛋白酶激活、核酸激活、环境激活等，这些激活都存在适用范围小、不具有普适性等问题，使特异性激活的效果受到限制。由于细胞中的谷胱甘肽是一种良好的还原剂，而肿瘤细胞中谷胱甘肽的含量是正常细胞的4陪，肿瘤细胞内谷胱甘肽的含量百倍于肿瘤细胞外，因此还原敏感激活作为光敏剂的特异性激活具有巨大的潜力。

中国专利201010252761.8公开了一种及用于光动力治疗的纳米氧化石墨烯载体的制备方法，该方法将纳米氧化石墨烯表面经亲水性聚合物修饰后，再通过π-π堆积和疏水-疏水相互作用，负载含有大π共轭结构的疏水性光敏剂，即得到可用于光动力治疗的产品。该专利的纳米氧化石墨烯所负载的光敏剂的靶向性相对较弱，从而使得光动力治疗效果较差。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，包括载体GQD-SS-PEG和负载于GQD-SS-PEG上的光敏剂，其中光敏剂的负载量为5～9wt％。

所述的GQD-SS-PEG(含二硫键的聚乙二醇修饰的石墨烯量子点)由石墨烯量子点(GQD)与PEG-SS-NH₂缩合反应制得，其中，所述的石墨烯量子点的粒径为2～5nm，所述石墨烯量子点呈单分散态，尺寸比较窄，拥有很强的量子限制效应和边缘效应，表面含有羟基、羰基、羧基等基团，有利于功能化修饰。

所述的石墨烯量子点通过酸氧化法制备而成，包括以下步骤：

(1)将浓硫酸和浓硝酸的混酸，以及碳纤维粉置入反应器内，机械搅拌下升温至75～85℃反应10～14h，得到反应液，其中，混酸为98wt％的浓硫酸与67wt％的浓硝酸按体积比1：(0.5～2)混合而成，混酸与碳纤维粉的添加量之比为1000mL：(10～80)g；

(2)将反应液倒入二次水中超声处理1～3h，其中，反应液与二次水的体积比为1：(1～5)，用水稀释后，加NaOH调节pH为1，再用Na₂CO₃调整pH为中性，冷却，除去盐分，得到石墨烯量子点水溶液，去除水分后即得到石墨烯量子点。

所述的PEG-SS-NH₂通过以下步骤制备而成：

(a)在氮气保护下，将EDC·HCl(EDC，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入到溶有羧基PEG的二氯甲烷溶液中，其中，EDC·HCl、NHS和羧基PEG的添加量的摩尔比为(0.3～0.8)：(0.1～0.4)：(0.1～0.35)，搅拌反应4～6h；

(b)随后滴加含二硫和二氨基的化合物，其与羧基PEG的添加量的摩尔比为(0.2～3)：(0.1～0.35)，常温继续反应20～28h，分离得到反应产物；

(c)将反应产物置于冷乙醚中提纯，干燥后得到PEG-SS-NH₂。

步骤(a)中所述的羧基PEG是官能团包括羧基但不局限于含一个羧基基团修饰的PEG或含两个羧基基团修饰的PEG；优选的，羧基PEG为数均分子量为2000～10000的具有一个琥珀酸基或两个琥珀酸基的线形PEG，其中，一个琥珀酸基的线形PEG的化学式为：

两个琥珀酸基的线形PEG的化学式为：

其中，n的取值范围为50～200；更为优选的，数均分子量为5000，n取值为110。

步骤(b)中所述的含二硫和二氨基的化合物的通式为

其中，R₁和R₂均选自二价烷基或芳香基中的一种；优选的，含二硫和二氨基的化合物可以是胱胺、4,4'-二硫代二苯胺、双(2-氨基苯基)二硫的一种；更为优选的，含二硫和二氨基的化合物为胱胺。

上述含二硫和二氨基的化合物中，胱胺可以通过以下方法制备得到：

在30mL去离子水溶液中，加入1.1mmol胱胺盐酸盐和2.2mmolNaOH，室温搅拌反应30min；通过旋转蒸发除去水溶液，得到胱胺粗产品，随后加入适量二氯甲烷溶液溶解生成的胱胺粗产品，过滤不溶性盐；30℃下旋转蒸发二氯甲烷溶液，得到淡黄色胱胺产物。

所述的光敏剂选自二氢卟酚e6(Ce6)、苯并卟啉衍生物或焦脱镁叶绿酸a中的一种；Ce6具备660nm左右波长吸收峰，苯并卟啉衍生物的红光区吸收波长可达780nm，焦脱镁叶绿酸a在可见红光区(λ＝664nm)有较强的特征吸收，而光动力治疗中，光对人体软组织的穿透在近红外光区(波长620～1300nm)与波长呈正比，这三种均在此波长范围内均有吸收峰，符合波长为600～800nm的“光动力治疗窗”；优选的，苯并卟啉衍生物为苯并卟啉衍生物单酸环。Ce6还有单线态氧产率高、在体内清除速度快、皮肤存留时间短等特点。

上述光敏剂中，苯并卟啉衍生物单酸环可以通过以下方法制备得到：

将1g原卟啉IX二甲酯溶于100mL甲苯中，加入1mLDMAD(丁炔二酸二甲酯)，避光回流7d。减压蒸除溶剂，残渣经硅胶柱色谱分离，洗脱剂二氯甲烷-乙醚-丙酮(10：0.5：0.1，v/v)进行洗脱，得到异苯并卟啉衍生物二酯环；

将100mg的异苯并卟啉衍生物二酯环溶于10mLCH₂Cl₂中，滴加0.6mLEt₃N，加热回流2h。减压蒸除溶剂及Et₃N，残留物经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂二氯甲烷-乙醚-丙酮(10：0.6：0.1，v/v)进行洗脱，得苯并卟啉衍生物二酯环；

将100mg苯并卟啉衍生物二酯环加入10mL25％盐酸中，室温搅拌10min。用饱和醋酸钠溶液中和至pH4～5，滤集析出的沉淀，固体用硅胶柱色谱分离，洗脱剂氯仿-丙酮-甲醇-甲酸(10：0.8：0.6：0.1，v/v)进行洗脱，得苯并卟啉衍生物单酸环。

焦脱镁叶绿酸a可以通过以下方法制备得到：

1000mL的圆底烧瓶中加入叶绿素初提物100g，用300mL2,4,6-三甲基吡啶溶解，在油浴中加热回流反应5h，回收吡啶。往烧瓶中加入300mL丙酮使产物溶解后，再加入30mL98wt％的浓硫酸，室温下搅拌30min。然后用300mL、9M硫酸水溶液萃取反应液，静置一段时间后取下层水溶液，对上层蜡状物再用9M硫酸水溶液萃取2次，每次约200mL，合并水相。用500mL石油醚萃取水相，除去叶黄素等杂质，收集水相，再用二氯甲烷萃取三次，合并有机相。用五水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层分离。以二氯丙烷-丙酮洗脱，得焦脱镁叶绿酸a。

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，包括以下步骤：

(A)将EDC加到GQD溶液中，超声处理，再加入PEG-SS-NH₂，室温搅拌进行反应，再除去反应产物中的杂质，得到GQD-SS-PEG水溶液；

(B)往GQD-SS-PEG水溶液中添加光敏剂DMSO溶液，混合后超声处理，然后在室温、黑暗条件下搅拌反应；

(C)将步骤(B)的反应产物离心分离后，将所得上清液超滤除去未负载的光敏剂，即得到最终目的产物。

步骤(A)中所述的GQD溶液的浓度为1mg/mL，添加的EDC、GQD和PEG-SS-NH₂的质量比为(7～15)：(8～15)：(80～150)；

所述的超声处理的时间为3～10min，室温搅拌反应的时间为20～28h；

反应产物中的杂质是通过在水中透析除去的。

步骤(B)中：GQD-SS-PEG水溶液的浓度为1mg/mL，光敏剂DMSO溶液的浓度为25μg/mL，GQD-SS-PEG水溶液与光敏剂DMSO溶液的添加量的体积比为(0.5～1.5)：(8～15)；

GQD-SS-PEG水溶液与光敏剂DMSO溶液混合后超声处理的时间为0.2～1h；

黑暗处搅拌反应的时间为10～15h。

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型用于制备抑制肿瘤生长的药物。

本发明通过将制备得到的PEG-SS-NH₂和GQD混合反应，得到功能化修饰后的GQD-SS-PEG，然后在上面负载光敏剂，即得到最终目的产物。本发明采用石墨烯量子点作为载体，与传统石墨烯负载的光敏剂相比，石墨烯量子点负载的光敏剂的靶向性更强，能够更快、更多的富集于肿瘤部位。利用石墨烯量子点的小尺寸效应，可构建出对肿瘤组织具有更强的血管渗透与滞留效应(EPR效应)的纳米药物输送系统，从而，更好的实现光敏剂的被动靶向输送。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)石墨烯量子点上PEG的修饰提高了其在细胞培养基及PBS(磷酸盐缓冲液，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾)溶液中的稳定性并延长了体内循环时间，引入的亲水性PEG和疏水性药物之间的氧化还原敏感的二硫键有利于药物释放肿瘤细胞的氧化还原环境，从而大大提高了治疗的有效性；

2)利用石墨烯量子点大的比表面积和平面结构，通过π-π共轭和疏水作用对光敏剂进行负载，同时光敏剂的荧光和单线态氧产率被大幅地淬灭；

3)采用二硫键连接PEG与石墨烯，使得其在GSH(谷胱甘肽)或DTT(二硫苏糖醇)环境下，能将阻碍药物释放的PEG脱落，使得光敏剂脱离具有淬灭效应的GQD，从而在靶向部位选择性恢复光敏剂的杀伤特性；

4)GQD-SS-PEG中的二硫键在血浆中是稳定存在的，而在还原试剂(如GSH、DTT)的存在下，二硫键快速断裂，导致PEG脱落。在肿瘤细胞环境下，连接PEG和石墨烯的二硫键断裂，导致光敏剂药物释放速率加大，光敏剂从石墨烯量子点表面游离出来，光敏剂的单线态氧产率就得到了恢复，可以有效的抑制肿瘤的生长。

5)制备工艺简单，条件温和不苛刻。

附图说明

图1为本发明的GQD-SS-PEG/Ce6与GQD-SS-PEG的紫外吸收标准曲线图；

图2为本发明的GQD-SS-PEG/Ce6的荧光光谱图；

图3为GSH环境对GQD-SS-PEG/Ce6体外药物释放的影响图；

图4为GSH环境下GQD-SS-PEG/Ce6体系的单线态氧恢复图；

图5为Hela细胞与不同浓度的不同药物剂型的体外光动力治疗效果图；

图6为Hela细胞与不同药物剂型的激光共聚焦图；

图7为本发明的实施例1制得的GQD-SS-PEG/Ce6在动物体内抗肿瘤水平光动力学治疗效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明所制得的还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的性能，主要通过以下方法进行评价，以GQD-SS-PEG/Ce6为例：

(1)GSH刺激Ce6-GQD-SS-PEG的体外药物释放测定方法：

将载Ce6的GQD-SS-PEG直接放入准确量取的200mL2μM或10mMGSH溶液中进行释药，实验温度为37℃，摇床转速为150rpm；在特定时间，取2mL上清液，并另外向体系中加入等量的GSH溶液。通过荧光光谱仪测定药物释放量。Ce6的激发射波长为405nm。通过以下公式计算Ce6在72h内的累计释放率：Ce6的累计释放率(％)＝(Mt/M₀)×100％，Mt为t时刻Ce6从GQD-SS-PEG上的释放量，M₀为GQD-SS-PEG的初始药物装载量。

(2)光线态氧产率，采用绿色单线态氧探针(SOSG)作为单线态氧的捕获剂SOSG在未和单线态氧发生反应前，分子内的电子转移淬灭了生色团的荧光。当SOSG与单线态氧发生反应后，形成内过氧化物(endoperoxide)，导致电子转移发生改变，生色团的荧光不被淬灭，得到恢复。因此，可通过SOSG的荧光强度来判断光敏剂的单线态氧产率。采用SOSG作为单线态氧的捕获剂，进行单线态氧淬灭及恢复实验：溶液中单线态氧的产生，将会导致SOSG在530nm处的荧光强度显著上升。因此，SOSG在530nm处的荧光强度的上升量直接反映了单线态氧的产量。向GQD-SS-PEG/Ce6的PBS溶液中，加入SOSG的PBS溶液，保持SOSG及Ce6的终浓度均为1μM。用650nm的激光以0.1W/cm²的光强照射不同的时间，测量溶液在440nm激发波长下的荧光强度的变化。

(3)体外光动力学治疗效果评价方法

以Hela细胞为研究对象，用四甲基偶氮唑(MTT)检测细胞的存活率。

存活率＝(OD_treated/OD_control)×100％，其中OD_control是没有加入材料时的吸光值，OD_treated是加入材料后测得的吸光值。根据吸光值计算细胞相对成活率。

(4)荷瘤裸鼠的光动力学治疗评价方法

通过游标卡尺测量肿瘤的两个维度，肿瘤体积计算公式为V＝WL²/2(W代表肿瘤的长径，L代表肿瘤的短径)。

实施例1

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，制备方法包括以下步骤：

(1)在氮气保护下，将0.62mmol的EDC·HCl，0.23mmol的NHS加入到溶有0.2mmolCH₃O-PEG-COOH的二氯甲烷溶液中，搅拌反应5h；将1mmol的胱胺随后滴加到上步反应溶液中，常温继续反应24h，得到PEG-SS-NH₂粗产物，通过在冷乙醚中沉淀两次提纯后，真空干燥得到PEG-SS-NH₂。

(2)将10mgEDC加入到10mL浓度为1mg/mL的GQD溶液中，超声5min；然后将100mgPEG-SS-NH₂加入到上述溶液中，室温搅拌24h；最后通过在水溶液中透析，出去反应杂质，得到二硫键连接，PEG修饰的石墨烯量子点GQD-SS-PEG。

(3)将1mL浓度为25μg/mL的Ce6加入到10mL浓度为1mg/mL的GQD-SS-PEG水溶液中，所得的混合液超声0.5h；然后在室温下，黑暗处搅拌12h，13000的转速离心1h分离反应后溶液；将所得到的上清液用Mw：10kDa的超滤管超滤，除去未负载的Ce6。在光敏剂的负载过程中，GQD-SS-PEG溶液的颜色逐渐由棕色变成蓝色。

对制得的GQD-SS-PEG/Ce6(负载光敏剂Ce6的GQD-SS-PEG)进行紫外吸收检测，如图1所示，可以发现，在405和655nm处出现Ce6的特征吸收峰，表明Ce6能成功负载到GQD-SS-PEG上。Ce6的包封率通过其在405nm处的紫外吸收标准曲线获得(扣除了GQD-SS-PEG在此处的吸收)，为7wt％。

实施例2

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，包括载体GQD-SS-PEG和负载于GQD-SS-PEG上的光敏剂Ce6，其中光敏剂的负载量为5wt％。

上述还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，包括以下步骤：

(A)将7mgEDC加到8mL浓度为1mg/mL的GQD溶液中，超声处理3min，再加入80mgPEG-SS-NH₂，室温搅拌进行反应20h，再通过在水中透析，除去反应产物中的杂质，得到GQD-SS-PEG水溶液；

(B)往8mL浓度为1mg/mL的GQD-SS-PEG水溶液中添加0.5mL浓度为25μg/mL的光敏剂DMSO溶液，混合后超声处理0.2h，然后在室温、黑暗条件下搅拌反应10h；

(C)将步骤(B)的反应产物离心分离后，将所得上清液用Mw：10kDa的超滤管超滤，除去未负载的光敏剂，即得到最终目的产物负载光敏剂的GQD-SS-PEG。

所述的GQD-SS-PEG由石墨烯量子点与PEG-SS-NH₂缩合反应制得，石墨烯量子点的粒径为2nm。

GQD通过以下步骤制备得到：

(1)将浓硫酸和浓硝酸的混酸，以及碳纤维粉置入反应器内，机械搅拌下升温至75℃反应10h，得到反应液，其中，混酸为98wt％的浓硫酸与67wt％的浓硝酸按体积比1：0.5混合而成，混酸与碳纤维粉的添加量之比为1000mL：10g；

(2)将反应液倒入二次水中超声处理1h，其中，反应液与二次水的体积比为1：1～5，用水稀释后，加NaOH调节pH为1，再用Na₂CO₃调整pH为中性，冷却，除去盐分，得到石墨烯量子点水溶液，去除水分后即得到石墨烯量子点。

PEG-SS-NH₂通过以下步骤制备而成：

(a)在氮气保护下，将EDC·HCl和NHS加入到溶有羧基PEG的二氯甲烷溶液中，其中，EDC·HCl、NHS和羧基PEG的添加量的摩尔比为0.3：0.1：0.1，搅拌反应4h；

(b)随后滴加含二硫和二氨基的化合物，其与羧基PEG的添加量的摩尔比为0.2：0.1，常温继续反应20h，分离得到反应产物；

(c)将反应产物置于冷乙醚中提纯，干燥后得到PEG-SS-NH₂。

上述反应中，羧基PEG为数均分子量为2000的具有一个琥珀酸基化学式为：

其中，n的取值范围为50；

含二硫和二氨基的化合物的为双(2-氨基苯基)二硫，光敏剂为焦脱镁叶绿酸a。

焦脱镁叶绿酸a可以通过以下方法制备得到：

1000mL的圆底烧瓶中加入叶绿素初提物100g，用300mL2,4,6-三甲基吡啶溶解，在油浴中加热回流反应5h，回收吡啶。往烧瓶中加入300mL丙酮使产物溶解后，再加入30mL98wt％的浓硫酸，室温下搅拌30min。然后用300mL、9M硫酸水溶液萃取反应液，静置一段时间后取下层水溶液，对上层蜡状物再用9M硫酸水溶液萃取2次，每次约200mL，合并水相。用500mL石油醚萃取水相，除去叶黄素等杂质，收集水相，再用二氯甲烷萃取三次，合并有机相。用五水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层分离。以二氯丙烷-丙酮洗脱，得焦脱镁叶绿酸a。

实施例3

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，包括载体GQD-SS-PEG和负载于GQD-SS-PEG上的光敏剂，其中光敏剂的负载量为9wt％。

上述还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，包括以下步骤：

(A)将15mgEDC加到15mL浓度为1mg/mL的GQD溶液中，超声处理10min，再加入150mgPEG-SS-NH₂，室温搅拌进行反应28h，再通过在水中透析，除去反应产物中的杂质，得到GQD-SS-PEG水溶液；

(B)往15mL浓度为1mg/mL的GQD-SS-PEG水溶液中添加1.5mL浓度为25μg/mL的光敏剂DMSO溶液，混合后超声处理1h，然后在室温、黑暗条件下搅拌反应15h；

(C)将步骤(B)的反应产物离心分离后，将所得上清液用Mw：10kDa的超滤管超滤，除去未负载的光敏剂，即得到最终目的产物负载光敏剂的GQD-SS-PEG。

所述的GQD-SS-PEG由石墨烯量子点与PEG-SS-NH₂缩合反应制得，石墨烯量子点的粒径为5nm。

GQD通过以下步骤制备得到：

(1)将浓硫酸和浓硝酸的混酸，以及碳纤维粉置入反应器内，机械搅拌下升温至85℃反应14h，得到反应液，其中，混酸为98wt％的浓硫酸与67wt％的浓硝酸按体积比1：2混合而成，混酸与碳纤维粉的添加量之比为1000mL：10g；

(2)将反应液倒入二次水中超声处理1～3h，其中，反应液与二次水的体积比为1：5，用水稀释后，加NaOH调节pH为1，再用Na₂CO₃调整pH为中性，冷却，除去盐分，得到石墨烯量子点水溶液，去除水分后即得到石墨烯量子点。

PEG-SS-NH₂通过以下步骤制备而成：

(a)在氮气保护下，将EDC·HCl和NHS加入到溶有羧基PEG的二氯甲烷溶液中，其中，EDC·HCl、NHS和羧基PEG的添加量的摩尔比为0.8：0.4：0.35，搅拌反应6h；

(b)随后滴加含二硫和二氨基的化合物，其与羧基PEG的添加量的摩尔比为3：0.35，常温继续反应28h，分离得到反应产物；

(c)将反应产物置于冷乙醚中提纯，干燥后得到PEG-SS-NH₂。

上述反应中，羧基PEG为数均分子量为10000的具有两个琥珀酸基的线形PEG，化学式为：

其中，n的取值范围为200；

含二硫和二氨基的化合物的为4,4'-二硫代二苯胺，光敏剂为苯并卟啉衍生物单酸环。

苯并卟啉衍生物单酸环可以通过以下方法制备得到：

将1g原卟啉IX二甲酯溶于100mL甲苯中，加入1mLDMAD，避光回流7d。减压蒸除溶剂，残渣经硅胶柱色谱分离，洗脱剂二氯甲烷-乙醚-丙酮(10：0.5：0.1，v/v)进行洗脱，得到异苯并卟啉衍生物二酯环；

将100mg的异苯并卟啉衍生物二酯环溶于10mLCH₂Cl₂中，滴加0.6mLEt₃N，加热回流2h。减压蒸除溶剂及Et₃N，残留物经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂二氯甲烷-乙醚-丙酮(10：0.6：0.1，v/v)进行洗脱，得苯并卟啉衍生物二酯环；

将100mg苯并卟啉衍生物二酯环加入10mL体积分数为25％盐酸中，室温搅拌10min。用饱和醋酸钠溶液中和至pH4～5，滤集析出的沉淀，固体用硅胶柱色谱分离，洗脱剂氯仿-丙酮-甲醇-甲酸(10：0.8：0.6：0.1，v/v)进行洗脱，得苯并卟啉衍生物单酸环。

实施例4

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，包括载体GQD-SS-PEG和负载于GQD-SS-PEG上的光敏剂，其中光敏剂的负载量为7wt％。

上述还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，包括以下步骤：

(A)将10mgEDC加到14mL浓度为1mg/mL的GQD溶液中，超声处理8min，再加入110mgPEG-SS-NH₂，室温搅拌进行反应22h，再通过在水中透析，除去反应产物中的杂质，得到GQD-SS-PEG水溶液；

(B)往12mL浓度为1mg/mL的GQD-SS-PEG水溶液中添加1.2mL浓度为25μg/mL的光敏剂DMSO溶液，混合后超声处理0.6h，然后在室温、黑暗条件下搅拌反应12h；

(C)将步骤(B)的反应产物离心分离后，将所得上清液用Mw：10kDa的超滤管超滤，除去未负载的光敏剂，即得到最终目的产物负载光敏剂的GQD-SS-PEG。

所述的GQD-SS-PEG由石墨烯量子点与PEG-SS-NH₂缩合反应制得，石墨烯量子点的粒径为3nm。

GQD通过以下步骤制备得到：

(1)将浓硫酸和浓硝酸的混酸，以及碳纤维粉置入反应器内，机械搅拌下升温至80℃反应12h，得到反应液，其中，混酸为98wt％的浓硫酸与67wt％的浓硝酸按体积比1：1.5混合而成，混酸与碳纤维粉的添加量之比为1000mL：45g；

(2)将反应液倒入二次水中超声处理1～3h，其中，反应液与二次水的体积比为1：3，用水稀释后，加NaOH调节pH为1，再用Na₂CO₃调整pH为中性，冷却，除去盐分，得到石墨烯量子点水溶液，去除水分后即得到石墨烯量子点。

PEG-SS-NH₂通过以下步骤制备而成：

(a)在氮气保护下，将EDC·HCl和NHS加入到溶有羧基PEG的二氯甲烷溶液中，其中，EDC·HCl、NHS和羧基PEG的添加量的摩尔比为0.5：0.25：0.22，搅拌反应4.5h；

(b)随后滴加含二硫和二氨基的化合物，其与羧基PEG的添加量的摩尔比为1.6：0.22，常温继续反应22h，分离得到反应产物；

(c)将反应产物置于冷乙醚中提纯，干燥后得到PEG-SS-NH₂。

上述反应中，羧基PEG为数均分子量为5000的具有一个琥珀酸基化学式为：

其中，n的取值范围为110；

含二硫和二氨基的化合物的为胱胺，可以通过以下方法制备得到：

在30mL去离子水溶液中，加入1.1mmol胱胺盐酸盐和2.2mmolNaOH，室温搅拌反应30min，通过旋转蒸发除去水溶液得到反应产物；随后在上述产物中加入适量二氯甲烷溶液溶解生成的胱胺，过滤不溶性盐；30℃下旋转蒸发二氯甲烷溶液，得到淡黄色胱胺产物。

光敏剂为二氢卟酚e6(Ce6)。

实施例5

一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，包括载体GQD-SS-PEG和负载于GQD-SS-PEG上的光敏剂，其中光敏剂的负载量为8wt％。

上述还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，包括以下步骤：

(A)将14mgEDC加到9mL浓度为1mg/mL的GQD溶液中，超声处理5min，再加入120mgPEG-SS-NH₂，室温搅拌进行反应26h，再通过在水溶液中透析，除去反应产物中的杂质，得到GQD-SS-PEG水溶液；

(B)往10mL浓度为1mg/mL的GQD-SS-PEG水溶液中添加1.25mL浓度为25μg/mL的光敏剂DMSO溶液，混合后超声处理0.7h，然后在室温、黑暗条件下搅拌反应13h；

(C)将步骤(B)的反应产物离心分离后，将所得上清液用Mw：10kDa的超滤管超滤，除去未负载的光敏剂，即得到最终目的产物负载光敏剂的GQD-SS-PEG。

所述的GQD-SS-PEG由石墨烯量子点与PEG-SS-NH₂缩合反应制得，石墨烯量子点的粒径为4nm。

GQD通过以下步骤制备得到：

(1)将浓硫酸和浓硝酸的混酸，以及碳纤维粉置入反应器内，机械搅拌下升温至82℃反应13h，得到反应液，其中，混酸为98wt％的浓硫酸与67wt％的浓硝酸按体积比1：1混合而成，混酸与碳纤维粉的添加量之比为1000mL：60g；

(2)将反应液倒入二次水中超声处理2.5h，其中，反应液与二次水的体积比为1：4，用水稀释后，加NaOH调节pH为1，再用Na₂CO₃调整pH为中性，冷却，除去盐分，得到石墨烯量子点水溶液，去除水分后即得到石墨烯量子点。

PEG-SS-NH₂通过以下步骤制备而成：

(a)在氮气保护下，将EDC·HCl和NHS加入到溶有羧基PEG的二氯甲烷溶液中，其中，EDC·HCl、NHS和羧基PEG的添加量的摩尔比为0.4：0.3：0.25，搅拌反应4.5h；

(b)随后滴加含二硫和二氨基的化合物，其与羧基PEG的添加量的摩尔比为1.2：0.15，常温继续反应25h，分离得到反应产物；

(c)将反应产物置于冷乙醚中提纯，干燥后得到PEG-SS-NH₂。

上述反应中，羧基PEG为数均分子量为4000的具有两个琥珀酸基的线形PEG，化学式为：

其中，n的取值为100；

含二硫和二氨基的化合物的为胱胺，光敏剂选自二氢卟酚e6(Ce6)。

实施例6

测量实施例1所制得的GQD-SS-PEG/Ce6的荧光光谱，如图2所示。荧光数据显示，Ce6装载到GQD-SS-PEG上之后，Ce6的荧光强度被大幅地淬灭，这是由于Ce6与石墨烯量子点之间的片层通过π-π作用直接接触所导致的荧光共振能量转移作用所致。GQD-SS-PEG的一个重要性质是二硫键的引入，二硫键在血浆中是稳定存在的，而在还原试剂(如GSH、DTT)的存在下，二硫键快速断裂，导致PEG脱落。因此可以观察到在GQD-SS-PEG/Ce6的溶液中加入DTT后，Ce6荧光又复活。可以证明Ce6可以负载在GQD-SS-PEG上。

实施例7

测量氧化还原环境对实施例1制得的GQD-SS-PEG/Ce6体外药物释放的影响。由实施例6中DTT对GQD-SS-PEG/Ce6荧光的影响，可以认为GQD-SS-PEG具有氧化还原敏感性，因此为了研究氧化还原环境对GQD-SS-PEG体外药物释放的影响，Ce6的体外释放实验分别在含有10mMGSH的PBS溶液和含有2uMGSH的PBS溶液中进行，如图3所示。可以发现：在10mMGSH条件下(肿瘤细胞内GSH含量)，36％Ce6在10h内释放出来，而在2uMGSH情况下(正常细胞内GSH含量)，在82h内只有3％的Ce6释放出来。这表明在肿瘤细胞环境下，连接PEG和石墨烯的二硫键断裂，导致药物释放速率加大。

实施例8

测试GSH环境下对实施例1制得的GQD-SS-PEG/Ce6体系的单线态氧恢复行为。

采用绿色单线态氧探针(SOSG)作为单线态氧的捕获剂，进行单线态氧淬灭及恢复实验：溶液中单线态氧的产生，将会导致SOSG在530nm处的荧光强度显著上升。因此，SOSG在530nm处的荧光强度的上升量直接反映了单线态氧的产量。向GQD-SS-PEG/Ce6的PBS溶液中，加入SOSG的PBS溶液，保持SOSG及Ce6的终浓度均为1μM。用650nm的激光以0.1W/cm²的光强照射不同的时间，测量溶液在440nm激发波长下的荧光强度的变化。

通过绿色单线态氧探针(SOSG)的荧光强度来判断光敏剂的单线态氧产率，如图4所示，在无GSH存在时，GQD-SS-PEG/Ce6体系中Ce6的单线态氧产率被大幅地淬灭。而当GQD-SS-PEG/Ce6体系处于10mMGSH环境下，并作用3h后，体系中Ce6的单线态氧产率又得到了恢复。这同样是因为在无GSH存在时，GQD-SS-PEG中二硫键是稳定的，Ce6被紧密地负载于石墨烯量子点上，Ce6与石墨烯量子点之间的荧光共振能量转移作用导致了Ce6的单线态氧产率被大幅地淬灭。而在肿瘤细胞环境下，连接PEG和石墨烯的二硫键断裂，加速了Ce6的释放速率，一旦Ce6从石墨烯量子点表面游离出来，Ce6的单线态氧产率就得到了恢复。

实施例9

体外光动力学治疗效果及细胞吞噬评价

以Hela细胞为研究对象，用四甲基偶氮唑(MTT)检测细胞的存活率。

分别将Hela细胞与一系列浓度的GQD-SS-PEG、Ce6、GQD-SS-PEG/Ce6以及GSH-OEt预处理的GQD-SS-PEG/Ce6(每孔细胞中先加入100μL10mMGSH-OEt与细胞作用2h后，再加入GQD-SS-PEG/Ce6溶液)共同培养24小时，其中，GQD-SS-PEG/Ce6为按实施例1所述方法制得。

然后用650nm激光照射3分钟，激光功率密度为20mW/cm²。治疗之后继续培养24小时，然后用MTT试剂检测细胞相对活力，所有细胞存活率以对照组细胞(无药无光照)存活率为100％作归一化处理，结果如图5所示，表明：

(1)在无光照情况下，Ce6及GQD-SS-PEG/Ce6对Hela细胞几乎没有毒性；

(2)无论是否光照，GQD-SS-PEG对细胞都没有毒性，表明GQD-SS-PEG良好的生物相容性；

(3)在Ce6浓度从0.25μmol/L至1μmol/L范围内，GSH-OEt预处理过的GQD-SS-PEG/Ce6对细胞的光毒性高于未用GSH-OEt预处理的GQD-SS-PEG/Ce6。这是由于在GSH-OEt的作用下，GQD-SS-PEG中二硫键断裂，更多的Ce6被释放出来，表现更强的光毒性。有效证明了GQD-SS-PEG/Ce6的GSH敏感细胞内释药行为；

(4)在650nm激光照射下，GQD-SS-PEG/Ce6对细胞的杀伤力高于单纯Ce6，在Ce6浓度从0.25μmol/L至2μmol/L范围内，结果都是如此。

实施例10

激光共聚焦表征细胞内药物释放行为，其中，GQD-SS-PEG/Ce6为按实施例1所述方法制得。

在相同的Ce6浓度(1.5μmol/L)下，Hela细胞分别与Ce6、GQD-SS-PEG/Ce6以及及GSH-OEt预处理的GQD-SS-PEG/Ce6培养6小时，温度为37℃，然后用激光共聚焦(LeicaTCSSP5II,Germany)拍照，结果如图6所示，图中，(a)、(b)和(c)分别表示GQD-SS-PEG/Ce6、Ce6以及GSH-OEt预处理的GQD-SS-PEG/Ce6三种情形，可知，尽管GQD-SS-PEG对负载的Ce6存在荧光淬灭现象，GQD-SS-PEG/Ce6的信号强度明显高于单纯Ce6，这是因为GQD-SS-PEG可以高效地进入细胞，并将与之结合的Ce6带入细胞，这可能是GQD-SS-PEG/Ce6细胞吸收显著增加的原因。相比之下，单纯Ce6缺乏跨膜扩散的能力，因而细胞吸收效果不明显。这也很好的解释了GQD-SS-PEG/Ce6的光动力学治疗效果远好于单纯Ce6的原因。

实施例11

荷瘤裸鼠光动力学治疗效果评价，其中，GQD-SS-PEG/Ce6为按实施例1所述方法制得。

Hela细胞经过传代培养后，将处于对数生长期的肿瘤细胞消化、取5×10⁶个细胞悬浮在100μLPBS中，并尽快用5％的水合氯醛(0.6ml/100g)麻醉裸鼠后，皮下注射接种于裸鼠的右股，当肿瘤生长为3-5mm时，进行动物实验。

荷瘤裸鼠在尾静脉注射GQD-PEG-Ce61h时，GQD-PEG-Ce6就能快速的富集与裸鼠的肿瘤部位，此时肿瘤部位的荧光信号最强，因此选择1h作为最佳的治疗时间。

注射组：GQD-SS-PEG/Ce6的PBS溶液

对照组：PBS

实验分为：对照组和注射组，每组三只。用5％的水合氯醛麻醉，将PBS，GQD-SS-PEG/Ce6的PBS溶液(Ce6当量为2.5mg/kg)尾静脉注射到裸鼠体内，如图7所示，在注射后1h，采用650nm的激光器照射肿瘤组织1h(200mW/cm²)，随后隔天观察肿瘤体积的变化。在第22天时，GQD-SS-PEG/Ce6注射组的肿瘤体积为118±6mm³，而PBS注射组的肿瘤体积为267±13mm³。故与对照组比较，GQD-SS-PEG/Ce6能有效地抑制肿瘤的生长。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，其特征在于，包括载体GQD-SS-PEG和负载于GQD-SS-PEG上的光敏剂，其中光敏剂的负载量为5～9wt％。

2.根据权利要求1所述的一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，其特征在于，所述的GQD-SS-PEG由石墨烯量子点与PEG-SS-NH₂缩合反应制得，其中，所述的石墨烯量子点的粒径为2～5nm。

3.根据权利要求2所述的一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，其特征在于，所述的石墨烯量子点通过以下步骤制备而成：

(1)将浓硫酸和浓硝酸的混酸，以及碳纤维粉置入反应器内，机械搅拌下升温至75～85℃反应10～14h，得到反应液，其中，混酸为98wt％的浓硫酸与67wt％的浓硝酸按体积比1：(0.5～2)混合而成，混酸与碳纤维粉的添加量之比为1000mL：(10～80)g；

(2)将反应液倒入二次水中超声处理1～3h，其中，反应液与二次水的体积比为1：(1～5)，用水稀释后，加NaOH调节pH为1，再用Na₂CO₃调整pH为中性，冷却，除去盐分，得到石墨烯量子点水溶液，去除水分后即得到石墨烯量子点。

4.根据权利要求2所述的一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，其特征在于，所述的PEG-SS-NH₂通过以下步骤制备而成：

(a)在氮气保护下，将EDC·HCl和NHS加入到溶有羧基PEG的二氯甲烷溶液中，其中，EDC·HCl、NHS和羧基PEG的添加量的摩尔比为(0.3～0.8)：(0.1～0.4)：(0.1～0.35)，搅拌反应4～6h；

(b)随后滴加含二硫和二氨基的化合物，其与羧基PEG的添加量的摩尔比为(0.2～3)：(0.1～0.35)，常温继续反应20～28h，分离得到反应产物；

(c)将反应产物置于冷乙醚中提纯，干燥后得到PEG-SS-NH₂。

5.根据权利要求4所述的一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，其特征在于，步骤(a)中所述的羧基PEG为含一个羧基基团修饰的PEG或含两个羧基基团修饰的PEG；

步骤(b)中所述的含二硫和二氨基的化合物的通式为

其中，R₁和R₂均选自二价烷基或芳香基中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型，其特征在于，所述的光敏剂选自二氢卟酚e6、苯并卟啉衍生物或焦脱镁叶绿酸a中的一种。

7.一种如权利要求2～6任一所述的还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)将EDC加到GQD溶液中，超声处理，再加入PEG-SS-NH₂，室温搅拌进行反应，再除去反应产物中的杂质，得到GQD-SS-PEG水溶液；

(B)往GQD-SS-PEG水溶液中添加光敏剂DMSO溶液，混合后超声处理，然后在室温、黑暗条件下搅拌反应；

(C)将步骤(B)的反应产物离心分离后，将所得上清液超滤除去未负载的光敏剂，即得到最终目的产物。

8.根据权利要求7所述的一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，其特征在于，步骤(A)中所述的GQD溶液的浓度为1mg/mL，添加的EDC、GQD和PEG-SS-NH₂的质量比为(7～15)：(8～15)：(80～150)；

所述的超声处理的时间为3～10min，室温搅拌反应的时间为20～28h；

反应产物中的杂质是通过在水中透析除去的。

9.根据权利要求7所述的一种还原敏感激活型光动力纳米药物剂型的制备方法，其特征在于，步骤(B)中：GQD-SS-PEG水溶液的浓度为1mg/mL，光敏剂DMSO溶液的浓度为25μg/mL，GQD-SS-PEG水溶液与光敏剂DMSO溶液的添加量的体积比为(0.5～1.5)：(8～15)；

GQD-SS-PEG水溶液与光敏剂DMSO溶液混合后超声处理的时间为0.2～1h；

黑暗处搅拌反应的时间为10～15h。

10.一种如权利要求1～6任一所述的还原敏感激活型光动力纳米药物剂型用于制备抑制肿瘤生长的药物。