CN107513537B - 一种铁磁性纳米载体材料/基因复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种铁磁性纳米载体材料/基因复合物，包括铁磁性纳米载体材料以及通过静电吸引作用依次吸附在铁磁性纳米载体材料上的目的基因和第二阳离子聚合物；所述铁磁性纳米载体材料包括：内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用修饰第一阳离子聚合物；所述中间层包括两层油酸以及连接两层油酸疏水端的聚已内酯。本发明还涉及该铁磁性纳米载体材料/基因复合物的制备方法和应用。该铁磁性纳米载体材料/基因复合物可依托自身良好的铁磁性实现不依赖于外加磁场的高效基因转染。

Description

一种铁磁性纳米载体材料/基因复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及载体/基因复合物制备领域，具体涉及一种铁磁性纳米载体材料/基因复合物及其制备方法和应用。

背景技术

干细胞治疗是近年来出现的一种新型疾病治疗手段。由于干细胞具有分化为多种特定细胞的潜能，同时能够分泌多种细胞因子参与受损组织的修复。因此，已经被广泛应用于组织再生、糖尿病、心肌梗死以及肝脏损伤等疾病的治疗研究。临床上，干细胞治疗也已被用于骨和软骨损伤等的再生治疗。

然而，现阶段的干细胞治疗依然面临着诸多挑战，其中一个重要的瓶颈问题便是如何对干细胞进行高效、安全的基因重组来进一步促进其治疗疗效的发挥。

近年来，随着纳米技术的不断发展，基于磁性纳米粒的磁转染技术被认为有望成为解决干细胞高效基因重组难题的答案之一。一般而言，磁转染是指利用磁性纳米粒对外加磁场的响应性来加速磁性纳米载体及携带的基因向贴附在培养皿底部的细胞沉降，提高磁性纳米载体/基因复合物在细胞膜表面的聚集，进而提高基因转染的速度和效率，从而使细胞高效表达目的基因所编码的蛋白。从磁转染的原理分析可以发现，磁性纳米粒的磁响应性对于最终的转染效率具有重要的影响。因此，设计和合成磁响应性好的磁性纳米载体便成为相应磁转染试剂的研究和开发的重要内容之一。

氧化铁纳米粒是目前被研究和应用最多的磁性纳米粒，这主要是因为氧化铁纳米粒的制备工艺相对简单，对外加磁场的响应性好，同时对细胞几乎无毒性。对于基于氧化铁纳米粒的磁转染试剂而言，其磁性主要取决于纳米粒的形貌、尺寸的均一性以及单个纳米粒的结晶性等。当前，多数用于磁转染的氧化铁纳米粒为超顺磁性的球形纳米粒，多采用共沉淀法或者水热法等方法制备。上述方法可在水相体系中直接获得氧化铁纳米粒，极大方便了后续在细胞上的基因转染。但是，采用上述方法制备的纳米粒往往在结晶性以及单分散性上存在着一些缺陷，且在聚合物修饰后容易形成团聚体，进而影响了相应的转染效率。采用新一代热分解法在非极性溶剂中可以获得结晶性和单分散性都更佳，且尺寸均一可控的氧化铁纳米粒。同时，还可以通过对反应条件的控制使纳米晶体的成核和生长过程可控化，进而精确控制纳米粒的形貌(如球形或者立方体)和尺寸，从而获得磁响应性更好的氧化铁纳米粒。但是，采用这一方法制备的氧化铁纳米粒往往只能较好地分散于非极性溶剂中，这就给他们进一步在生物体系中的应用带来了困难。

此外，当前多数已报道的磁转染试剂多以超顺磁性的球形氧化铁纳米粒为磁性内核，转染时需要借助外加磁场来实现相应的高效磁转染。因此，在转染条件上相比传统的基于阳离子脂质体或者阳离子聚合物的基因载体更为复杂，也给将来在临床上的应用带来了一定的不便。立方体形貌的氧化铁纳米粒被认为在同一纳米尺寸下相比球形纳米粒具有更高的饱和磁化强度和较低的矫顽磁力，因而具有更好的磁响应性(铁磁性)，甚至有可能依赖自身良好的铁磁性来实现不依赖外加磁场的磁转染。但是，目前国内外尚未有关基于氧化铁纳米立方体作为基因转染载体的报道。

综上所述，研发一种具有良好的磁响应性，能在水相体系中稳定分散，且能较为快速和便捷地进行基因转染的磁性纳米载体材料有望为解决当前干细胞治疗面临的基因重组难题提供一种切实可行的解决方案，具有十分重要的科学研究价值和临床治疗意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种铁磁性纳米载体材料/基因复合物及其制备方法和应用，该铁磁性纳米载体材料/基因复合物可依托自身良好的铁磁性实现不依赖于外加磁场的高效基因转染。

本发明解决上述技术问题所提供的技术方案为：

一种铁磁性纳米载体材料/基因复合物，包括铁磁性纳米载体材料以及通过静电吸引作用依次吸附在铁磁性纳米载体材料上的目的基因和第二阳离子聚合物；

所述铁磁性纳米载体材料包括：内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用修饰第一阳离子聚合物；所述中间层包括两层油酸以及连接两层油酸疏水端的聚已内酯。

上述技术方案中，以四氧化三铁纳米立方体(FION)为内核，采用双层油酸(OA)和聚已内酯(PCL)修饰，PCL连接两层OA的疏水端，使外层OA的亲水端暴露于铁磁性纳米立方体的外表面，从而实现FION从油相至水相的相转化，并稳定分散在水相体系中。

再通过静电吸引作用修饰第一阳离子聚合物，由于铁磁性纳米立方体的外表面为带负电荷的OA，可与第一阳离子聚合物通过静电吸引作用相互结合，最终通过自组装反应获得表面带正电荷的铁磁性纳米载体材料。正电荷的存在有利于提高本发明铁磁性纳米载体材料被细胞的摄取效率。同时，正电荷间的相互排斥作用也有利于提高铁磁性纳米载体材料在水相体系中的分散性和稳定性，减少因FION的铁磁性而导致的纳米颗粒间的相互吸引和聚集。

表面带正电荷的铁磁性纳米载体材料与带负电荷的目的基因在室温下共孵育，使目的基因充分吸附在铁磁性纳米载体材料的表面。然后，继续用第二阳离子聚合物进行修饰，保护和压缩吸附的目的基因，最终得到铁磁性纳米载体材料/基因复合物。该材料在进行磁转染的过程中可借助自身良好的铁磁性而实现不依赖外加磁场的高效基因转染。

优选的，所述目的基因为质粒DNA、功能性信使RNA或小干扰RNA。进一步优选为编码虫荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因或半乳糖苷酶基因。

所述第一阳离子聚合物和第二阳离子聚合物可以相同，也可以不同。相互独立地选自各种用于携载目的基因的阳离子聚合物。

优选的，所述第一阳离子聚合物为支状聚乙烯亚胺、线状聚乙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、丙二胺、壳聚糖或β-氨基酯。

优选的，所述第二阳离子聚合物为支状聚乙烯亚胺、线状聚乙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、丙二胺、壳聚糖或β-氨基酯。

进一步优选，所述第一阳离子聚合物和第二阳离子聚合物为分子量为25k的支状聚乙烯亚胺。

本发明还提供一种如上述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物的制备方法，包括如下步骤：

1)通过热分解法，利用油酸还原乙酰丙酮铁，得到四氧化三铁纳米立方体；

2)将四氧化三铁纳米立方体分散于混合溶剂中，分别加入聚已内酯和油酸，反应得到能在水相体系中稳定分散的铁磁性纳米立方体；

3)将溶解有过量第一阳离子聚合物的混合溶剂加入到步骤2)中的铁磁性纳米立方体的反应体系中，经相转化反应后得到表面带正电荷的铁磁性纳米载体材料；

4)将步骤3)中的铁磁性纳米载体材料与目的基因在室温下共孵育，使铁磁性纳米载体材料与目的基因通过静电吸引作用相结合；

5)继续加入第二阳离子聚合物溶液，并在室温下共孵育，得到层层包覆结构的铁磁性纳米载体材料/基因复合物。

所述步骤1)中热分解法可以采用现有的方法，所合成的FION内核使得载体材料具有良好的铁磁性，同时也使该载体材料具有良好的磁共振(MR)成像能力。

优选的，所述步骤1)中热分解法具体为：将乙酰丙酮铁、联苯-4-羧酸、油酸和溶剂二苄醚混合后，抽真空，快速升温至280～320℃使纳米粒快速成核，然后在280～320℃下结晶生长，得到四氧化三铁纳米立方体。反应所得的产物用乙醇洗净后重悬于氯仿中保存。进一步优选，所述乙酰丙酮铁、联苯-4-羧酸、油酸和溶剂二苄醚的质量比为0.5～1:0.2～0.6:1～1.5:10.4。所述升温速率为20℃/分钟；所述结晶生长温度为290℃。不同的结晶生长时间可以获得不同尺寸的纳米立方体，优选的，所述结晶生长时间为30分钟。

优选的，所述步骤1)中得到的四氧化三铁纳米立方体的粒径为22～35nm。进一步优选为22～25nm。上述粒径范围可在保证纳米颗粒较好铁磁性特征的前提下，又不因纳米颗粒磁性过强而相互吸引和聚集。同时，较小的粒径也有利于纳米颗粒被干细胞的高效摄取。

优选的，所述步骤2)中的混合溶剂选自氯仿、二氯甲烷、环己烷、正己烷和二氧六环中的一种与四氢呋喃的混合溶剂。进一步优选为氯仿与四氢呋喃的混合溶剂，体积比为1:1。

优选的，所述步骤3)中的混合溶剂选自氯仿、二氯甲烷、环己烷、正己烷和二氧六环中的一种与四氢呋喃的混合溶剂。进一步优选为氯仿与四氢呋喃的混合溶剂，体积比为1:1。

优选的，所述步骤2)中四氧化三铁纳米立方体、聚已内酯和油酸的质量比为8～12:2～5:1。通过对质量比的控制，可以调节FION表面聚合物层的修饰厚度，从而调节铁磁性纳米立方体在水相体系中的稳定性和与阳离子聚合物的结合率。对于不同尺寸的FION内核，其最优质量比会有所差异。以尺寸在22～25nm的FION为例，优选的，质量比为10:2:1，该质量比下可以获得稳定性和单分散性最好的铁磁性纳米立方体。

优选的，所述步骤3)中相转化反应是指：向反应体系中加入双蒸水并超声得到稳定的褐色乳剂，减压蒸发除去混合溶剂中的有机相，并用双蒸水反复清洗分离产物，得到铁磁性纳米载体材料。该材料可以保存于4℃的环境中。进一步优选，所述混合溶液与双蒸水的体积比为3:7至4:5之间，更优选为4:5，有机相与水相的比例对于乳剂的形成和稳定性具有重要影响；所述超声功率为500W，超声时间为5min；所述减压蒸发压力在0.06～0.07Pa，蒸发时间在4h以上。

优选的，所述步骤4)中铁磁性纳米载体材料与目的基因的质量比为0.1～0.6。优选的，质量比为0.3。合理的质量比可以使铁磁性纳米载体材料充分结合目的基因，同时又避免因铁磁性纳米载体材料浓度过高而引起的纳米粒聚集，减少相应的细胞毒性。

优选的，所述步骤4)中共孵育时间为10～30min，所述步骤5)中共孵育时间为10～30min。进一步优选，共孵育时间为15min。合理的共孵育时间确保了铁磁性纳米载体材料/基因复合物的形成和维持较好的稳定性。

优选的，所述步骤4)中共孵育是指：将灭菌处理后的铁磁性纳米载体材料和目的基因分别用蔗糖水或磷酸缓冲液配制成溶液，混合后室温下共孵育。进一步优选，所述蔗糖水为5wt％蔗糖水。

优选的，所述步骤5)中第二阳离子聚合物为支状聚乙烯亚胺，其与待转染的目的基因的氮磷比为5～20。进一步优选，所述氮磷比为10。外层游离阳离子聚合物的引入可进一步压缩和保护铁磁性纳米载体材料所携载的目的基因，并协助目的基因入胞后从溶酶体中逃逸。此外，外层游离阳离子聚合物的修饰使得铁磁性纳米载体材料携载目的基因后，其表面电位依然保持较高的正电性，有利于提高铁磁性纳米载体材料/基因复合物的入胞效率，从而获得较高的基因转染效率。

本发明还提供一种如上述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物在干细胞基因转染中的应用。该铁磁性纳米载体材料/基因复合物可不借助于外加磁场即获得高效的磁转染效率。

所述干细胞为间充质干细胞、表皮干细胞以及神经干细胞中的一种或多种，对干细胞来源无过多限制，可以为人源干细胞、鼠源干细胞以及猪源干细胞等。但在不同干细胞上的转染效率以及最优的基因表达时间会有所差异，如人源间质干细胞优选的表达时间为24h，鼠源神经干细胞优选的表达时间为48h，同时在间质干细胞上的转染效率会略优于神经干细胞上的转染效率。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明中的中间产物铁磁性纳米载体材料制备方法简便，尺寸可控，形貌均一，在水相体系中可长期稳定分散。克服了现有磁转染试剂单分散性差、容易沉聚以及不易长期储存等缺点，且成本低廉，可大量生产，适用性广，推广性强。

(2)本发明中所制备的铁磁性纳米载体材料/基因复合物在进行磁转染的过程中可借助自身的铁磁性实现不依赖外加磁场的高效基因转染。相比现有的超顺磁性的磁转染试剂，具有操作简便，方便快捷，且重现性高，无需依赖加磁场等优势，可广泛应用于科学研究及临床治疗。

附图说明

图1a为实施例1制备四氧化三铁纳米立方体的合成示意图，图1b为所合成的四氧化三铁纳米立方体的TEM图、高分辨TEM图和衍射环图；图1c为所合成的四氧化三铁纳米立方体的SEM图；

图2a为铁磁性纳米载体材料的结构示意图；图2b为实施例3中合成的铁磁性纳米载体材料的TEM图，图2c为实施例3中合成的铁磁性纳米载体材料的SEM图；

图3为实施例中合成的FION、FION@OA/PCL和FION@OA/PCL-PEI的红外光谱图；

图4为实施例3中合成的铁磁性纳米载体材料对外加磁场的响应图及磁滞曲线；

图5a为实施例6中合成的铁磁性纳米载体材料/基因复合物的结构示意图，图5b为复合物的TEM图，图5c为复合物的SEM图；

图6为铁磁性纳米载体材料/基因复合物在制备和携载质粒DNA过程中粒径和电位的变化图；

图7为铁磁性纳米载体材料/基因复合物在不同PEI氮磷比下的的凝胶电泳图；

图8为不同转染载体携载编码虫荧光素酶基因后在人脐带血间质干细胞上的转染效率，^**P<0.01，相比PEI/pDNA组；

图9为不同转染载体携载编码绿色荧光蛋白基因后在人脐带血间质干细胞上的转染效率；

图10为铁磁性纳米载体材料/基因复合物在不同强度的外加磁场下在人脐带血间质干细胞上的的转染效率；

图11为不同载体/基因复合物对人脐带血间质干细胞的毒性考察。

具体实施方式

下面结合具体的实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。

实施例1：四氧化三铁纳米立方体(FION)的合成

准确称取0.706g乙酰丙酮铁，0.4g联苯-4-羧酸和1.27g油酸，然后加入高沸点溶剂二苄醚10.4g，搅拌下混合均匀。混合溶液在室温下抽真空1h，然后采用控温仪以20℃/min的速率升温至290℃左右，随后在该温度下继续保持加热0.5h，然后迅速冷却至室温，产物用乙醇洗净后重悬于氯仿中保存，所得的纳米立方体尺寸在22-25nm。

实施例2：四氧化三铁纳米立方体(FION)的合成

准确称取0.706g乙酰丙酮铁，0.4g联苯-4-羧酸和1.27g油酸，然后加入高沸点溶剂二苄醚10.4g，搅拌下混合均匀。混合溶液在室温下抽真空1h，然后采用控温仪以20℃/min的速率升温至300℃左右，随后在该温度下继续保持加热1h，然后迅速冷却至室温，产物用乙醇洗净后重悬于氯仿中保存，所得的纳米立方体尺寸在30-35nm。

实施例3：铁磁性纳米载体材料的合成

1)将实施例1中合成的四氧化三铁纳米立方体(FION)、聚已内酯(PCL)和油酸(OA)按质量比10:2:1，先后加入4mL氯仿和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)，机械搅拌下以400rpm速率搅拌2h。

2)称取过量PEI，待在4mL氯仿和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)充分溶解后，搅拌下逐滴加入至上述1)中的混合溶液中，以400 rpm速率继续搅拌2h。

3)向上述2)中的混合溶液加入10mL双蒸水，500W功率下探头超声5min，得到均匀的褐色乳剂，旋转蒸发仪下减压蒸发除去有机溶剂，获得稳定分散于水相体系中的铁磁性纳米材料。将所获溶液离心后继续双蒸水反复清洗至少3遍，除去残留的有机溶剂和过量的游离PEI。最终得到表面为正电荷的尺寸均一的铁磁性纳米载体材料。

实施例4：铁磁性纳米载体材料的合成

将实施例1中合成的四氧化三铁纳米立方体(FION)、聚已内酯(PCL)和油酸(OA)按质量比10:5:1，先后加入4mL氯仿和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)，机械搅拌下以400rpm速率搅拌2h，随后操作步骤同实施例3，最终得到表面为正电荷的尺寸均一的铁磁性纳米载体材料。

实施例5：铁磁性纳米载体材料的合成

1)将实施例1中合成的四氧化三铁纳米立方体(FION)、聚已内酯(PCL)和油酸(OA)按质量比10:2:1，先后加入4mL二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)，机械搅拌下以400rpm速率搅拌2h。

2)称取过量PEI，待在4mL二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)充分溶解后，搅拌下逐滴加入至上述1)中的混合溶液中，以400rpm速率继续搅拌2h。

3)向上述2)中的混合溶液加入10mL双蒸水，500W功率下探头超声5min，得到均匀的褐色乳剂，旋转蒸发仪下减压蒸发除去有机溶剂，获得稳定分散于水相体系中的铁磁性纳米材料。将所获溶液离心后继续双蒸水反复清洗至少3遍，除去残留的有机溶剂和过量的游离PEI。最终得到表面为正电荷的尺寸均一的铁磁性纳米载体材料。

表征实验

(1)四氧化三铁纳米立方体(FION)的电镜图

取实施例1合成的四氧化三铁纳米立方体，适量稀释后，滴加于涂有超薄碳膜的铜网上，分别在透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)下观察FION的形貌。

图1a为四氧化三铁纳米立方体的合成示意图，图1b为其TEM图、高分辨TEM图和衍射环图，图1c为其SEM图。由图可知合成的纳米粒为单分散的立方体，具有较好结晶性。

(2)铁磁性纳米载体材料的电镜图

取实施例3合成的分散于水相体系中的铁磁性纳米载体材料，适量稀释后，滴加于涂有超薄碳膜的铜网上，分别在透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)下观察FION表面聚合物的修饰情况。

图2a为铁磁性纳米载体材料的结构示意图，可知该载体材料由三层结构组成，内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用结合阳离子聚合物。

结果如图2b所示，TEM结果显示FION表面修饰有明显的聚合物层，厚度约为3.16nm；如图2c所示，SEM结果进一步证明聚合物已被修饰至FION表面。由此证明，OA/PCL-PEI被成功修饰至了FION表面。

(3)红外光谱(IR)分析

将实施例1合成的FION固体、实施例3步骤1)合成的未修饰PEI的磁性纳米立方体(FION@OA/PCL)以及实施例3合成的铁磁性纳米载体材料(FION@OA/PCL-PEI)分别与溴化钾以质量比1:10于玛瑙研钵中研细混匀，进行红外光谱分析，获得三者的透光率，结果如图3所示。

在FION@OA/PCL中可以观察到PCL的特征峰：ν(C＝O)＝1736cm^-1，表明PCL被成功合成至了FION表面。但是进一步修饰PEI后，其PCL特征峰明显变弱，原因可能是PEI的修饰包覆住了PCL。同时，在FION@OA/PCL-PEI的红外图谱上出现了PEI上的氨基特征峰：δ(NH⁺)＝1656cm^-1，由此表明PEI被修饰至了OA/PCL的外层。

(4)磁场响应性及铁磁性考察

将实施例3合成的分散于水相体系中的磁性纳米载体材料放置于钴镍磁铁旁，考察该磁性纳米载体材料对外加磁场的响应性。同时，测定该磁性纳米载体材料的磁滞曲线。结果如图4所示，该磁性纳米载体材料对外加磁场表现出了非常快速的的响应性，磁滞曲线进一步表明该磁性纳米载体材料呈现出明显的铁磁性特征。

实施例6：铁磁性纳米载体材料/基因复合物(FGC)的制备

(1)载体/基因复合物的制备

利用实施例3中获得的铁磁性纳米载体材料制备载体/基因复合物，具体步骤如下：

1)将环氧己烷气体灭菌后的铁磁性纳米载体材料用5％蔗糖水配制成铁离子浓度为30μg/mL的溶液；

2)将待转染的编码有虫荧光素酶的质粒DNA(pGL-3)用5％蔗糖水稀释成浓度为0.1mg/mL的溶液；

3)将步骤1)中的载体溶液加入至步骤2)中等体积的DNA溶液，混合后室温下孵育15min，使载体充分结合目的基因；

4)称取适量PEI并配置成浓度为0.13mg/mL(与DNA的N/P比为10)的水溶液，然后加入上述步骤3)的复合物中，吹打混匀后室温下继续孵育15min，以进一步压缩和保护吸附在铁磁性纳米载体材料表明面的目的基因，最终获得层层包覆结构的铁磁性纳米载体材料/基因复合物。

(2)铁磁性纳米载体材料/基因复合物的表征

1)载体/基因复合物的形貌观察

将上述(1)中制备的载体/基因复合物滴加至铜网上，分别在TEM和SEM下观察形成的复合物，结果如图5所示。

图5a为实施例6中合成的铁磁性纳米载体材料/基因复合物的结构示意图，由图5b的TEM图可以观察到FION表面明显的聚合物包覆层，其厚度在7.65nm左右。厚度的增加暗示本发明成功携载上了质粒DNA和游离PEI。如图5c的SEM图下，样品导电性变弱，已经无法观察到图2中本发明的立方体形貌，也暗示本发明已经成功结合了质粒DNA和游离PEI。

2)复合物的粒径和电位测定

将实施例3中制备的铁磁性纳米载体材料(FPP)、FPP只与质粒DNA孵育后形成的复合物(FPP/pDNA)、以及上述(1)中制备的载体/基因复合物(FPP/pDNA/PEI，FGC)用10mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)稀释至适宜浓度。采用微粒粒度与表面电位测定仪(3000HSA，Malvern Co.)在25℃下分别测定上述纳米材料及复合物的粒径和电位。

结果如图6所示，FPP的水力直径在60nm左右，表面带正电荷，但与质粒DNA结合后，直径增大至80nm左右，同时表面电位被逆转为负电荷。由此，暗示负电荷的质粒DNA已经被成功吸附在FPP表面。进一步，加入游离PEI后，复合物的尺寸有所减小，同时表面电荷又重新恢复到正值。说明，加入的游离PEI成功压缩了吸附在FPP表面的质粒DNA，最终形成了以FPP为内核，中间携载质粒DNA，在外层包覆游离PEI的载体/基因复合物。这一结构可以有效压缩和保护携载的质粒DNA，同时使复合物表面带正电荷，有利于后续复合物通过膜内吞途径而被细胞高效摄取。

3)复合物的凝胶电泳考察

分别将上述铁磁性纳米载体材料(FPP)只与质粒DNA孵育后的复合物(FPP/pDNA)以及本发明FPP与质粒DNA和不同N/P比的游离PEI孵育后制备的载体/基因复合物(FPP/pDNA/PEI，FGC)进行凝胶电泳实验，考察铁磁性纳米载体材料对质粒DNA的压缩能力。

结果如图7所示，其中：a:2Kb DNA maker，b:裸DNA，c:FPP/DNA，d:FPP/pDNA/PEI@N/P＝5，e:FPP/pDNA/PEI@N/P＝10，f:FPP/pDNA/PEI@N/P＝15，g:FPP/pDNA/PEI@N/P＝20，h:FPP/pDNA/PEI@N/P＝30。本发明FPP单纯与质粒DNA孵育并不能有效压缩DNA，而进一步加入游离PEI后，在N/P比5到30都可以有效压缩DNA，说明本发明FPP与质粒DNA和游离PEI的这种特殊的层层包覆结构可以有效携载和压缩目的基因。

实施例7：铁磁性纳米载体材料/基因复合物(FGC)的制备

(1)载体/基因复合物的制备

具体操作步骤与实施例6相似，不同处在于步骤2)中的待转染基因采用编码绿色荧光蛋白的质粒DNA(pEGFP)，最终获得层层包覆结构的铁磁性纳米载体材料/基因复合物。

应用例：载体/基因复合物用于干细胞的基因转染

(1)对间质干细胞的基因转染

以人脐带血来源的间质干细胞(hMSC)为例，对本发明在有无外加磁场条件下的基因转染效率进行评价。分别采用实施例6中编码虫荧光素酶的质粒DNA(pGL-3)和实施例7中编码绿色荧光蛋白的质粒DNA(pEGFP)作为报告基因来检测本发明复合物(FGC)的转染效率。

同时设置空白对照组(Blank)、PEI组(PEI/pDNA)，以及本发明铁磁性纳米载体材料只与质粒DNA孵育组(FPP/pDNA)作为对比。

具体步骤如下：

1)将hMSC按6×10⁴个/孔接种于24孔板，并放置于5％CO₂细胞培养箱内，37℃下培养24h；

2)弃去培养液，用磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗两次，每孔加入0.5mL不含血清的hMSC培养液，将实施例6中制备的FGC用等体积的5％蔗糖溶液稀释后按每孔40μL加入；

3)对于无外加磁场转染组，在5％CO₂，37℃条件下转染3h；对于外加磁场条件下的转染组，在加入FGC后，先将细胞培养板放置于钴镍磁铁(磁场强度为0.3特斯拉)上作用半小时，随后撤去外加磁场，并继续在5％CO₂，37℃条件下转染2.5h；

3)在上述转染结束后，弃去培养液，重新更换为含10％胎牛血清的新鲜培养液，在5％CO₂，37℃下继续培养24h；

(2)基因转染效率检测

采用pGL-3报告基因来定量比较各实验组的转染效率，具体步骤如下：

1)将转染后的细胞弃去培养液，用磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗两次，每孔加入0.2mL的细胞裂解液，室温下振摇30min。然后将裂解液转移至1.5mL离心管，14,000rpm，4℃条件下离心20min；

2)吸取上清液0.1mL，加入等体积虫荧光素酶底物，轻微吹打混匀后立即在化学发光仪下测定各组的相对光强度(RLU)；

3)取浓度为0.5mg/mL的蛋白标准液，双蒸水稀释成系列浓度：25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL，400μg/mL，500μg/mL，分别取各浓度标准液20μL转移至96孔板中，再按每孔200μL加入BCA工作液，37℃孵育30min后，酶标仪595nm波长处检测每孔的吸光度，绘制浓度-吸光度标准曲线；

4)取上述1)中各组上清液20μL转移至96孔板中，然后，加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min后，酶标仪595nm波长处检测吸光度。每组至少设置平行重复组4组(n＝4)。根据上述3)中绘制的标准曲线计算各组蛋白质浓度；

5)按以下公式计算各组hMSC转染后的虫荧光素酶活性(酶活性越高则说明相应的转染效率越高)：

检测结果如图8所示，本发明的铁磁性纳米载体材料相比单纯的游离PEI在hMSC上具有更高的转染效率。同时，外加磁场的存在与否对铁磁性纳米载体材料的转染效率并无显著性影响，表明本发明可以实现不依赖外加磁场的高效基因转染。因此，较传统的磁转染试剂具有操作更为简便、灵活性更好等优势。

同时还采用pEGFP作为报告基因来定性观察各实验组的转染效率。将各实验组转染后的细胞直接置于荧光倒置显微镜下观察，结果如图9所示：

经本发明转染后的hMSC，其绿色荧光蛋白的表达效率明显高于PEI组。同时，外加磁场的存在与否对本发明转染后的绿色荧光蛋白表达效率并无明显影响，进一步表明本发明可以实现不依赖外加磁场的高效基因转染。

(3)不同外加磁场强度对本发明基因转染效率的影响

以pGL-3为报告基因，制备本实施例(6)中的铁磁性纳米载体材料/基因复合物，来进一步比较不同强度的外加磁场对本发明转染效率的影响。结果如图10所示：

不同强度的外加磁场(强度从0特斯拉至0.5特斯拉)对于本发明的磁转染效率并无显著影响，进一步说明本发明可以实现不依赖外加磁场的高效磁转染。

(4)对干细胞的毒性考察

以hMSC为例，采用MTS法检测本发明在基因转染过程中对于干细胞的细胞毒性。同时设置了当前最为常用的阳离子脂质体(Lipofectmine^TM 2000，Lipo 2000组)和阳离子聚合物(PEI组)两种非病毒基因载体作为对照组。

具体步骤如下：

1)如本应用例(1)中所述步骤，对hMSC进行基因转染；

2)将转染后的细胞弃去培养液，用磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗两次后，每孔加入400μL新鲜培养液和100μL MTS试剂，并置于5％CO₂孵箱，37℃下孵育4h；

5)采用酶标仪在570nm下测定吸光度值(OD值)。

6)按以下公式计算hMSC转染后的生存率以评价细胞毒性，结果如图11所示。

由图11可见，本发明在无外加磁场条件下对于hMSC没有明显的细胞毒性，在有外加磁场条件下表现了轻微的细胞毒性。由此说明，本发明用于干细胞的基因转染是相对安全的，并且更适合于在无外加磁场条件下进行基因转染。

Claims (9)

1.一种铁磁性纳米载体材料/基因复合物，其特征在于，所述铁磁性纳米载体材料/基因复合物为层层包覆结构，包括铁磁性纳米载体材料以及通过静电吸引作用依次吸附在铁磁性纳米载体材料上的目的基因和第二阳离子聚合物；

所述铁磁性纳米载体材料包括：内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用修饰第一阳离子聚合物；所述中间层包括两层油酸以及连接两层油酸疏水端的聚已内酯；所述四氧化三铁纳米立方体、聚已内酯和油酸的质量比为8～12:2～5:1；所述四氧化三铁纳米立方体的边长为22～35nm。

2.根据权利要求1所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物，其特征在于，所述目的基因为质粒DNA、功能性信使RNA或小干扰RNA。

3.根据权利要求1所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物，其特征在于，所述第一阳离子聚合物为支状聚乙烯亚胺、线状聚乙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、丙二胺、壳聚糖或β-氨基酯。

4.根据权利要求1所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物，其特征在于，所述第二阳离子聚合物为支状聚乙烯亚胺、线状聚乙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、丙二胺、壳聚糖或β-氨基酯。

5.一种如权利要求1～4任一所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)通过热分解法，利用油酸还原乙酰丙酮铁，得到四氧化三铁纳米立方体；四氧化三铁纳米立方体的边长为22～35nm；

2)将四氧化三铁纳米立方体分散于混合溶剂中，分别加入聚已内酯和油酸，反应得到能在水相体系中稳定分散的铁磁性纳米立方体；所述四氧化三铁纳米立方体、聚已内酯和油酸的质量比为8～12:2～5:1；

3)将溶解有过量第一阳离子聚合物的混合溶剂加入到步骤2)中的铁磁性纳米立方体的反应体系中，经相转化反应后得到表面带正电荷的铁磁性纳米载体材料；

4)将步骤3)中的铁磁性纳米载体材料与目的基因在室温下共孵育，使铁磁性纳米载体材料与目的基因通过静电吸引作用相结合；

5)继续加入第二阳离子聚合物溶液，并在室温下共孵育，得到层层包覆结构的铁磁性纳米载体材料/基因复合物。

6.根据权利要求5所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中铁磁性纳米载体材料与目的基因的质量比为0.1～0.6。

7.根据权利要求5所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中共孵育时间为10～30min，所述步骤5)中共孵育时间为10～30min。

8.根据权利要求5所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中共孵育是指：将灭菌处理后的铁磁性纳米载体材料和目的基因分别用蔗糖水或磷酸缓冲液配制成溶液，混合后室温下共孵育。

9.一种如权利要求1～4任一所述的铁磁性纳米载体材料/基因复合物在干细胞基因转染中的应用。