CN107557428A - 一种磁纳米颗粒及其制备方法与在病原菌检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病原菌检测技术领域，尤其涉及一种磁纳米颗粒及其制备方法与在病原菌检测中的应用。本发明提供的磁纳米颗粒，其在包裹有聚阳离子电解质的四氧化三铁纳米颗粒表面，修饰羧基化聚乙二醇和靶向核酸适配体。该磁纳米颗粒比表面积较大，负载核酸适配体的数量较高。而其表面修饰的聚乙二醇能够保护血液成分、提高磁纳米颗粒的稳定性。故而本发明提供的此纳米颗粒能够在避免产生溶血现象的前提下，对样品中的病原菌进行快速、高效富集，再以荧光染料染色后，便能够实现对病原菌准确、灵敏的检测。实验表明，以本发明提供的磁纳米颗粒制成的制剂对血液中病原菌进行检测，最低检测限可达4CFU/mL。

Description

一种磁纳米颗粒及其制备方法与在病原菌检测中的应用

技术领域

本发明涉及细菌检测技术领域，尤其涉及一种磁纳米颗粒及其制备方法与在病原菌检测中的应用。

背景技术

细菌是一类重要的病原体，它们侵入机体后会分泌产生大量的生物毒素，从而破坏机体的结构和功能，造成宿主感染。菌血症、败血症、全身炎症反应综合征、脓毒症等都是由于致病菌感染导致的疾病、其中，脓毒症是由血液细菌感染所引发的一种严重病症，全球每年有超过1800万的脓毒症病例，而且脓毒症的病情凶险，会引起机体多个器官的衰竭，除早期诊断并及时采用有效的抗菌药物治疗可获痊愈外，脓毒症患者的死亡率高达30～50％。

造成血液细菌感染的致病菌主要包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌等。由于感染早期血液中细菌的数目比较少(10～100个/毫升)，且血液中含有大量的细胞(红细胞、白细胞及血小板)和蛋白，因此对血液中细菌的进行有效富集是实现血液细菌感染快速检测的前提。

目前，血液细菌感染的检测技术主要有血液细菌分离培养法和聚合酶链式反应法。血液分离细菌培养是目前用于血液细菌感染的最常用方法，主要通过对待测血液样本进行细菌分离培养，然后再依据长出菌落的形态及生化特征来完成待检血液样品的分析检测。血液分离细菌培养周期太长，不利于病患的早期治疗。另一种目前常用的快速检测方法是聚合酶链式反应(PCR)法，其是利用分子生物学技术针对细菌的特异性DNA进行扩增和分型来实现血液细菌感染的分析检测。虽然相较血液分离细菌培养，PCR方法很大程度的缩短了周期，但由于涉及样品的前处理步骤其检测时间仍不够短，且检测结果易收到血液中其他组分的干扰。

可见为开展血液细菌感染的早期诊断，保护人民的身体健康，进一步，研究血液细菌感染的快速检测技术具有非常重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种磁纳米颗粒及其制备方法与在病原菌检测中的应用。本发明提供的磁纳米颗粒修饰有靶向核酸适配体，能够快速、准确的对细菌进行定性和定量分析。

本发明提供的磁纳米颗粒，包括包裹有聚阳离子电解质的四氧化三铁纳米颗粒和修饰在所述纳米颗粒表面的羧基化聚乙二醇和靶向核酸适配体。

本发明提供的磁纳米颗粒中，

所述四氧化三铁纳米颗粒的粒径为15nm～30nm；

所述聚阳离子电解质为聚丙烯氯化铵(PAH)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、聚乙烯亚胺(PEI)等，分子量为10000～20000。

所述羧基化聚乙二醇的分子量为3000～8000。

所述靶向核酸适配体的5’端连接有-COOH。

本发明采用的四氧化三铁纳米颗粒的粒径为15nm～30nm；修饰后，粒径变化不大，相对于现有商品化的微米级四氧化三铁磁珠而言，本发明采用的磁珠的比表面积更大，可以大大提高其负载的核酸适配体的数量，进而增强其对细菌的识别效率。另一方面，这一尺寸的纳米磁颗粒的磁效应也并没有因为尺寸的缩小受到很大影响。

本发明采用的四氧化三铁纳米颗粒采用热分解法制备。

本发明中其制备方法为：

步骤1：将氯化铁和油酸钠溶解于无水乙醇、去离子水和正己烷的混合液，70℃回流4h后，收集有机相洗涤后旋蒸2h去除正己烷，制得油酸铁；

步骤2：将油酸铁溶解于十八烯中，加入油酸钠，氮气保护下320℃回流30min；冷却至室温后，以异丙醇沉淀后，以正己烷分散；

步骤3：将正己烷分散的产物与等体积无水乙醇混合，磁铁分离后沉淀与四甲基氢氧化铵混合，振荡后加入异丙醇，再次以磁铁分离后，沉淀以去离子水洗三次，再以去离子水分散，获得四氧化三铁纳米颗粒悬液。

步骤1中所述无水乙醇、去离子水和正己烷的混合液中，无水乙醇、去离子水和正己烷的混合液的体积比为20:15:35。

步骤1中所述氯化铁和油酸钠的质量比比为0.3:1。

步骤2中，所述油酸铁、十八烯与油酸钠的质量比为225:625:38。

本发明通过静电作用将聚阳离子电解质包裹到四氧化三铁纳米颗粒表面，然后聚阳离子电解质中的氨基与聚乙二醇的羧基或靶向核酸适配体的羧基反应，通过共价偶联的方法将羧基化的聚乙二醇和靶向核酸适配体修饰到磁纳米颗粒上。本发明实施例中，所述聚阳离子电解质的分子量为10000～20000。一些实施例中，所述聚阳离子电解质的分子量为15000。一些具体实施例中，所述聚阳离子电解质为分子量为15000的聚丙烯氯化铵。

从血液样品中富集病原菌时，磁纳米颗粒很容易造成溶血现象，而一旦发生溶血，破碎的红细胞膜会吸附到细菌表面，从而对核酸适配体与细菌的相互识别造成阻碍，从而影响最终细菌的富集效率。研究表明，磁纳米颗粒表面的聚乙二醇修饰可以提高磁纳米颗粒在血液中的稳定性，以及降低其对血液成分的毒性。避免溶血现象的产生。在本发明中，修饰的聚乙二醇的分子量可以在3000到8000之间。分子量小于3000，对纳米颗粒起不到很好的稳定作用；相反，大于8000会影响纳米颗粒与细菌的识别。

本发明靶向核酸适配体的5’端连接羧基，使其能够与四氧化三铁表面磁纳米颗粒表面包裹的PAH的氨基反应，从而将核酸适配体共价偶联到磁纳米颗粒上。靶向核酸适配体根据细菌的保守序列设计，对细菌识别具有良好的特异性。

本发明中，所述四氧化三铁纳米颗粒与所述聚阳离子电解质的质量比为20:1。

本发明中，所述聚阳离子电解质、羧基化聚乙二醇和核酸适配体的摩尔比为1:25:0.3。

本发明提供的磁纳米颗粒的制备方法包括：

将四氧化三铁纳米颗粒分散在聚阳离子电解质的NaCl溶液中，搅拌反应3h后，离心收集沉淀；

所述沉淀以水分散后，添加EDC和NHS，然后与羧基化的聚乙二醇和靶向核酸适配体混合，搅拌反应24h后，离心收集沉淀，即为本发明提供的磁纳米颗粒。

所述聚阳离子电解质的NaCl溶液中，NaCl的浓度为1mM；聚阳离子电解质的浓度为0.01g/mL。

搅拌反应的温度为室温。本发明所述室温为10℃～30℃。

离心的转速为12000r/min，时间为15min。

所述EDC和NHS的质量比为14:15。EDC和NHS在反应中作为共价偶联剂。

为了方便使用，所述离心和收集沉淀，获得磁纳米颗粒后，以去离子水分散。以Fe元素质量计，分散至每mL去离子水中含有50μg的Fe。

本发明提供的磁纳米颗粒制备方法简单。其具有较大的比面积，因而可以大大提高其负载的靶向核酸适配体的数量，表面的聚乙二醇修饰可以提高磁纳米颗粒在血液中的稳定性，以及降低其对血液成分的毒性。本发明提供的磁纳米颗粒能够从血液中将目的细菌特异性的富集出来，富集的效率较高，准确性良好，从而能够灵敏、快速、准确的对细菌进行定性定量检测。

本发明提供的磁纳米颗粒在制备细菌检测试剂中的应用。

本发明提供的磁纳米颗粒能够富集血液中的细菌，也能够富集其他组织液或匀浆、冲洗液、浸泡液、提取液中的细菌。例如，用于对食品中细菌的检测、对药品中细菌的检测，或对自然界水体中细菌的检测等。

本发明还提供了一种检测细菌的方法，包括：

将待测样品与本发明提供的磁纳米颗粒混合，孵育1h后，收集磁纳米颗粒以PBS缓冲液重悬，经荧光染料染色后，根据显微荧光成像结果获得细菌的种类和数量。

本发明中，所述待测样品为血液、组织液、匀浆、冲洗液、浸泡液或提取液。

所述磁纳米颗粒与样品混合孵育的温度为室温。

所述收集磁纳米颗粒采用磁铁作用于样品进行收集。所述磁铁作用的时间不少于2min。

磁铁作用于样品的时间要大于2分钟，以便完成对血液细菌高效富集。时间太短，很难将血液中的细菌完全富集出来。实验表明，磁铁作用时间为1分钟时，磁纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的富集效率为50％左右；当磁铁作用时间为2分钟时，富集效率提升到了95％左右。

磁纳米颗粒(铁元素浓度为50μg/mL)与样品的体积比要大于1：5，否则会降低磁珠与细菌的识别效率，从而延长二者的孵育时间。本发明中，待测磁纳米颗粒与样品的体积比为1:5～1:2。

所述荧光染料为SYTO 9。荧光染料染色的最终浓度为10nmol/L。荧光染色的时间为20min，温度为室温。

根据显微荧光成像结果获得细菌的种类和数量具体为：根据靶向核酸适配体富集的结果，产生荧光即为存在该适配体所特异识别的细菌。根据成像中出现的荧光个数，对细菌数目进行统计，从而实现对细菌数目的定量。

实验表明，以血液为待测样品，利用本发明所提供的方法可以在1.5小时内对血液样本中痕量的金黄色葡萄球菌(浓度为4CFU/mL左右)做出准确的检测。

本发明还提供了一种病原菌检测试剂盒，包括本发明提供的磁纳米颗粒。

本发明提供的试剂盒用于检测的细菌为血液细菌感染的病原菌。

一些实施例中，所述血液细菌感染的病原菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。

本发明提供的试剂盒中，还包括：荧光染料和PBS缓冲液。

所述荧光染料为SYTO 9。

本发明实施例中，提供了一种检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包括本发明提供的磁纳米颗粒、荧光染料SYTO9和PBS缓冲液，该磁纳米颗粒中，核酸适配体的序列如SEQ IDNO:1所示。具体为：GCTAACCCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCA。

本发明实施例中，还提供了一种检测大肠杆菌的试剂盒，包括本发明提供的磁纳米颗粒、荧光染料SYTO9和PBS缓冲液，该磁纳米颗粒中，核酸适配体的序列如SEQ ID NO:2所示。具体为：ACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAG。

本发明提供了一种磁纳米颗粒，其在包裹有聚阳离子电解质的四氧化三铁纳米颗粒表面，修饰羧基化聚乙二醇和靶向核酸适配体。该磁纳米颗粒比表面积较大，负载核酸适配体的数量较高。而其表面修饰的聚乙二醇能够保护血液成分、提高磁纳米颗粒的稳定性。故而本发明提供的此纳米颗粒能够在避免产生溶血现象的前提下，对样品中的病原菌进行快速、高效富集，再以荧光染料染色后，便能够实现对病原菌准确、灵敏的检测。实验表明，以本发明提供的磁纳米颗粒制成的制剂对血液中病原菌进行检测，最低检测限可达4CFU/mL。

附图说明

图1示实施例2制得的磁纳米颗粒；

图2示实施例2制得磁纳米颗粒的溶血情况，其中+表示水的溶血情况，-表示PBS的溶血情况；

图3示实施例2制得的磁纳米颗粒对金黄色葡萄球菌生长的影响；

图4示实施例1和实施例2的磁纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的富集效率；

图5示实施例2制得的磁纳米颗粒不同时长对金黄色葡萄球菌的富集效率；

图6示实施例7对金黄色葡萄球菌的荧光染色结果；

图7示分离培养法获得的金黄色葡萄球菌菌落数；

图8示实施例8对大肠杆菌的荧光染色结果；

图9示分离培养法获得的大肠杆菌菌落数。

具体实施方式

本发明提供了一种磁纳米颗粒及其制备方法与在病原菌检测中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1四氧化三铁纳米颗粒的制备

称取2.76g氯化铁和9.125g油酸钠，溶解在20mL无水乙醇、15mL去离子水以及35mL正己烷组成的混合溶液中。70℃回流4h后，将得到的褐色溶液转移到分液漏斗中除去水相，并将上层有机相水洗三次，接着旋蒸2h以除去正己烷。然后，称取4.5g上述合成的油酸铁混合物，溶解在12.5g十八烯中，并加入0.76g油酸钠，氮气保护下将该混合液缓慢加热到320℃，回流30min。最后，将得到的黑色溶液冷却至室温，加入25mL异丙醇将纳米粒子沉淀下来，并用正己烷和无水乙醇交替洗三次，最后分散在正己烷中。接下来将合成的Fe₃O₄纳米颗粒转成水溶性的，首先加入等体积的无水乙醇，磁铁分离；接着加入0.2M的四甲基氢氧化铵到沉淀中，振荡5min后加入异丙醇，磁铁分离。最后将磁纳米颗粒用去离子水洗三次，并分散在5mL的去离子水中保存备用。

实施例2磁纳米颗粒的表面核酸适配体功能化(金黄色葡萄球菌)

称取0.1g的PAH(聚丙烯氯化铵，M_w＝15000)，溶解在10mL的NaCl(1mM)溶液中，接着加入1mL实施例1制备的Fe₃O₄纳米颗粒。将该混合液在室温下剧烈搅拌3h后，以12000r/min离心15min，然后用1ml水分散。接着加入共价偶联剂EDC(0.014g)和NHS(0.015g)，搅拌混匀后再向其中加入羧基化的聚乙二醇(20mg)和金黄色葡萄球菌特异性核酸适配体(2.9nmol，序列为：5’-HOOC-GCTAACCCCCCCAGTCCGTCCTCCCAGCCTCACACCGCCA-3’)，将此混合液搅拌反应24小时后，将合成的金黄色葡萄球菌核酸适配体修饰的磁纳米颗粒以12000r/min离心15min，并用水洗三次，最后分散到1mL水中备用。

实施例3磁纳米颗粒的表面核酸适配体功能化(大肠杆菌)

称取0.1g的PAH(聚丙烯氯化铵，M_w＝15000)，溶解在10mL的NaCl(1mM)溶液中，接着加入1mL实施例1中制得的Fe₃O₄纳米颗粒。将该混合液在室温下剧烈搅拌3h后，以12000r/min离心15min，然后用1ml水分散。接着加入共价偶联剂EDC(0.014g)和NHS(0.015g)，搅拌混匀后再向其中加入羧基化的聚乙二醇(20mg)和大肠杆菌特异性核酸适配体(2.9nmol，序列为：5’-HOOC-ACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAG-3’)，将此混合液搅拌反应24小时后，将合成的大肠杆菌核酸适配体修饰的磁纳米颗粒以12000r/min离心15min，并用水洗三次，最后分散到1mL水中备用。

实施例4金黄色葡萄球菌试剂盒

实施例2制备的磁纳米颗粒(铁元素的浓度为50μg/mL)、PBS缓冲液、荧光染料SYTO9。

实施例5大肠杆菌试剂盒

实施例3制备的磁纳米颗粒(铁元素的浓度为50μg/mL)、PBS缓冲液、荧光染料SYTO9。

实施例6磁纳米颗粒性质检测

一、透射电镜观察实施例2～3制得的磁纳米颗粒，如图1所示，磁纳米颗粒形貌规整，尺寸均一性比较好，粒径为15～30nm，且在磁铁的作用下，显示出较强的磁效应。

二、分别选用水和PBS溶液作用阳性和阴性对照对磁纳米颗粒的进行溶血实验。

磁纳米颗粒的溶血率计算公式为：溶血率(％)＝(样品吸收-阴性对照吸收)/(阳性对照吸收-阴性对照吸收)*100％。溶血率超过5％视为溶血。结果表明，在磁纳米颗粒浓度(铁元素浓度)为12.5～100μg/mL的浓度范围内，皆不会发生明显的溶血现象，表明其对血液的生物相容性比较好。而实验验证的浓度范围为富集病原菌的有效范围。对实施例2制得磁纳米颗粒的检测结果如图2，实施例3制得的磁纳米颗粒的检测结果与此相似。

三、将制得的磁纳米颗粒与病原菌共同培养，检测其对菌体生长的影响，实验以实施例1制得的未经修饰的四氧化三铁纳米颗粒作为对照。

结果表明：与对照组相比，在经修饰的磁纳米颗粒存在的情况下细菌的生长没有受到影响，表明该磁纳米颗粒对细菌本身不会造成杀伤，从而保证了细菌数目检测的准确性。图3示实施例2制得的磁纳米颗粒对金黄色葡萄球菌生长的影响。另，实验表明实施例3制得的磁纳米颗粒对大肠杆菌生长也不存在明显影响。

五、以实施例1制得的未经修饰的四氧化三铁纳米颗粒作为对照，检测磁纳米颗粒对病原细菌的富集率。结果表明，在相同浓度下(铁元素浓度50μg/mL)，磁纳米颗粒在经核酸适配体修饰后其对金黄色葡萄球菌的富集效率从13％提升到了95％左右。实施例3制得的磁纳米颗粒对大肠杆菌的富集效率与此相似。

四、将磁纳米颗粒与感染金黄色葡萄球菌的血液进行混合，结果表明，在浓度为50μg/mL(铁元素浓度)及孵育1小时的条件下，磁铁作用时间对实施例2制得的磁纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的富集效率有较大影响，如图5：磁铁作用时间为1分钟时，磁纳米颗粒对金黄色葡萄球菌的富集效率为50％左右；当磁铁作用时间为2分钟时，富集效率提升到了95％左右。

实施例7血液样品检测

(1)细菌感染血液样本中细菌的高效磁富集

从金黄色葡萄球菌脓毒症小鼠的眼球中取血500μL作为待测样本，然后将其与实施例2中制得的磁纳米颗粒(200μL，铁元素浓度为50μg/mL)在室温下孵育1小时，再用磁铁(作用时间2分钟)将结合了磁纳米颗粒的细菌从血液中分离富集出来。

(2)富集细菌的特异性荧光标记

将步骤1中富集的细菌分散到100μL的PBS缓冲液中，然后向其中加入细菌特异性的荧光染料SYTO 9，使染料的最终浓度为10nM，然后经过20分钟孵育后用磁铁(作用时间2分钟)将荧光标记的细菌从溶液中分离出来。

(3)富集细菌的显微荧光成像

将步骤2中分离的荧光标记的细菌分散到50μL的PBS缓冲液中，然后利用荧光显微镜对此荧光标记的细菌进行显微荧光成像，并根据成像结果对细菌的数目进行定量。

图6是某一待测血液样本经磁富集和荧光标记后，利用荧光显微镜观察到的细菌照片，从中我们得出此待测样本中金黄色葡萄球菌的浓度为6CFU/mL。图7是针对同一待测样本，利用传统的血液细菌分离培养法，对1mL血液样品进行培养，从中我们可以确定此待测样本中金黄色葡萄球菌的数目为6个(箭头所示)，即浓度为6CFU/mL。重复对不同样品进行多次实验，本发明提供的方法与传统分离培养法的结果均高度一致，检测限可达4CFU/mL。如表1：

表1本发明与传统分离培养方法测定的金黄色葡萄球菌浓度

	样品1	样品2	样品3	样品4	样品5
						本发明	6CFU/mL	4CFU/mL	10CFU/mL	16CFU/mL	8CFU/mL
分离培养	6CFU/mL	4CFU/mL	8CFU/mL	11CFU/mL	7CFU/mL

表1说明，说明本发明提供的方法可以在1.5小时内对待测血液样本中痕量的金黄色葡萄球菌的有无及数量做出快速准确检测。

另取金黄色葡萄球菌脓毒症小鼠的血液，对样品1进行6次平行检测，结果表明，金黄色葡萄球菌的浓度分别为4CFU/mL、6CFU/mL、6CFU/mL、8CFU/mL、6CFU/mL、6CFU/mL，相对标准偏差(RSD)值为1.265，说明本发明提供的方法具有良好的重复性。

实施例8血液样品检测

(1)细菌感染血液样本中细菌的高效磁富集

从大肠杆菌脓毒症小鼠的眼球中取血500μL作为待测样本，然后将其与实施例3中制得的磁纳米颗粒(200μL，铁元素浓度为50μg/mL)在室温下孵育1小时，再用磁铁将结合了磁纳米颗粒的细菌从血液中分离富集出来。

(2)富集细菌的特异性荧光标记

将步骤1中富集的细菌分散到100μL的PBS缓冲液中，然后向其中加入细菌特异性的荧光染料SYTO 9，使染料的最终浓度为10nM，然后经过20分钟孵育后用磁铁将荧光标记的细菌从溶液中分离出来。

(3)富集细菌的显微荧光成像

将步骤2中分离的荧光标记的细菌分散到50μL的PBS缓冲液中，然后利用荧光显微镜对此荧光标记的细菌进行显微荧光成像，并根据成像结果对细菌的数目进行定量。

图8是某一待测血液样本经磁富集和荧光标记后，利用荧光显微镜观察到的细菌照片，从中我们得出此待测样本中大肠杆菌的浓度为8cfu/mL。图9是针对同一待测样本，利用传统的血液细菌分离培养法，对1mL血液样品进行培养，从中我们可以确定此待测样本中大肠杆菌的数目为8个(箭头所示)，即浓度为8cfu/mL。重复对不同样品进行多次实验，本发明提供的方法与传统分离培养法的结果均高度一致，检测限可达6cfu/mL。如表2：

表2本发明与传统分离培养方法测定的大肠杆菌浓度

	样品1	样品2	样品3	样品4
					本发明	8CFU/mL	6CFU/mL	10CFU/mL	12CFU/mL
分离培养	6CFU/mL	4CFU/mL	8CFU/mL	9CFU/mL

表2说明，说明本发明提供的方法可以在1.5小时内对待测血液样本中痕量的大肠杆菌的有无及数量做出快速准确检测。另取大肠杆菌脓毒症小鼠的血液，对样品1进行6次平行检测，结果表明，金黄色葡萄球菌的浓度分别为8CFU/mL、8CFU/mL、6CFU/mL、8CFU/mL、8CFU/mL、8CFU/mL，相对标准偏差(RSD)值为0.817，说明本发明提供的方法具有良好的重复性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种磁纳米颗粒及其制备方法与在病原菌检测中的应用

<130> MP1718832

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctaaccccc ccagtccgtc ctcccagcct cacaccgcca 40

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acaccataat atgccgtaag gagaggcctg ttgggagcgc cgtagag 47

Claims (10)

1.一种磁纳米颗粒，其特征在于，包括包裹有聚阳离子电解质的四氧化三铁纳米颗粒和修饰在所述纳米颗粒表面的羧基化聚乙二醇和靶向核酸适配体。

2.根据权利要求1所述的磁纳米颗粒，其特征在于，

所述四氧化三铁纳米颗粒的粒径为15nm～30nm；

所述聚阳离子电解质为聚丙烯氯化铵、聚二烯丙基二甲基氯化铵或聚乙烯亚胺；

所述羧基化聚乙二醇的分子量为3000～8000；

所述靶向核酸适配体的5’端连接有-COOH。

3.根据权利要求2所述的磁纳米颗粒，其特征在于，所述聚阳离子电解质的分子量为10000～20000。

4.根据权利要求1所述的磁纳米颗粒，其特征在于，所述四氧化三铁纳米颗粒与所述聚阳离子电解质的质量比为20:1。

5.根据权利要求1～4任一项所述的磁纳米颗粒，其特征在于，所述聚阳离子电解质、羧基化聚乙二醇和靶向核酸适配体的摩尔比为1:25:0.3。

6.权利要求1～5任一项所述的磁纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

将四氧化三铁纳米颗粒分散在聚阳离子电解质的NaCl溶液中，搅拌反应3h后，离心收集沉淀；

所述沉淀以水分散后，添加EDC和NHS，然后与羧基化的聚乙二醇和靶向核酸适配体混合，搅拌反应24h后，离心收集沉淀，即为权利要求1～5任一项所述的磁纳米颗粒。

7.权利要求1～5任一项所述的磁纳米颗粒在制备病原菌检测试剂中的应用。

8.一种检测病原菌的方法，其特征在于，包括：

将待测样品与权利要求1～5任一项所述的磁纳米颗粒混合，孵育1h后，收集磁纳米颗粒以PBS缓冲液重悬，经荧光染料染色后，根据显微荧光成像结果获得细菌的种类和数量；所述待测样品为血液、组织液、匀浆、冲洗液、浸泡液或提取液。

9.一种病原菌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的磁纳米颗粒。

10.根据权利要求9所述的病原菌检测试剂盒，其特征在于，所述病原菌为血液感染的病原菌。