CN115074125A - 一种基于gsh的荧光纳米探针及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于GSH的荧光纳米探针及其合成方法和应用。本发明首先涉及自下而上(Bottom‑Up)策略使用小分子多环芳烃聚合制备表面富含羟基的石墨烯量子点,然后通过嫁接羧酸基团使其表面富含羧基,最后将识别单元修饰到其表面得到特异性石墨烯量子点荧光探针。通过该方法制备的荧光纳米探针结构显示出优良的荧光特性和特异性,并且能作为荧光底物用于药物传递、生物医学成像、超灵敏生物传感器、微生物检测等。
Description
技术领域
本发明属于功能微生物示踪技术领域,具体涉及用于制备基于生物分子的荧光纳米探针结构的方法,更具体地说,本发明涉及一类碳量子点荧光探针及其合成方法和在抗氧胁迫功能微生物示踪中的应用。
背景技术
微生物在正常的好氧呼吸代谢生理生化过程中会产生活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)物质,如过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2 -)、羟自由基等。当细胞暴露在过多的ROS或细胞的抗氧化系统功能较低时,胞内的氧化还原平衡就会被破坏。随着ROS浓度的提升,就会造成氧胁迫(oxidative stress)。过多的ROS会进攻如脂质、蛋白质、DNA等生物大分子,最终引起细胞凋亡。
环境微生物为适应环境表现出抗氧化特性,作为生态系统重要组成部分,对其抗氧化特性的研究为生态系统抗氧化资源的开发提供科学依据和技术基础,也对微生物抗氧化机制的挖掘奠定了基础。许多微生物细胞已经进化出了有效的抗氧化胁迫机制,包括结合小分子抗氧化剂如维生素C(vitamin C)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH),和还原性酶如过氧化氢酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxidase dimutase)。GSH是一个存在于几乎所有微生物细胞中的主要的非蛋白类巯基化合物。微生物细胞中的许多生理功能都直接或间接地与GSH相关,GSH主要与相应的代谢酶系统地组成一个强力的抗氧化防御机制。谷胱甘肽(GSH)/谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)抗氧化系统在一些微生物细胞如酿酒酵母中维持胞内氧化还原平衡和抵抗氧胁迫发挥主要作用。然而,有些微生物如流感嗜血杆菌和乳酸乳球菌,本身不具有合成GSH能力,可通过从胞外吸收GSH,参与抵抗氧胁迫。认识微生物抗氧胁迫系统在微生物细胞抵抗氧化损坏中的生理功能将有助于提高微生物细胞内抵抗机理的理解。基于对这些机理知识的理解将有利于一系列的方法策略的设计改进微生物工业发酵过程或提高功能微生物的代谢效率等。
发明内容
本发明的目的在于:克服现有技术中存在的上述不足,提供一类碳量子点荧光探针及其合成方法和在示踪具有抗氧胁迫功能活性微生物中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供了一种石墨烯量子点结构荧光探针,采用自下而上(Bottom-Up)策略通过小分子多环芳烃聚合制备得到表面富含羟基的石墨烯量子点,进一步采用嫁接方法制备得到富含羧基的石墨烯量子点,以此石墨烯量子点为荧光单元,表面修饰上识别单元得到特异性识别的石墨烯荧光探针。
本发明的第一个目的是提供一种基于GSH的荧光纳米探针的合成方法,其包括以下步骤:
(a)对荧光纳米粒子进行表面修饰,由此形成表面富含羧基的功能纳米粒子;
(b)使GSH通过酰胺化反应修饰到功能纳米粒子上,保留GSH上的巯基不被破坏,得到纳米粒子-GSH荧光探针。
优选的,所述的合成方法,其包括以下步骤:
(Ⅰ)小分子多环芳烃通过硝化反应后,使用碱溶液水热法集合成荧光纳米粒子;
(Ⅱ)将得到的荧光纳米粒子通过嫁接方法将羧基嫁接到其表面,形成表面富含羧基的功能化纳米粒子;
(Ⅲ)GSH通过氨基与功能化纳米粒子的羧基酰胺化反应制得纳米粒子-GSH荧光探针。
优选的,步骤(Ⅰ)中,所述的小分子多环芳烃选自萘、蒽、菲、芘、苝中的至少一种。
优选的,步骤(Ⅰ)中,所述的碱溶液选自氨水、氢氧化钠水溶液、水合联氨中的至少一种。
优选的,步骤(Ⅰ)中,所述的荧光纳米粒子为表面富含羟基的石墨烯量子点。
优选的,步骤(Ⅱ)中,所述的嫁接是在添加NaOH和ClCH2COONa的体系中反应。
优选的,步骤(Ⅲ)中,所述的酰胺化反应是在添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的体系中反应。
优选的,所述的合成方法,其包括以下步骤:
(1)将小分子多环芳烃与浓硝酸混合在常温下进行硝化反应12 h,然后加入超纯水稀释,用微孔滤膜过滤除去酸,得到橙色产物;将橙色产物分散于碱溶液中,超声混合,随后将混合物转移到反应釜进行水热反应10 h,待自然冷却到室温后,用微孔滤膜过滤,将滤液透析,得到表面富含羟基的石墨烯量子点,记为GQDs-OH;
(2)将得到的GQDs-OH分散,往分散液中加入NaOH和ClCH2COONa,所述的GQDs-OH、NaOH和ClCH2COONa的质量比为0.015:1.2:1.0,超声处理3 h,随后使用稀盐酸调节反应液的pH至中性,将反应液透析,得到表面富含羧基的石墨烯量子点,记为GQDs-COOH;
(3)将得到的GQDs-COOH分散,往分散液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,调节pH至5,室温下搅拌反应30 min,然后加入N-羟基琥珀酰亚胺,搅拌均匀后加入GSH,调节pH至9,在黑暗下搅拌反应48 h,所述的GQDs-COOH、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和GSH的质量比为30:76.8:23:30.7,将反应液透析,得到纳米粒子-GSH荧光探针,记为GSH-GQDs。
本发明的第二个目的是提供一种根据上述的合成方法制备得到的基于GSH的荧光纳米探针。
本发明的第三个目的是提供上述的基于GSH的荧光纳米探针在示踪抗氧胁迫功能活性微生物Bosea thiooxidans BI-42中的应用。
本发明设计并合成了一类对抗氧胁迫功能有专一选择性的石墨烯量子点荧光探针GSH-GQDs。探针GSH-GQDs作为外源抗氧化物质参与微生物抗氧胁迫过程,可视化示踪抗氧胁迫功能活性微生物。
本发明以谷胱甘肽为目标识别单元,以抗氧胁迫活性菌株为实验客体,首次将石墨烯量子点荧光探针(探针GSH-GQDs)技术应用于示踪微生物抗氧胁迫可视化中,利用荧光标记示踪细菌抗氧胁迫过程,阐明细菌细胞对抗氧化物质的捕获和转移特点。该研究的开展将建立一套全新的基于荧光标记技术的抗氧胁迫功能活性微生物研究模式,更生动直观地展示微生物抗氧胁迫的过程,揭示化合物结构与微生物细胞捕获抗氧化物质能力的相关性,为微生物细胞内抵抗机理的理解提供理论指导。
附图说明
图1是本发明石墨烯量子点探针的图谱分析。A为石墨烯量子点的红外光谱;B为石墨烯量子点的吸收光谱;C为石墨烯量子点GSH-GQDs的X射线光电子能谱;D为石墨烯量子点的荧光激发和发射光谱;E为石墨烯量子点GQDs-COOH在不同pH下的的荧光激发和发射光谱;F为石墨烯量子点GSH-GQDs在不同pH下的荧光激发和发射光谱。
图2是本发明石墨烯量子点GSH-GQDs的TEM和AFM表征。A为石墨烯量子点的TEM图片,图中标尺为50 nm;B为石墨烯量子点团聚的TEM图,图中标尺为200 nm;C、D为石墨烯量子点自组装行为及发生撕裂折叠行为的TEM图,图中标尺分别为500 nm和200 nm;E、F为石墨烯量子点自组装行为形成的多层石墨烯结构TEM图,图中标尺分别为100 nm和200 nm;G、H为石墨烯量子点AFM图,图中标尺分别为1 μm和440 nm,分别插入高度剖面图,平均石墨烯量子点厚度为0.9 nm。
图3是石墨烯量子点GSH-GQDs的CLSM表征。A为白光通道图;B为荧光通道图; C为合成通道图。
图4 是Bosea thiooxidans BI-42抗氧化生理生化特征测试结果。A为Bosea thiooxidans BI-42完整细胞及破碎细胞的羟自由基清除率柱形图;B为Bosea thiooxidans BI-42生长曲线及GSH相应时段GSH浓度柱形图;C为不同浓度GSH-GQDs下Bosea thiooxidans BI-42的生长曲线;D为不同处理条件下Bosea thiooxidans BI-42的生长曲线。
图5是本发明的石墨烯量子点探针GSH-GQDs与Bosea thiooxidans BI-42共同培养12小时进行激光共聚焦拍摄的照片。A为GSH-GQDs荧光通道图;B为膜染料荧光通道图;C为白光通道图;D为合成通道图。
图6是本发明的石墨烯量子点探针GSH-GQDs与Bosea thiooxidans BI-42共同培养12小时进行每隔两秒对同一个细菌进行连续拍摄的激光共聚焦图片。
图7是本发明的石墨烯量子点探针GSH-GQDs与Bosea thiooxidans BI-42不同培养时间拍摄的共聚焦图片。
图8是本发明的石墨烯量子点探针GSH-GQDs和经过H2O2处理的Lysinibacillussp. GY32的共聚焦图片。
图9是本发明石墨烯量子点GQDs-COOH及GSH-GQDs的合成流程简图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1
石墨烯量子点GQDs-COOH和石墨烯量子点GSH-GQDs的合成流程简图如图9所示,具体合成过程如下:
(1)石墨烯量子点GQDs-COOH的合成:
0.25 g苝加入浓HNO3(20 mL)中在常温下反应12小时。硝化反应后,混合物用250mL的超纯水稀释,0.22 μm微孔滤膜除去酸,得到橙色产物3,4,9,10-四硝基苝。橙色产物分散于30 mL,0.2 M的NaOH中,超声2小时。随后将混合物转移到反应釜中200℃反应10小时。待自然冷却到室温后,用0.22 μm微孔滤膜过滤掉不溶的碳产物。最后将滤液转移到透析袋(截留分子量:3500 Da)透析一周以除去盐和没有聚合的小分子,纯化后得到的GQDs-OH。得到的GQDs-OH调整浓度至~1 mg/mL,超声1小时至充分分散。加入1.2 g NaOH和1.0 gClCH2COONa到15 mL的GQDs-OH溶液中,超声3小时通过醋酸基团的嫁接将GQDs上的-OH基团转变为-COOH基团。随后,使用稀盐酸调节反应液的pH至中性,随后用透析袋(3500 Da)透析约一周除去盐和小分子得到石墨烯量子点(graphene quantum dots, GQDs-COOH)。
(2)石墨烯量子点GSH-GQDs合成:
30 mL GQDs-COOH分散溶液(1 mg/mL),加入76.8 mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.4 mmol),随后缓慢加入用0.01 M的HCl调节溶液pH到5,室温下搅拌30分钟。加入23.0 mg的N-羟基琥珀酰亚胺(0.02 mmol),搅拌均匀后加入0.1 mmol的GSH,然后用0.01 M的NaOH调节反应液pH到9。反应液在黑暗环境中搅拌48小时。最后,反应液转移到透析袋中,透析3天,除去未反应的小分子及催化剂等,得到GSH-GQDs。
实施例2
石墨烯量子点探针的图谱:
石墨烯量子点GQDs-COOH和石墨烯量子点GSH-GQDs分散于水溶液中,测试其红外光谱、X射线光电子能谱、紫外-可见光吸收光谱以及荧光光谱。红外光谱测试使用傅里叶变换红外光谱仪(Bruker/Tensor II),测试范围4000-400 cm-1。X射线光电子能谱测试使用多功能光电子能谱仪(XPS, Axis Ultra DLD,Kratos)。XPS的数据处理使用XPSpeak 41软件。紫外-可见光吸收光谱测试使用紫外可见分光广度计(SHIMADZU/UV-2600),测试范围200-800 nm。荧光光谱测试使用荧光分光光度计(Perkin Elmer/FS-45),激发波长范围250-500nm,发射波长范围450-700 nm。
图1是本发明石墨烯量子点探针的谱图分析。图1的A为石墨烯量子点的红外光谱。在红外光谱中GSH-GQDs比GQDs-COOH多出了与酰胺键相关的特征峰,分别是ν-C=O(酰胺键Ⅰ)在~1,634 cm-1,δN-H(酰胺键Ⅱ)在~1,570 cm-1,ν-C-N(酰胺键Ⅲ)在~1,382 cm-1,和-N=N-在~1442 cm-1的特征峰,以及亚甲基和甲基在~2890 cm-1和~2985 cm-1的伸缩振动特征峰。此外,可以看出GSH-GQDs保留有完整的硫醇基团,在~2600 cm-1附近的弱峰是S-H的伸缩振动吸收峰,在~1460 cm-1处的峰是S-CH2的变形振动吸收峰。图1的B为石墨烯量子点的吸收光谱。相比于GQDs-COOH,GSH-GQDs在~265 nm,~450 nm,~475 nm处有新的吸收峰。图1的C为石墨烯量子点GSH-GQDs的X射线光电子能谱。GSH-GQDs含有C,N,O,S元素,分析得到他们的含量分别为C~79.77%,O~17.41%,N~1.89%,S~0.93%。图1的D为石墨烯量子点的荧光激发和发射光谱。GSH-GQDs和GQDs-COOH的最大激发波长和最大发射波长均分别为~465 nm和~495 nm。两者的激发光谱和发射光谱均有一个肩峰,并且其激发光谱和发射光谱均为相互镜像对称。图1的E、F为石墨烯量子点在不同pH条件下的荧光激发和发射光谱。GQDs-COOH在弱酸性及碱性条件下(pH=6,9,11,13)其荧光光谱没有发生明显变化,在强酸性条件下(pH=2,3,4)其激发光谱发生了蓝移,最大激发波长约为~410 nm,并且其荧光强度也相应下降了3倍。同样的,GSH-GQDs也在强酸性条件下荧光特性发生了相同的变化。
实施例3
石墨烯量子点的形貌结构:
石墨烯量子点合成后均先将石墨烯量子点悬浮液经0.22 μm微孔滤膜过滤,再于截留分子量3500 Da的透析膜透析约一周时间。使用透射电子显微镜(TransmissionElectron Microscope,TEM, HITACHI H7650)、原子力显微镜(AFM, BioScope Resolve,Bruker)和共聚焦激光显微镜(CLSM,LSM 700 Zeiss)进行表征。
图2是本发明石墨烯量子点GSH-GQDs的TEM和AFM表征。图2的A-F为石墨烯量子点GSH-GQDs的TEM图。从图2的A可以看出GSH-GQDs的平均粒径为2.0±0.5 nm。图2的B显示石墨烯量子点在水中并不是均匀分散的,倾向于聚集在一起形成约50-100 nm的纳米片。图2的C、D显示石墨烯量子点自组装行为形成薄膜,并发生撕裂折叠。图2的E、F显示石墨烯量子点通过自组装行为后形成稳定的多层石墨烯结构纳米薄片。图2的G、H为石墨烯量子点的AFM图。图2的G、H显示纳米薄片的厚度约为0.8-0.9 nm,即相当于3-4层石墨烯层,经超声处理可简单分散成组装前的小颗粒状态。
图3为石墨烯量子点GSH-GQDs的CLSM表征。图3的A为白光通道图,图3的B为荧光通道图,图3的C为合成通道图。
实施例4
细菌的抗氧化生理生化特征:
Bosea thiooxidans BI-42,该菌株是现有技术中的菌株,是从环境中分离并保存在广东省微生物保藏中心保藏菌种,该菌株也可购买,商品货号为DSM 9653(宁波明舟生物科技有限公司)。将菌种接种至40 mL Luria-Bertani培养基(LB培养基)(配方:胰蛋白胨(Tryptone) 10 g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5 g/L,氯化钠(NaCl) 10 g/L,溶剂为水,pH=7.4;配制:将各成分溶于水,调节pH,灭菌即得)的锥形瓶,摇床隔夜培养确保生长完全。
Bosea thiooxidans BI-42生长过程中GSH含量测定。GSH标准曲线的测定,使用KPE缓冲液配置浓度为26.4,13.2,6.6,3.3,1.65,0.825,0.4125,0.20625,0.103125 nmol/mL的GSH标准液。在比色皿中加入200 μL GSH标准液、200 μL邻苯二甲醛(1 mg/mL)和3600μL 磷酸钾-EDTA缓冲液(KPE buffer,A液:将0.68 g KH2PO4溶于50 mL超纯水中;B液:将0.85 g K2HPO4溶于50 mL超纯水中。使用前将8 mL A液和42 mL B液混合均匀,调节pH=8,最后加入0.16 g EDTA)黑暗条件下、室温下孵育10分钟,使用荧光光谱仪测荧光信号,激发波长为355 nm,发射波长为420 nm。菌液样品则将过夜培养的菌液转接到新鲜的培养基中,每隔2小时取样使用超声细胞破碎仪破碎细胞,离心收集上清液,使用上清液测细菌生长过程中的GSH含量。
Bosea thiooxidans BI-42羟自由基清除能力测定。依次将1 mL FeSO4(9 mmol/L),1 mL水杨酸(9 mmol/L)及1 mL菌液(完整细胞,破碎细胞)加入到5 mL离心管中,混合均匀后加入1 mL H2O2(8.8 mmol/L)引发反应。反应在37℃下进行30分钟后利用分光光度计测定510 nm处的吸光度值。空白样品用去离子水代替试样。OH•清除率利用下式计算:
羟基自由基清除率=[ A0-( Ax-Ax0)]/ A0×100%
式中:Ax—试样吸光度;A0—空白对照吸光度;Ax0—水代替H2O2的本底吸光度。
图4为Bosea thiooxidans BI-42抗氧化生理生化特征测试结果。如图4的A所示,完整的细胞对羟自由基的清除率约为17.2%,而破碎细胞后提取液对羟自由的清除率则能达到82.7%。说明BI-42本身具有一定的抗氧化活性,且其抗氧化活性物质,如酶、蛋白或其他如GSH等主要存在细胞内,其抗氧化活性中心在胞内,即其自身能有效的保护其胞内组织免受活性氧物质的破坏。对BI-42在生长过程中GSH含量变化监测,在其不同生长时段下采样,超声破碎细胞取上清液使用荧光光度法测GSH浓度。如图4的B所示,BI-42能自身生产GSH作为抗氧化活性物质,GSH浓度在BI-42生长过程中呈现出先增加后减少了趋势。BI-42在生长早期(2-4小时)随着培养时间增加总体的GSH的浓度也增加,GSH在4小时时浓度达到最大。随后,再继续培养时总体的GSH浓度反而下降,直到BI-42生长后期(8-12小时)GSH的浓度下降到极低。说明在BI-42生长早期时,其自身生产的GSH足够维持自身的正常生命活动,并有效保持菌体内氧化还原平衡。而到了生长后期,由于其正常生命活动过程中积累的活性氧物质越来越多,其需要消耗的GSH也就越多,使得总体的GSH浓度下降。如图4的C所示,不同浓度的GSH-GQDs与Bosea thiooxidans BI-42共同培养,测量不同培养时间时菌液的OD600值,判断Bosea thiooxidans BI-42的生长情况,评估GSH-GQDs的生物毒性。与对照组相比(GSH-GQDs浓度为0),GSH-GQDs的浓度从1 mg/mL增加到9 mg/mL对于Bosea thiooxidans BI-42的生长都没有影响,说明GSH-GQDs对于Bosea thiooxidans BI-42是安全无毒的。如图4的D所示,相对于对照组,当BI-42培养基中加入H2O2造成细胞外部的氧胁迫环境,在此环境中,BI-42的生长会受到抑制,需要一段时间将环境中H2O2中消耗后其生长速率才能提升。而将GSH或GSH-GQDs加入在氧胁迫的环境中时,就可协助BI-42抗氧胁迫,使得其生长情况恢复到对照组相似水平。
实施例5
抗氧胁迫功能活性微生物可视化示踪:
菌株Bosea thiooxidans BI-42,该菌株是现有技术中的菌株,是从环境中分离并保存在广东省微生物保藏中心保藏菌种,该菌株也可购买,商品货号为DSM 9653(宁波明舟生物科技有限公司)。
Lysinibacillus sp. GY32是从环境中分离并于2011年9月7日保存于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC),地址:中国武汉市武汉大学,保藏编号为 CCTCC NO:M 2011307。与实施例4的细菌培养条件相同,菌株在LB培养基中好氧培养至对数期,收获菌体,转接于新鲜的LB培养基中,随后加入GSH-GQDs(10 μg/mL)。培养一段时间后,收获菌体,离心洗涤3次,重悬于PBS中。所有菌液浓度都稀释到OD600~0.1,在激光共聚焦显微镜下监测不同时间段,不同生长状态(H2O2处理前后)下菌体生长及荧光标志情况。激光共聚焦观测实验时菌株使用FM®4-64FX亲脂性细胞膜染料(采购自Thermo Fisher)进行复染。激发波长选择为488nm。
图5~7为Bosea thiooxidans BI-42与GSH-GQDs共同培养后的激光共聚焦照片。如图5所示,绿色荧光通道表示的是GSH-GQDs探针标记,红色荧光通道表示的是膜染料标记,GSH-GQDs能标记BI-42整体,且探针是进入了BI-42的细胞内并不是附着在膜上的。可以看出绿色荧光在菌体内不是均匀分布的,而是在胞内形成数百纳米的荧光团。GSH-GQDs作为外源性的抗氧胁迫物质,且由于其具有自组装的行为,稳定存在时尺寸大小约为数百纳米的纳米薄片,因此可以推测BI-42胞内的荧光团是通过细菌的胞吞作用将GSH-GQDs纳米探针摄入胞内的。如图6所示,每隔两秒对同一个细菌进行拍摄可以看出,BI-42胞内的荧光团的位置会发生蠕动变化。并且此实验中膜染料复染时间较长,膜染料也有进入胞内,其聚集的位置也是在GSH-GQDs荧光团的位置,且也会随着其发生蠕动变化,说明GSH-GQDs是由囊泡包裹输送进入BI-42胞内的。如图7所示,我们在BI-42不同生长时间下取样进行拍摄。可以看到随着其生长时间的增加,BI-42菌群从仅有零星菌体有荧光到后来全部菌群都具有荧光,在12小时后其荧光强度达到最大。这种荧光强度变化趋势与BI-42的生长曲线相吻合,从BI-42的生长曲线看出,其生长到11小时后已经进入平台期,其生长已经到了细胞凋亡期,在此期间,细胞体内由于其正常的生理活动中积累的活性氧已经超出其本身抗氧胁迫防御体系的限度,因此需要外源性的抗氧化物质帮助其减少体内的活性氧含量,以保持本身的正常生命活动。而在BI-42生长早期,几乎所有细菌其体内积累的活性氧物质都不多,其本身抗氧胁迫防御体系可正常运作,不需要太多外源性物质,因此在其培养30分钟到1小时时几乎没有菌体存在荧光信号。在BI-42生长到4到8小时时正式处于其指数生长期,此期间细菌生命活动非常活跃,即使此时其本身抗氧胁迫防御体系完善,仍需要外源性抗氧胁迫物质协助减少因此期间剧烈活动产生的过多活性氧,所以在此期间菌群中能显示出荧光信号的菌体变多,荧光强度也会逐渐增大。如图8所示,经过低浓度H2O2处理后可以看出有部分菌体已经失去生命活性,并且细胞已经破裂,胞内物质也流失了,而生命活动正常的菌则会呈现完整饱满的细菌体态。从荧光信号可以看出,红色荧光的膜染料能将健康细菌和凋亡的细菌都染上色,而GSH-GQDs的绿色荧光则仅在健康细胞才能看到。因为已经凋亡的细菌不能进行正常的氧化还原活动,而正常的GY32作为电活性菌,其正常的氧化还原活动活跃位点在胞外,所以可以看到GSH-GQDs有效的标记了正常的GY32外膜。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出的是,上述优选实施方式不应视为对本发明的限制,本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明的精神和范围内,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于GSH的荧光纳米探针的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将小分子多环芳烃与浓硝酸混合在常温下进行硝化反应12 h,然后加入超纯水稀释,用微孔滤膜过滤除去酸,得到橙色产物;将橙色产物分散于碱溶液中,超声混合,随后将混合物转移到反应釜进行水热反应10 h,待自然冷却到室温后,用微孔滤膜过滤,将滤液透析,得到表面富含羟基的石墨烯量子点,记为GQDs-OH;
(2)将得到的GQDs-OH分散,往分散液中加入NaOH和ClCH2COONa,所述的GQDs-OH、NaOH和ClCH2COONa的质量比为0.015:1.2:1.0,超声处理3 h,随后使用稀盐酸调节反应液的pH至中性,将反应液透析,得到表面富含羧基的石墨烯量子点,记为GQDs-COOH;
(3)将得到的GQDs-COOH分散,往分散液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,调节pH至5,室温下搅拌反应30 min,然后加入N-羟基琥珀酰亚胺,搅拌均匀后加入GSH,调节pH至9,在黑暗下搅拌反应48 h,所述的GQDs-COOH、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺和GSH的质量比为30:76.8:23:30.7,将反应液透析,得到纳米粒子-GSH荧光探针,记为GSH-GQDs,所述纳米粒子-GSH荧光探针保留GSH的巯基不被破坏;
步骤(1)中,所述的小分子多环芳烃选自萘、蒽、菲、芘、苝中的至少一种;
步骤(1)中,所述的碱溶液选自氨水、氢氧化钠水溶液、水合联氨中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的合成方法制备得到的基于GSH的荧光纳米探针。
3.权利要求2所述的基于GSH的荧光纳米探针在示踪抗氧胁迫功能活性微生物Bosea thiooxidans BI-42中的应用。
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