CN106399226A - 一种靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法和应用方法 - Google Patents

一种靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法和应用方法 Download PDF

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CN106399226A CN201610744514.7A CN201610744514A CN106399226A CN 106399226 A CN106399226 A CN 106399226A CN 201610744514 A CN201610744514 A CN 201610744514A CN 106399226 A CN106399226 A CN 106399226A
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Abstract

本发明提供一种靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，包括以下步骤：一、通过高温热分解法在油相中制备粒径10‑20nm的四氧化三铁纳米颗粒；二、双亲性聚合物的合成；三、通过步骤二得到的双亲性聚合物实现步骤一得到的四氧化三铁纳米颗粒的水相转化，得到水溶性超顺磁性纳米粒子；四、在EDC/NHS的偶联作用下使得步骤三得到的水溶性超顺磁性纳米粒子共价偶联靶分子，得到靶向性超顺磁性纳米探针。本发明还提供该探针的应用方法，在分选柱和外加磁场的作用下，可以特异、有效的捕获并分离目的细胞。与现有技术相比，本发明制备的探针具有粒径均一、T2弛豫率高、稳定性好、pH值及高盐耐受力强、目的细胞分离效果好等优点。

Description

一种靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法和应用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法和应用方法。
背景技术
磁性纳米粒子是一种具有磁响应性的纳米材料，利用其良好的生物相容性、特异性和磁各异相性等优点，通过表面修饰可以制备出功能多样化的磁性纳米探针，因而可以广泛应用于生物分离和医学检测等领域，而现如今，其在磁成像、磁热疗、细菌分离、药物递送等方向均取得显著的成果。广泛开展磁性纳米材料在生物医学和临床检测等方面的研发和应用已经成为当前的研究热点。
传统的靶向性磁性纳米探针常常以水热法、物理气相沉积法等制备的磁性纳米粒子作为载体，制备过程虽简单、成本较低，但所得到的磁性纳米粒子往往粒径分布不均一、水溶性较差、极易团聚，使后期表面修饰带来一定的困难；另外，传统的磁性纳米粒子往往直径在50～200nm之间，属于铁磁性或亚铁磁性纳米粒子，对外加磁场反应过强，捕获有目的细胞后用于收集时，可由于外加强磁场的作用出现细胞变形、甚至破碎等问题，大大的影响了目的细胞的分选率和灵敏度，为后期的医学应用造成困难。
随着科学技术的发展和临床的实际应用，人们对磁性纳米材料的要求越来越高，目前使用的磁性纳米粒子已经不能满足人们的需要。主要原因是其制备工艺和表面修饰效果不理想，主要表现为：颗粒较大、分散性差、磁各异相性弱、粒径分布不均一、表面修饰不稳定等问题，使其在后期生物检测与分离等应用中出现灵敏度不高、靶向性不好等结果，为后期的动物实验和临床应用带来众多困扰。
该发明中我们通过高温热分解法在油相中制备粒径约15nm的四氧化三铁纳米颗粒，并通过双亲性聚合物实现磁性纳米粒子的水相转化，再在EDC/NHS的偶联作用下共价偶联靶分子，从而研制出一种新型的具有靶向性的超顺磁性纳米探针。利用该探针捕获目的细胞，使其能在外加磁场作用下获得血液中目的细胞的特异性分离。该探针与以往使用的探针相比，具有粒径分布均一、稳定性高、不易团聚、pH值及高盐耐受力强、T2弛豫率高等优点，可以灵敏的捕获并分离出目的分子。
发明内容
为了改善磁性纳米探针在生物医疗中的应用，充分发挥其特性，本发明公开了一种可以高效分离目的细胞的超顺磁性纳米探针的制备方法。具体为：一种靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、通过高温热分解法在油相中制备粒径10-20nm的四氧化三铁纳米颗粒；
步骤二、双亲性聚合物的合成；
步骤三、通过步骤二得到的双亲性聚合物实现步骤一得到的四氧化三铁纳米颗粒的水相转化，得到水溶性超顺磁性纳米粒子；
步骤四、在EDC/NHS的偶联作用下使得步骤三得到的水溶性超顺磁性纳米粒子共价偶联靶分子，得到靶向性超顺磁性纳米探针。
(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)；N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称NHS)。EDC/NHS表示EDC和NHS。进一步地，步骤四中EDC和NHS的摩尔比是1:3。
进一步地，步骤一中制备四氧化三铁纳米颗粒的反应物包括铁前驱体、十六烷二醇、油胺、油酸和反应溶剂；反应溶剂包括二苯醚、二苄醚、十八烯和二辛醚中的一种或者多种。
进一步地，步骤一中铁前驱体、十六烷二醇、油胺、油酸的摩尔比是(1～3):(3～10):(2～8):(2～8)；反应溶剂的用量是1～3mmol的铁前驱体对应10～20mL的反应溶剂。
进一步地，铁前驱体包括氯化亚铁、乙酰丙酮铁、氯化铁和氧化铁中的一种或者多种。
进一步地，步骤一具体为：按比例取铁前驱体、十六烷二醇、油胺、油酸及反应溶剂混合，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物加热至200℃，并保温2～4h，之后继续加热直至沸腾并保温1～3h，之后停止保温使其反应终止，得到产物一；将产物一冷却后加入无水乙醇，离心，取沉淀，得到产物二；将产物二重悬于氯仿中，加入用无水乙醇再次离心，取沉淀，得到反应种子；将反应种子分散于氯仿中保存；
再次按比例取铁前驱体、十六烷二醇、油胺、油酸及反应溶剂混合，并加入反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物加热至200℃，并保温2～4h，之后继续加热直至沸腾并保温1～3h，之后停止保温使其反应终止，得到产物三；将产物三冷却后加入无水乙醇洗涤，离心，取沉淀，得到四氧化三铁纳米颗粒，并将其分散于氯仿中保存。
进一步地，反应种子与反应溶剂的用量关系是：10～20mL的反应溶剂对应于20～60mg反应种子。
进一步地，20～60mg反应种子分散在2mL氯仿中。
进一步地，步骤一中的加热均采用加热套加热。
进一步地，步骤二中双亲性聚合物的合成具体是：
取聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和十二胺，并加入四氢呋喃溶液，超声20～60s后，加热至60～70℃，保温并持续搅拌2～6h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即双亲性聚合物，将双亲性聚合物溶解在氯仿中；聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和十二胺的摩尔比是(10～30):(5～25)；四氢呋喃溶液与聚(异丁烯-alt-马来酸酐)的用量关系是10～30mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)对应于50～200mL四氢呋喃溶液。该淡黄色固体是一种双亲性聚合物。发明人将该淡黄色固体命名为双亲性聚合物PMA。
进一步地，步骤三具体为：将步骤一得到的四氧化三铁纳米颗粒与步骤二得到的双亲性聚合物按照比表面积1:(100～600)混合，利用旋转蒸发仪将所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至2～5mL的蒸馏水或者去离子水中，然后用超速离心机离心去上清从而去除多余聚合物，得到水溶性超顺磁性纳米粒子，将水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水或者去离子水中备用。SBB 12缓冲溶液即50mM硼酸溶液利用NaOH调至pH值为12。
进一步地，步骤四具体为：将步骤三得到的水溶性超顺磁性纳米粒子与靶分子按照摩尔比1:(10～20)混合后，加入EDC/NHS溶液进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管离心去除混合物中的EDC和未偶联的靶分子，所得产物即为靶向性超顺磁性纳米探针。
进一步地，靶分子包括核酸、抗体、叶酸、多肽中的一种或者多种。
本发明还提供一种如上所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法获得的靶向性超顺磁性纳米探针的应用方法。该应用方法是取靶向性超顺磁性纳米探针与含有目的细胞的血液混合孵育10～30min，然后加入到含有磁珠的分选柱中，含有磁珠的分选柱位于外加磁场中；向含有磁珠的分选柱中加入生理盐水，捕获有目的细胞的靶向性超顺磁性纳米探针吸附在含有磁珠的分选柱中，而未被捕获的细胞则随着生理盐水流出；去掉外加磁场后，捕获有目的细胞的靶向性超顺磁性纳米探针随着加入的生理盐水从含有磁珠的分选柱中洗脱下来，达到分离目的细胞的作用。
进一步地，目的细胞包括癌细胞、白细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和干细胞中的一种或者多种。
本发明中所制备的磁性纳米粒子(即步骤一中的四氧化三铁纳米颗粒)直径约15nm，属于超顺磁性纳米材料，其分散在氯仿中，称为单分散的超顺磁性纳米粒子。当存在有外加磁场的作用下，稳定存在于水相中的磁性纳米粒子可以被牵引到磁场方向；而当去掉外加磁场后，纳米粒子可再次稳定存在于水相溶液中。因此，由该超顺磁性纳米材料制备的磁性纳米探针(即靶向性超顺磁性纳米探针)，在捕获有目的细胞后，通过分选柱和外加磁场的作用，可以有效的吸附于分选柱中，而去除掉外加磁场后，随着缓冲液的流动使得目的产物稳定存在于溶液中。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1.制得的单分散的超顺磁性纳米粒子，粒径分布均匀(～15nm)、稳定性好、T2弛豫率高(约250mM-1s-1)。
2.双亲性聚合物包被的超顺磁性纳米粒子，即本发明中的水溶性超顺磁性纳米粒子在去离子水中可室温保存一年，在pH5.0～12情况下均可稳定保存两个月以上，而在100mM的NaCl溶液下可稳定保存一个月以上。因此，水溶性超顺磁性纳米粒子可以适应较大范围的pH值变化和耐盐度高，在复杂的血液等体系中也能保持较高的稳定性。
3.靶向性超顺磁性纳米探针中的纳米材料表面本身含有大量羧基，使得稳定性更好，同时大量羧基可以偶联很多叶酸，保证了单个粒子上的叶酸含量较高，使得靶向性好，细胞捕获率提高。因此，本发明所涉及的靶向性超顺磁性纳米探针的稳定性好、靶向性好、细胞捕获率高。
4.在外加磁场作用下，捕获有目的细胞的靶向性超顺磁性纳米探针可牢固的吸附于分选柱中；而除去外加磁场后，又容易被洗脱。
附图说明
图1是单分散的超顺磁性纳米粒子的透射电镜图片。
图2是单分散的超顺磁性纳米粒子的高分辨透射电镜图片。
图3是靶向性超顺磁性纳米探针的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是单分散的靶向性超顺磁性纳米探针的磁滞曲线。
图5是靶向性超顺磁性纳米探针捕获与分离目的细胞的流程图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
(1)为制得单分散的超顺磁性纳米粒子，秤取2mmol的氯化铁、10mmol的十六烷二醇、6mmol的油胺、6mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度2h，之后将加热套移开使其反应终止。将所得黑色液体(即产物一)冷却至室温后加入10～30mL的无水乙醇并离心沉淀(离心条件：2000rpm，10min)，所得黑色沉淀(即产物二)重悬于氯仿中，利用无水乙醇再次离心沉淀后，所得样品分散于氯仿中保存。
利用该样品(即所得单分散的超顺磁性纳米粒子)作为反应种子，根据种子生长法可获得较大尺寸的超顺磁性纳米粒子。具体步骤为：秤取2mmol的氯化铁、10mmol的十六烷二醇、8mmol的油胺、8mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，并加入上述所得的60mg分散于2mL氯仿中的反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度1h，之后将加热套移开使其反应终止，得到产物三。将产物三冷却至室温后按照上述步骤清洗，并分散在氯仿中，得到直径约15nm的四氧化三铁纳米颗粒，也称为超顺磁性纳米粒子。
图1为制备所得超顺磁性纳米粒子的透射电镜图，由图中可知，纳米粒子分散性好，粒径均一，且直径约15nm。图2为单个超顺磁性粒子的高分辨透射电镜图。
(2)双亲性聚合物PMA的合成步骤具体如下：称取30mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和25mmol十二胺于250mL的圆底烧瓶中，加入50mL四氢呋喃溶液，超声60s后，加热至65℃并持续搅拌3h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即双亲性聚合物PMA。将双亲性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即为0.5M的双亲性聚合物PMA。
(3)将步骤(1)所得单分散的超顺磁性纳米粒子与步骤(2)所得的双亲性聚合物按照比表面积1:600混合于100mL的圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪将烧瓶内所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在20mL的SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至5mL的蒸馏水中(离心条件：4000rpm，10min)，然后利用超速离心机(20,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超顺磁性纳米粒子，将水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水中备用。水溶性超顺磁性纳米粒子是包被了双亲性聚合物的超顺磁性纳米粒子。
(4)将步骤(3)所得的水溶性超顺磁性纳米粒子与抗体按照摩尔比1:20混合后，加入0.5mL的EDC/NHS溶液(摩尔比1:3)进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管去除混合物中的EDC和未偶联的抗体(离心条件：3000rpm，20min)，所得产物即为具有靶向性超顺磁性纳米探针。随后将其放置于4℃备用。
图3为靶向性超顺磁性纳米探针的琼脂糖凝胶电泳图，其中，左边条带为常用标准对照Au NPs(4nm)；中间条带为水溶性超顺磁性纳米粒子，即包被后的超顺磁性纳米粒子；右边条带为靶向性超顺磁性纳米探针，即共价偶联靶分子后的超顺磁性纳米探针。从该图中可以看出，纳米粒子经过靶分子修饰后体积变大，琼脂糖凝胶中运动缓慢，由此可知，靶分子成功修饰于磁性纳米材料表面。
图4为靶向性超顺磁性纳米探针的磁滞回归曲线。纵坐标为磁化强度(M)，横坐标为磁场强度(H)。从图中可知，在室温下，该探针在交变磁场中未出现磁滞现象，且饱和磁化强度为70emu/g，说明制备的探针为超顺磁性纳米探针。
(5)取5mL步骤(4)制得的探针与5mL含有胃癌细胞的血液混合孵育30min，将混合液缓慢加入到固定有外加磁场的含有磁珠的分选柱中(进样速度：1mL/min)，捕获有胃癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针便吸附在分选柱中，而未被捕获的其他细胞则随着加入的生理盐水缓慢流出(流速：10mL/min)；磁性吸附于分选柱中的捕获有胃癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，在去掉外加磁场后，可随着生理盐水流出，从而收集到捕获有胃癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，达到分离、分选目的细胞的目的。
图5为靶向性超顺磁性纳米探针捕获与分离目的细胞的流程图。由图中所示，当探针捕获目的细胞后，在外加磁场作用下，可被带有磁珠的分选柱吸附在柱内，从而使其达到目的细胞与其他细胞的分离；当去掉外加磁场后，加入的生理盐水可以清洗并收集吸附的目的细胞，达到实验目的。
实施例2
(1)为制得单分散的超顺磁性纳米粒子，秤取1mmol的乙酰丙酮铁、5mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热3h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度1h，之后将加热套移开使其反应终止。将所得黑色液体(即产物一)冷却至室温后加入10mL的无水乙醇并离心沉淀(离心条件：2000rpm，10min)，所得黑色沉淀(即产物二)重悬于氯仿中，利用无水乙醇再次离心沉淀后，所得样品分散于氯仿中保存。
利用该样品(即所得单分散的超顺磁性纳米粒子)作为反应种子，根据种子生长法可获得较大尺寸的超顺磁性纳米粒子。具体步骤为：秤取1mmol的乙酰丙酮铁、5mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，并加入上述所得的20mg分散于2mL氯仿中的反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度1h，之后将加热套移开使其反应终止，得到产物三。将产物三冷却至室温后按照上述步骤清洗，并分散在氯仿中，得到直径约15nm的四氧化三铁纳米颗粒，也称为超顺磁性纳米粒子。
(2)双亲性聚合物PMA的合成步骤具体如下：称取10mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和5mmol十二胺于250mL的圆底烧瓶中，加入50mL四氢呋喃溶液，超声30s后，加热至60℃并持续搅拌6h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即双亲性聚合物PMA。将双亲性聚合物PMA溶解在20mL的氯仿中，即为0.1M的双亲性聚合物PMA。
(3)将步骤(1)所得单分散的超顺磁性纳米粒子与步骤(2)所得的双亲性聚合物按照比表面积1:100混合于100mL的圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪将烧瓶内所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在20mL的SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至5mL的蒸馏水中(离心条件：3000rpm，10min)，然后利用超速离心机(20,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超顺磁性纳米粒子，将水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水中备用。水溶性超顺磁性纳米粒子是包被了聚合物的超顺磁性纳米粒子。
(4)将步骤(3)所得聚合物包被的水溶性超顺磁性纳米粒子与多肽分子按照摩尔比1:10混合后，加入1mL的EDC/NHS溶液(摩尔比1:3)进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管去除混合物中的EDC和未偶联的多肽分子(离心条件：3000rpm，20min)，所得产物即为具有靶向性超顺磁性纳米探针。随后将其放置于4℃备用。
(5)取3mL步骤(4)制得的探针与3mL含有CIK细胞的血液混合孵育15min，将混合液缓慢加入到固定有外加磁场的含有磁珠的分选柱中(进样速度：1mL/min)，捕获有CIK细胞的靶向性超顺磁性纳米探针便吸附在分选柱中，而未被捕获的其他细胞则随着加入的生理盐水缓慢流出(流速：1mL/min)；磁性吸附于分选柱中的捕获有目的细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，在去掉外加磁场后，可随着生理盐水流出，从而收集到捕获有目的细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，达到分离、分选目的细胞的目的。
实施例3
(1)为制得单分散的超顺磁性纳米粒子，秤取2mmol的氧化铁、8mmol的十六烷二醇、2mmol的油胺、2mmol的油酸及15mL的二苯醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度2h，之后将加热套移开使其反应终止。将所得黑色液体(即产物一)冷却至室温后加入30mL的无水乙醇并离心沉淀(离心条件：4000rpm,10min)，所得黑色沉淀(即产物二)重悬于氯仿中，利用无水乙醇再次离心沉淀后，所得样品分散于氯仿中保存。
利用该样品(即所得单分散的超顺磁性纳米粒子)作为反应种子，根据种子生长法可获得较大尺寸的超顺磁性纳米粒子。具体步骤为：秤取2mmol的铁前驱体、8mmol的十六烷二醇、2mmol的油胺、2mmol的油酸及15mL的反应溶剂混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，并加入上述所得的20mg分散于2mL氯仿中的反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度2h，之后将加热套移开使其反应终止，得到产物三。将产物三冷却至室温后按照上述步骤清洗，并分散在氯仿中，得到直径约15nm的四氧化三铁纳米颗粒，也称为超顺磁性纳米粒子。
(2)双亲性聚合物PMA的合成步骤具体如下：称取20mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和20mmol十二胺于250mL的圆底烧瓶中，加入200mL四氢呋喃溶液，超声60s后，加热至70℃并持续搅拌3h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即双亲性聚合物PMA。将双亲性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即为0.4M的双亲性聚合物PMA。
(3)将步骤(1)所得单分散的超顺磁性纳米粒子与步骤(2)所得的双亲性聚合物按照比表面积1:600混合于100mL的圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪将烧瓶内所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在20mL的SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至5mL的蒸馏水中(离心条件：3000rpm，10min)，然后利用超速离心机(20,000rpm，0.5h)去除多余的聚合物，得到水溶性超顺磁性纳米粒子，将水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水中备用。水溶性超顺磁性纳米粒子是包被了聚合物的超顺磁性纳米粒子。
(4)将步骤(3)所得聚合物包被的水溶性超顺磁性纳米粒子与叶酸按照摩尔比1:10混合后，加入2mL的EDC/NHS溶液(摩尔比1:3)进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管去除混合物中的EDC和未偶联的叶酸分子(离心条件：2000rpm，10min)，所得产物即为具有靶向性超顺磁性纳米探针。随后将其放置于4℃备用。
(5)取3mL步骤(4)制得的探针与3mL含有肺癌细胞的血液混合孵育20min，将混合液缓慢加入到固定有外加磁场的含有磁珠的分选柱中(进样速度：5mL/min)，捕获有肺癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针便吸附在分选柱中，而未被捕获的其他细胞则随着加入的生理盐水缓慢流出(流速：5mL/min)；磁性吸附于分选柱中的捕获有肺癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，在去掉外加磁场后，可随着生理盐水流出，从而收集到捕获有肺癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，达到分离、分选目的细胞的目的。
实施例4
(1)为制得单分散的超顺磁性纳米粒子，秤取1mmol的氯化亚铁、6mmol的十六烷二醇、6mmol的油胺、6mmol的油酸及20mL的二辛醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度2h，之后将加热套移开使其反应终止。将所得黑色液体(即产物一)冷却至室温后加入25mL的无水乙醇并离心沉淀(离心条件：3000rpm，10min)，所得黑色沉淀(即产物二)重悬于氯仿中，利用无水乙醇再次离心沉淀后，所得样品分散于氯仿中保存。
利用该样品(即所得单分散的超顺磁性纳米粒子)作为反应种子，根据种子生长法可获得较大尺寸的超顺磁性纳米粒子。具体步骤为：秤取2mmol的氯化亚铁、6mmol的十六烷二醇、6mmol的油胺、6mmol的油酸及20mL的二辛醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，并加入上述所得的40mg分散于2mL氯仿中的反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度1h，之后将加热套移开使其反应终止，得到产物三。将产物三冷却至室温后按照上述步骤清洗，并分散在氯仿中，得到直径约15nm的四氧化三铁纳米颗粒，也称为超顺磁性纳米粒子。
(2)双亲性聚合物PMA的合成步骤具体如下：称取20mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和10mmol十二胺于250mL的圆底烧瓶中，加入100mL四氢呋喃溶液，超声60s后，加热至65℃并持续搅拌2h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即双亲性聚合物PMA。将双亲性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即为0.2M的双亲性聚合物PMA。
(3)将步骤(1)所得单分散的超顺磁性纳米粒子与步骤(2)所得的双亲性聚合物按照比表面积1:100混合于100mL的圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪将烧瓶内所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在20mL的SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至5mL的蒸馏水中(离心条件：3000rpm，10min)，然后利用超速离心机(10,000rpm，0.5h)去除多余的聚合物，得到水溶性超顺磁性纳米粒子，将水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水中备用。水溶性超顺磁性纳米粒子是包被了聚合物的超顺磁性纳米粒子。
(4)将步骤(3)所得聚合物包被的水溶性超顺磁性纳米粒子与microRNA按照摩尔比1:10混合后，加入2mL的EDC/NHS溶液(摩尔比1:3)进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管去除混合物中的EDC和未偶联的microRNA分子(离心条件：1000rpm，15min)，所得产物即为具有靶向性超顺磁性纳米探针。随后将其放置于4℃备用。
(5)取2mL步骤(4)制得的探针与2mL含有胃癌细胞的血液混合孵育10min，将混合液缓慢加入到固定有外加磁场的含有磁珠的分选柱中(进样速度：2mL/min)，捕获有胃癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针便吸附在分选柱中，而未被捕获的其他细胞则随着加入的生理盐水缓慢流出(流速：2mL/min)；磁性吸附于分选柱中的捕获有胃癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，在去掉外加磁场后，可随着生理盐水流出，从而收集到捕获有胃癌细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，达到分离、分选目的细胞的目的。
实施例5
(1)为制得单分散的超顺磁性纳米粒子，秤取3mmol的乙酰丙酮铁、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度1h，之后将加热套移开使其反应终止。将所得黑色液体(即产物一)冷却至室温后加入20mL的无水乙醇并离心沉淀(离心条件：3000rpm,10min)，所得黑色沉淀(即产物二)重悬于氯仿中，利用无水乙醇再次离心沉淀后，所得样品分散于氯仿中保存。
利用该样品(即所得单分散的超顺磁性纳米粒子)作为反应种子，根据种子生长法可获得较大尺寸的超顺磁性纳米粒子。具体步骤为：秤取3mmol的乙酰丙酮铁、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，并加入上述所得的30mg分散于2mL氯仿中的反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度2h，之后将加热套移开使其反应终止，得到产物三。将产物三冷却至室温后按照上述步骤清洗，并分散在氯仿中，得到直径约15nm的四氧化三铁纳米颗粒，也称为超顺磁性纳米粒子。
(2)双亲性聚合物PMA的合成步骤具体如下：称取20mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和5mmol十二胺于250mL的圆底烧瓶中，加入50mL四氢呋喃溶液，超声40s后，加热至65℃并持续搅拌4h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即双亲性聚合物PMA。将双亲性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即为0.2M的双亲性聚合物PMA。
(3)将步骤(1)所得单分散的超顺磁性纳米粒子与步骤(2)所得的双亲性聚合物按照比表面积1:500混合于100mL的圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪将烧瓶内所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在20mL的SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至3mL的蒸馏水中(离心条件:1000rpm，10min)，然后利用超速离心机(15,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超顺磁性纳米粒子，将水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水中备用。水溶性超顺磁性纳米粒子是包被了聚合物的超顺磁性纳米粒子。
(4)将步骤(3)所得聚合物包被的水溶性超顺磁性纳米粒子与抗体按照摩尔比1:15混合后，加入1mL的EDC/NHS溶液(摩尔比1:3)进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管去除混合物中的EDC和未偶联的抗体(离心条件：2000rpm，20min)，所得产物即为具有靶向性超顺磁性纳米探针。随后将其放置于4℃备用。
(5)取4mL步骤(4)制得的探针与4mL含有淋巴细胞的血液混合孵育15min，将混合液缓慢加入到固定有外加磁场的含有磁珠的分选柱中(进样速度：2mL/min)，捕获有淋巴细胞的靶向性超顺磁性纳米探针便吸附在分选柱中，而未被捕获的其他细胞则随着加入的生理盐水缓慢流出(流速：6mL/min)；磁性吸附于分选柱中的捕获有淋巴细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，在去掉外加磁场后，可随着生理盐水流出，从而收集到捕获有淋巴细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，达到分离、分选目的细胞的目的。
实施例6
(1)为制得单分散的超顺磁性纳米粒子，秤取2.5mmol的氯化铁、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的二苄醚混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热3h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度3h，之后将加热套移开使其反应终止。将所得黑色液体(即产物一)冷却至室温后加入30mL的无水乙醇并离心沉淀(离心条件：3000rpm,10min)，所得黑色沉淀(即产物二)重悬于氯仿中，利用无水乙醇再次离心沉淀后，所得样品分散于氯仿中保存。
利用该样品(即所得单分散的超顺磁性纳米粒子)作为反应种子，根据种子生长法可获得较大尺寸的超顺磁性纳米粒子。具体步骤为：秤取2.5mmol的铁前驱体、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的反应溶剂混合于100mL的三颈圆底烧瓶中，并加入上述所得的30mg分散于2mL氯仿中的反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物利用加热套升温至200℃，并在该温度持续加热2h，之后继续加热直至沸腾并保持该温度1h，之后将加热套移开使其反应终止，得到产物三。将产物三冷却至室温后按照上述步骤清洗，并分散在氯仿中，得到直径约15nm的四氧化三铁纳米颗粒，也称为超顺磁性纳米粒子。
(2)双亲性聚合物PMA的合成步骤具体如下：称取10mmol聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和20mmol十二胺于250mL的圆底烧瓶中，加入100mL四氢呋喃溶液，超声30s后，加热至65℃并持续搅拌2h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即双亲性聚合物PMA。将双亲性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即为0.1M的双亲性聚合物PMA。
(3)将步骤(1)所得单分散的超顺磁性纳米粒子与步骤(2)所得的双亲性聚合物按照比表面积1:300混合于100mL的圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪将烧瓶内所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在15mL的SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至5mL的蒸馏水中(离心条件:3000rpm,10min)，然后利用超速离心机(15,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超顺磁性纳米粒子，将水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水中备用。水溶性超顺磁性纳米粒子是包被了聚合物的超顺磁性纳米粒子。
(4)将步骤(3)所得聚合物包被的水溶性超顺磁性纳米粒子与多肽分子按照摩尔比1:10混合后，加入2mL的EDC/NHS溶液(摩尔比1:3)进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管去除混合物中的EDC和未偶联的多肽分子(离心条件：2000rpm,20min)，所得产物即为具有靶向性超顺磁性纳米探针。随后将其放置于4℃备用。
(5)取2mL步骤(4)制得的探针与2mL含有干细胞的血液混合孵育20min，将混合液缓慢加入到固定有外加磁场的含有磁珠的分选柱中(进样速度：1mL/min)，捕获有干细胞的靶向性超顺磁性纳米探针便吸附在分选柱中，而未被捕获的其他细胞则随着加入的生理盐水缓慢流出(流速：10mL/min)；磁性吸附于分选柱中的捕获有干细胞的靶向性超顺磁性纳米探针，在去掉外加磁场后，可随着生理盐水流出，从而收集到捕获有干细胞的的靶向性超顺磁性纳米探针，达到分离、分选目的细胞的目的。
实施例1-6所制备的水溶性超顺磁性纳米粒子在去离子水中可室温保存一年，在pH5.0～12情况下均可稳定保存两个月以上，而在100mM的NaCl溶液下可稳定保存一个月以上。实施例1-6所得单分散的超顺磁性纳米粒子的T2弛豫率约250mM-1s-1。
实施例2-6所制备的单分散的超顺磁性纳米粒子和靶向性超顺磁性纳米探针在性能上分别与实施例1制备的单分散的超顺磁性纳米粒子和靶向性超顺磁性纳米探针类似，其图片结果也类似于图1-4的显示结构，未免过多赘述，没有逐一示出。实施例2-6所制备的靶向性超顺磁性纳米探针捕获与分离目的细胞的流程图，如图5所示。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、通过高温热分解法在油相中制备粒径10-20nm的四氧化三铁纳米颗粒；
步骤二、双亲性聚合物的合成；
步骤三、通过所述步骤二得到的双亲性聚合物实现所述步骤一得到的四氧化三铁纳米颗粒的水相转化，得到水溶性超顺磁性纳米粒子；
步骤四、在EDC/NHS的偶联作用下使得所述步骤三得到的水溶性超顺磁性纳米粒子共价偶联靶分子，得到所述靶向性超顺磁性纳米探针。
2.如权利要求1所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤一中制备四氧化三铁纳米颗粒的反应物包括铁前驱体、十六烷二醇、油胺、油酸和反应溶剂；所述反应溶剂包括二苯醚、二苄醚、十八烯和二辛醚中的一种或者多种。
3.如权利要求2所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤一中所述铁前驱体、所述十六烷二醇、所述油胺、所述油酸的摩尔比是(1～3):(3～10):(2～8):(2～8)；所述反应溶剂的用量是1～3mmol的所述铁前驱体对应10～20mL的所述反应溶剂。
4.如权利要求2所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述铁前驱体包括氯化亚铁、乙酰丙酮铁、氯化铁和氧化铁中的一种或者多种。
5.如权利要求3所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体为：按比例取铁前驱体、十六烷二醇、油胺、油酸及反应溶剂混合，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物加热至200℃，并保温2～4h，之后继续加热直至沸腾并保温1～3h，之后停止保温使其反应终止，得到产物一；将所述产物一冷却后加入无水乙醇，离心，取沉淀，得到产物二；将所述产物二重悬于氯仿中，加入用无水乙醇再次离心，取沉淀，得到反应种子；将所述反应种子分散于氯仿中保存；
再次按比例取铁前驱体、十六烷二醇、油胺、油酸及反应溶剂混合，并加入所述反应种子，在氮气保护和磁力搅拌作用下，混合物加热至200℃，并保温2～4h，之后继续加热直至沸腾并保温1～3h，之后停止保温使其反应终止，得到产物三；将所述产物三冷却后加入无水乙醇洗涤，离心，取沉淀，得到所述四氧化三铁纳米颗粒，并将所述四氧化三铁纳米颗粒分散于氯仿中保存。
6.如权利要求5所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述反应种子与所述反应溶剂的用量关系是：10～20mL的所述反应溶剂对应于20～60mg所述反应种子。
7.如权利要求1所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤二中双亲性聚合物的合成具体是：
取聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和十二胺，并加入四氢呋喃溶液，超声20～60s后，加热至60～70℃，保温并持续搅拌2～6h，然后利用旋转蒸发仪挥发掉一半溶剂，再继续加热搅拌过夜，次日，将剩余溶液蒸发掉后，所得淡黄色固体，即所述双亲性聚合物，将所述双亲性聚合物溶解在氯仿中；所述聚(异丁烯-alt-马来酸酐)和所述十二胺的摩尔比是(10～30):(5～25)；所述四氢呋喃溶液与所述聚(异丁烯-alt-马来酸酐)的用量关系是10～30mmol所述聚(异丁烯-alt-马来酸酐)对应于50～200mL所述四氢呋喃溶液。
8.如权利要求7所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤三具体为：将所述步骤一得到的四氧化三铁纳米颗粒与所述步骤二得到的双亲性聚合物按照比表面积1:(100～600)混合，利用旋转蒸发仪将所有溶剂全部挥发，所剩黑色固体重新溶解在SBB 12缓冲溶液中，并利用超滤管离心浓缩至2～5mL的蒸馏水或者去离子水中，然后用超速离心机离心去上清从而去除多余聚合物，得到所述水溶性超顺磁性纳米粒子，将所述水溶性超顺磁性纳米粒子溶解在蒸馏水或者去离子水中备用。
9.如权利要求1所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤四具体为：将所述步骤三得到的水溶性超顺磁性纳米粒子与靶分子按照摩尔比1:(10～20)混合后，加入EDC/NHS溶液进行共价偶联，混合物于室温反应过夜，次日利用超滤管离心去除混合物中的EDC和未偶联的靶分子，所得产物即为所述靶向性超顺磁性纳米探针。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的靶向性超顺磁性纳米探针的制备方法获得的靶向性超顺磁性纳米探针的应用方法，其特征在于，取所述靶向性超顺磁性纳米探针与含有目的细胞的血液混合孵育10～30min，然后加入到含有磁珠的分选柱中，所述含有磁珠的分选柱位于外加磁场中；向所述含有磁珠的分选柱中加入生理盐水，捕获有目的细胞的靶向性超顺磁性纳米探针吸附在所述含有磁珠的分选柱中，而未被捕获的细胞则随着所述生理盐水流出；去掉所述外加磁场后，所述捕获有目的细胞的靶向性超顺磁性纳米探针随着加入的生理盐水从所述含有磁珠的分选柱中洗脱下来，达到分离目的细胞的作用。
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