KR20160048830A - 미생물 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

다양한 항균성 물질을 함유하는 한방 엑기스 제제나 생약에 대하여 동일한 시험조건으로, 특정 미생물 시험 및 생균수 시험 모두에 적용 가능하여 범용성이 높고, 피험 시료 중의 항균성 물질의 영향을 유효하게 저감할 수 있어, 대상 미생물을 고정밀도로 검출할 수 있는 미생물 검출 방법이다. 이 방법은 항균 활성을 갖는 피험 시료를 함유하는 시료액을 조제하는 공정 및 대상 미생물을 배양 배지에서 배양하는 공정을 포함하며, 시료액 및/또는 배양 배지에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 항균 활성을 갖는 피험 시료 중의 미생물 검출 방법이다.

Description

미생물 검출 방법{MICROORGANISM DETECTION METHOD}
본 발명은 미생물 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 피험 시료에 포함되는 항균성 물질의 영향을 저감하고, 대상 미생물을 고정밀도로 검출하는 것이 가능한 미생물 검출 방법에 관한 것이다.
식품이나 의약품 등의 분야에서는, 품질이나 안전성을 확보하기 위해, 제품이나 원료의 미생물 검사가 행해지고 있다. 그 시험 방법에 대해서는, 각 분야에서 공정법이 규정되어 있고, 의약품에 대해서는, 일본약국방에 각종 미생물 시험 방법이 게재되어 있다. 이 중, 비무균제제 및 그 원료에 대해서는, 미생물 한도 시험법이 규정되고, 이것에는 생균수를 계측하는 생균수 시험 및 특정 병원성 미생물 등에 관한 특정 미생물 시험이 포함된다. 또한 생약에 대해서는, 일반 시험법 5.02에 생약 시험법에 생약의 미생물 한도 시험법이 규정되어 있다. 그러나, 미생물 한도 시험법을 한방 엑기스 제제 및 그 원료인 생약에 적용한 경우, 이것들에 포함되는 항균성 물질(항진균성 물질을 포함함, 이하 동일)의 영향에 의해, 대상 미생물의 생육이 저해되기 때문에, 대상 미생물이 정확하게 검출되지 않는다고 하는 문제가 있었다.
일반적으로 피험 시료의 항균 활성을 제거하기 위해서는, 항균 활성을 불활화하는 것(저해 물질의 중화)이나 시료액의 희석률을 높이는 것 또는 배지의 증량, 막 여과 등을 생각할 수 있다. 그러나, 한방 엑기스 제제 및 그 원료인 생약 등에는 다양한 항균성 물질이 포함되어 있기 때문에, 특정 불활화제에 의해 이들 항균성 물질을 유효하게 불활화하는 것은 극히 곤란하다. 예를 들면, 항균성 물질의 불활화를 위해, 배지에 레시틴 및 폴리솔베이트를 첨가하는 방법이 알려져 있는데, 파라벤류나 수은 등의 방부제의 불활화에 대해서는 높은 효과가 얻어지지만, 한방 엑기스 제제의 불활화에는 충분한 효과가 얻어지지 않는 경우가 많다. 실제로, 한방약의 원료인 생약에는 저분자에서 고분자까지 다양한 화합물이 포함되어 있고, 또한 그들 화합물의 대부분은 분자 구조에서 특징적인 성분(터페노이드, 알카노이드, 플라보노이드, 퀴논류, 아미노산, 지방산, 당류 등)이며, 다수의 항균성 물질(터페노이드, 알카노이드, 플라보노이드, 탄닌류 등)을 포함하고 있다. 한방 엑기스 제제는 수종의 생약으로 이루어지기 때문에, 광범위하고 다수의 항균성 물질을 포함하고 있다. 또한 한방 엑기스 제제는, 그 제법에 유래하여 많은 불용성 미립자를 포함하고 있어, 항균성 물질 제거를 위해 범용되는 막 여과를 사용할 수 없다. 한편, 희석률을 높이거나 또는 배지를 증량하면 감도가 저하되기 때문에, 우선적으로 선택해야 할 방법이라고는 할 수 없다.
이러한 문제에 대해, 본 출원인은 이미, 배지 중에 활성탄과 산성 백토 또는 활성 백토를 첨가함으로써, 피험 시료 중의 항균성 물질을 제거하는 방법을 제안했다.(특허문헌 1). 이 방법은 특정 미생물 시험에서는 유용하지만, 한천 배지를 사용하는 한천 평판 혼석법에 의한 생균수 시험에서는, 활성탄에 의해 배지가 착색됨과 아울러, 산성 백토 또는 활성 백토에 의해 배지의 투명도가 내려가기 때문에, 집락을 식별하기 어렵다. 또한 그들 물질은 분리 제거가 용이하지 않기 때문에, 집락을 정확하게 식별하여 계측하는 것이 곤란하다고 하는 문제가 있었다.
국제공개 제2008/038625 팸플릿
따라서, 다양한 항균성 물질을 함유하는 한방 엑기스 제제나 생약에 대하여 동일한 시험 조건에서, 특정 미생물 시험 및 생균수 시험 양쪽에 적용 가능하고 범용성이 높고, 피험 시료 중의 항균성 물질의 영향을 유효하게 저감할 수 있으며, 대상 미생물을 고정밀도로 검출할 수 있는 미생물 검출 방법이 요망되고 있고, 본 발명은 그러한 미생물 검출 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행한 결과, (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제는 피험 시료에 포함되는 광범위한 항균성 물질을 흡착 제거할 수 있지만, 미생물의 발육에 필요한 영양 성분에 대해서는 흡착 작용이 약하기 때문에, 대상 미생물의 발육이 저해되지 않고 검출 정밀도를 향상할 수 있는 것, 또한 당해 흡착제를 첨가해도 배지가 착색되지 않고, 작용시킨 후는 용이하게 제거할 수도 있기 때문에, 한천 평판 혼석법 등에 의해서도 정확한 계측이 가능하게 되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
즉 본 발명은 항균 활성을 갖는 피험 시료를 함유하는 시료액을 조제하는 공정 및 대상 미생물을 배양 배지에서 배양하는 공정을 포함하고, 시료액 및/또는 배양 배지에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 항균 활성을 갖는 피험 시료 중의 미생물 검출 방법이다.
본 발명의 미생물 검출 방법은, 피험 시료 중에 포함되는 항균성 물질을 효과적으로 흡착 제거하기 위해, 배양시에 대상 미생물의 발육이 저해되지 않고, 이것을 정확하게 정밀도 좋게 검출하는 것이 가능하다. 또 광범위한 항균성 물질의 영향을 저감할 수 있기 때문에, 검출 대상이 되는 미생물의 범위가 넓고, 또한 다수의 한방 엑기스 제제 또는 생약에 적용할 수 있는 등 적용 대상도 광범위하여, 범용성이 높다. 또한 본 발명에서 사용하는 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제는, 배지 중에 첨가해도 배지가 착색 또는 불투명화되지 않고, 작용시킨 후는 분리 제거가 용이하기 때문에, 한천 평판 혼석법 등에 의해서도 집락을 정확하게 식별할 수 있어, 신속, 정확하게 계측하는 것이 가능하다.
도 1은, 실시예 6에 있어서, 대황감초탕을 피험 시료로 하여, 희석 배율에 대한 Bacillus subtilis(바실러스 서브틸리스)의 첨가 회수율을 도시한 그래프이다.
도 2는, 실시예 6에 있어서, 대승기탕을 피험 시료로 하여, 희석 배율에 대한 Bacillus subtilis(바실러스 서브틸리스)의 첨가 회수율을 도시한 그래프이다.
본 발명 방법은 항균 활성을 갖는 피험 시료 중의 미생물을 검출하는 방법으로, 이 방법에는, 피험 시료를 함유하는 시료액을 조제하는 공정 및 대상 미생물을 배양 배지에서 배양하는 공정이 포함되지만, 시료액 조제 공정에 있어서의 시료액과 배양 공정에 있어서의 배양 배지의 어느 일방 또는 쌍방에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시키는 것을 특징으로 한다.
항균 활성을 갖는 피험 시료(이하, 단지 「피험 시료」라고 하는 경우가 있음)로서는 한방 엑기스 제제, 생약 등을 들 수 있다. 한방 엑기스 제제는 한방 처방을 물, 에탄올 등의 수용성 용매를 사용하여 추출한 엑기스 성분을 제제화한 것으로, 그 제형은 특별히 한정되는 것은 아니며, 분말, 과립제, 정제, 액제, 환제, 캡슐제 등의 어떤 것이어도 좋다. 또한 한방약은 고대 중국에서 저술된 의학서에 기재된 생약의 배합비나 사용의 표준(증상)이 일본에 전해져 독자적으로 발전한 것이며, 한방 처방은 처방에 따라 생약의 종류와 배합 비율이 정해진 것이다. 한방 처방의 구체예로서는 갈근탕, 갈근탕가천궁신이, 을자탕, 안중산, 십미패독탕, 팔미지황환, 대시호탕, 소시호탕, 시호계지탕, 시호계지건강탕, 시호가용골모려탕, 반하사심탕, 황련해독탕, 반하후박탕, 오령산, 계지가출부탕, 소청룡탕, 방기황기탕, 소반하가복령탕, 소풍산, 당귀작약산, 가미소요산, 계지복령환, 계지가용골모려탕, 마황탕, 월비가출탕, 맥문동탕, 진무탕, 오수유탕, 인삼탕, 대황모단피탕, 백호가인삼탕, 사역산, 목방기탕, 반하백출천마탕, 당귀사역가오수유생강탕, 영계출감탕, 저령탕, 보중익기탕, 육군자탕, 계지탕, 칠물강하탕, 조등산, 심전대보탕, 형개연교탕, 윤장탕, 의이인탕, 소경활혈탕, 억간산, 마행감석탕, 오림산, 온청음, 청상방풍탕, 치두창일방, 계지가작약탕, 도핵승기탕, 방풍통성산, 오적산, 자감초탕, 귀비탕, 삼소음, 여신산, 작약감초탕, 복령음, 향소산, 사물탕, 감맥대조탕, 시함탕, 조위승기탕, 사군자탕, 용담사간탕, 궁귀교애탕, 마행의감탕, 평위산, 시호청간탕, 이진탕, 계지인삼탕, 억간산가진피반하, 대황감초탕, 신비탕, 당귀음자, 육미환, 이출탕, 치타박일방, 청폐탕, 죽여온담탕, 자음지보탕, 자음강화탕, 오호탕, 시박탕, 대방풍탕, 황기건중탕, 소건중탕, 대건중탕, 승마갈근탕, 당귀탕, 산조인탕, 신이청폐탕, 통도산, 온경탕, 우차신기환, 인삼양영탕, 소시호탕가길경석고, 입효산, 청심연자음, 저령탕합사물탕, 삼황사심탕, 시령탕, 위령탕, 복령음합반하후박탕, 인진오령산, 영강출감탕, 영감강미신하인탕, 황련탕, 삼물황금탕, 배농산급탕, 당귀건중탕, 천궁다조산, 계지복령환가의이인, 마자인환, 마황부자세신탕, 계비탕, 대승기탕, 계지가작약대황탕, 인진호탕, 청서익기탕, 가미귀비탕, 길경탕 등을 예시할 수 있고, 그들 한방 처방의 생약의 조합이나 배합 비율은 「한방의약품집」(재단법인 일본 의약정보센터 편, 2011년 발행)이나, 「개정 일반용 한방 처방의 안내」(재단법인 일본 공정서 협회 감수, 일본 한방생약제제 협회 편, 2009년 발행) 등에 기재되어 있다.
또한 생약은 동식물의 약용으로 하는 부분, 세포 내용물, 분비물, 추출물 또는 광물을 세정, 껍질 제거, 절단, 건조, 선별 등과 같은 가공을 행한 것이다. 구체예로서는 아교, 아선약, 아니스씨, 위령선, 인진호, 음양곽, 회향, 오약, 연호색, 황기, 황금, 황백, 앵피, 황련, 원지, 개엽, 가자, 하수오, 갈근, 활석, 커치, 카밀레꽃, 괄루근, 괄루인, 건강, 김초, 길경, 기실, 국화, 길초근, 강활, 행인, 금은화, 구기자, 고삼, 형개, 계피, 결명자, 이질풀, 교이, 홍화, 향부자, 갱미, 후박, 우황, 우슬, 오수유, 우방자, 호마, 오미자, 시호, 세신, 산사자, 산치자, 산수유, 산초, 산조인, 산약, 지황, 지골피, 자근, 질려자, 자감초, 작약, 차전자, 차전초, 자충, 십약, 축사, 생강, 송등, 소맥, 창포근, 승마, 신이, 쌀누룩, 석결명, 석고, 천궁, 석남약, 세네가, 전호, 천골, 선퇴, 센나, 창출, 조각자, 상백피, 상근피, 소목, 소엽, 대황, 대조, 택사, 죽여, 죽절인삼, 지모, 다엽, 정자, 조등구, 저령, 진피, 천남성, 천마, 천문동, 등화, 동과자, 당귀, 등피, 도인, 당약, 독활, 두충, 동물담, 인삼, 인동, 패모, 맥아, 맥문동, 파두, 박하, 빈방풍, 반하, 백합, 백지, 백출, 비파엽, 빈랑자, 복령, 부자, 수치부자, 가공부자, 방기, 모근, 망초, 방풍, 박속, 목단피, 홉, 모려, 마황, 마자인, 멜리사잎, 목통, 목방기, 목향, 익지, 익모초, 웅담, 의이인, 라벤더화, 용안육, 용골, 용담, 양강, 연교, 연육, 화강활 등을 예시할 수 있으며, 대황, 감초 및 황련에서 특히 유용하다.
상기 피험 시료를 함유하는 시료액을 조제한다. 피험 시료가 액체인 경우에는, 이것을 그대로 시료액으로 할 수 있다. 피험 시료가 고형물인 경우에는, 필요에 따라, 분쇄, 파쇄, 마쇄 등의 처리를 하고나서 적당한 희석액에 현탁하여 시료액을 조제한다. 희석액으로서는 특별히 한정되지 않지만, 일본 약국방(제16개정 일반시험법 4.05 미생물 한도 시험법 및 5.02 생약의 미생물 한도 시험법 참조, 이하 동일) 게재의 펩톤 식염 완충액, 인산 완충액 등의 완충액이나 액체 배지 등을 적합하게 사용할 수 있다. 액체 배지로서는 소이빈·카세인·다이제스트 배지(이하, SCD 배지로 약칭함), 사부로 액체 배지 등을 들 수 있다. 희석률은 측정의 감도, 정확성 등의 관점에서, 10∼1000배가 바람직하고, 10∼60배가 보다 바람직하고, 10∼30배가 더욱 바람직하고, 특히 10∼20배가 바람직하다.
상기한 바와 같이 조제한 시료액을 배양 배지에 첨가하여 대상 미생물을 배양한다. 희석액으로서 SCD 배지 등의 액체 배지를 사용한 경우에는, 별도 배양 배지에 첨가하지 않고, 이것을 그대로 배양 배지로서 배양할 수 있다. 배양 배지는 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 일본 약국방 게재의 배지를 검출 대상의 미생물의 종류 등에 따라 적당히 선택할 수 있고, 구체적으로는, 소이빈·카세인·다이제스트 한천 배지(이하, SCDA 배지로 약칭함), 레시틴·폴리소르베이트 80 첨가 소이빈·카세인·다이제스트 한천 배지(이하, SCDLPA 배지로 약칭함), 사부로·포도당 한천 배지(이하, SDA 배지로 약칭함), 포테이토·덱스트로스 한천 배지(이하, PDA 배지로 약칭함), 글루코스·펩톤 한천 배지(이하, GPA 배지로 약칭함) 등을 들 수 있다. 배양 조건도 대상 미생물의 종류 등에 따라 적당히 설정되는데, 예를 들면, 일본 약국방의 미생물 한도 시험법에 준하여 설정하면 된다.
본 발명 방법에서는, 상기 시료액 및/또는 배양 배지에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시킨다. 또한, 본 명세서에서, 「(메타)아크릴산」이란 아크릴산 및/또는 메타크릴산을 의미한다. (메타)아크릴산 에스터계 흡착제로서는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 미세구멍의 최빈도 반경(건조시)이 50∼1000Å인 것이 바람직하고, 50∼500Å이 보다 바람직하다. 또한 비표면 면적은 바람직하게는 100∼700, 보다 바람직하게는 130∼570(m2/g)이며, 미세구멍 용량은 바람직하게는 0.4∼1.5, 보다 바람직하게는 0.5∼1.3(ml/g)이다. 이러한 범위이면, 항균성 물질을 선택적으로 흡착하는 작용이 우수하고, 미생물의 발육 저지를 억제하는 효과가 높기 때문에 적합하다. (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제의 시판품으로서 DIAION(등록상표) HP2MG(미츠비시카가쿠 가부시키가이샤제: 미세구멍의 최빈도 반경=240Å, 비표면적=570m2/g, 미세구멍 용량=1.3ml/g), LEWATIT(등록상표) VP OC1600(랑세스 가부시키가이샤제: 미세구멍의 최빈도 반경=75Å, 비표면적=130m2/g, 미세구멍 용량=0.5ml/g), PuroSorb PAD950(퓨롤라이트 가부시키가이샤제: 미세구멍의 최빈도 반경=500∼1000Å, 비표면적=535m2/g, 미세구멍 용량=1.3ml/g), AmberliteTM XADTM7HP(오가노 가부시키가이샤제: 미세구멍의 최빈도 반경=50Å, 비표면적=500m2/g, 미세구멍 용량=0.6ml/g) 등을 들 수 있다.
상기 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 시료액 및/또는 배양 배지에 작용시키는 방법으로서는 특별히 한정되는 것은 아니고, 시료액 및/또는 배양 배지를 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제에 접촉시키면 된다. 예를 들면, 시료액에 작용시키는 경우, 상기한 바와 같이 조제한 시료액 중에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 첨가하면 된다. 구체적으로는, 희석액에 피험 시료와 함께 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 첨가하거나, 미리 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 첨가한 희석액에 피험 시료를 첨가하는 등 하여, 시료액 중에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 함유시키면 된다. 이렇게 하여, 피험 시료를 함유하는 시료액에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시킴으로써, 피험 시료로부터 용출한 항균성 물질이 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제에 흡착 제거된다. 또한 피험 시료 및 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 함유하는 시료액을 소정 시간 교반 혼합함으로써, 보다 효율적으로 항균성 물질을 흡착 제거할 수 있다. 교반 혼합 시간은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 10∼60분 정도 교반 혼합하면 된다. 시료액 중의 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제의 함유량은 3∼20질량%가 바람직하고, 5∼10질량%가 적합하다. 이 범위이면, 양호한 검출 정밀도가 얻어지고, 또한 피펫 핸들링성에도 영향이 없다. 이와 같이 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 시료액에 작용시킨 후, (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 시료액 중에 그대로 잔존시키고 있어도 되지만, 이것을 시료액으로부터 분리 제거할 수도 있다. 분리 제거 방법으로서는 특별히 제한되는 것은 아니고, 체, 여과지 등을 이용한 공지의 고액 분리 수단에 의해 분리하면 된다.
이와 같이, 시료액에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시킴으로써 피험 시료 중의 항균 활성은 충분히 저감되기 때문에, 시료액으로부터 당해 흡착제를 제거하고, 상기 배양 배지에도 당해 흡착제를 첨가하지 않고 배양해도, 대상 미생물은 양호한 발육을 나타내어, 높은 검출 정밀도가 얻어진다. 한편, 본 발명 방법에서는, 또한 배양 배지에도 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시킬 수도 있고, 당해 흡착제를 시료액으로부터 제거하지 않은 경우에는, 이것을 그대로 배양 배지에 첨가하면 되고, 제거한 경우에는, 별도 배양 배지 중에 당해 흡착제를 첨가하면 된다. 이와 같이 배양 배지 중에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제가 포함된 상태에서 배양함으로써, 배양 배지 중의 항균성 물질을 흡착 제거할 수 있다. 배양 배지 중의 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제의 함유량은 3∼20질량%가 바람직하고, 5∼10질량%가 보다 바람직하다. 이 범위이면 높은 검출 정밀도가 얻어진다.
또한 시료액에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시키지 않고, 배양 배지에만 당해 흡착제를 작용시켜도 된다. 당해 흡착제를 작용시키는 방법이나 배양 배지 중의 첨가량은 상기와 동일하다.
본 발명 방법에서는, 생균수 시험의 배양 배지 중에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제가 첨가되어 있어도, 배지는 착색되지 않고 투명성을 유지하고 있기 때문에, 배양 후에 형성된 집락을 정확하게 식별하는 것이 가능하다. 또한, (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 시료액으로부터 분리 제거하고나서 배양 배지에 첨가, 배양하면, 집락의 식별을 보다 정확하게 행할 수 있기 때문에, 예를 들면, 한천 평판 혼석법 등에서도, 집락의 계측을 정확하고, 신속하게 행하는 것이 가능하다.
본 발명에서 사용하는 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제는 광범위한 항균성 물질에 대해 흡착 작용을 나타내고, 또한, 미생물의 증식에 필요한 영양 성분에 대해서는 흡착 작용이 약하기 때문에, 본 발명 방법은 광범위한 피험 시료 및 미생물에 대해 적용할 수 있다. 또한 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제는 배지에 착색 등의 영향을 주지 않고, 분리 제거도 용이하기 때문에, 시험 방법도 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명 방법은, 예를 들면, 일본 약국방 게재의 미생물 한도 시험법에 규정되는 총 호기성 미생물수, 총 진균수 등의 생균수 시험, 담즙산 저항성 그램 음성균, 대장균, 녹농균, 살모넬라, 황색 포도구균, 클로스트리디아, 칸디다·알비칸스 등의 특정 미생물 시험에 적용할 수 있다. 특정 미생물 시험의 경우에는, 상기한 바와 같이, 시료액 및/또는 배양 배지에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시켜 배양한 후, 대상 미생물의 종류에 따라 적당히 사용되는 선택 배지에서 배양함으로써, 검출 감도가 향상된다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예 등에 기초하여 보다 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은 이들 실시예 등에 의해 하등 제한되는 것이 아니다.
참고예 1
균 현탁액의 조제:
제16개정 일본약국방 일반 시험법 4.05 미생물 한도 시험법에 준하여, 미생물시험에 사용하는 접종용 균액을 조제했다.
(시험 균주)
대장균(Escherichia coli, 이하, ECO로 약칭함): IFO No.3972
황색 포도구균(Staphylococcus aureus, 이하, SAU로 약칭함): IFO No.13276
녹농균(Pseudomonas aeruginosa, 이하, PAE로 약칭함): IFO No.13275
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, 이하, BSU로 약칭함): IFO No.3134
칸디다·알비칸스(Candida albicans, 이하, CAL로 약칭함): IFO No.1594
아스페르길루스·브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis, 이하, ABR로 약칭함): NBRC No.9455
클로스트리디아(Clostridium sporogenes, 이하, CSP로 약칭함): NCTC No.12935
(균 현탁액의 조제)
100mL 용량의 삼각 플라스크에 넣은 SCD 배지 50mL에 사면 배지 보존 균주를 1 외제(백금이) 접종하고, ECO, SAU, PAE는 30∼35℃에서, CAL은 20∼25℃에서 배양하여, 균 현탁액으로 했다.
BSU는 배양 균액을 가열 처리하여, 영양 세포를 살멸하고 포자 현탁액을 조제했다.
ABR은 PDA 배지에서 20∼25℃에서 배양하고, 양호한 포자 형성이 확인되면, 얻어진 포자를 긁어내어, 포자액을 조제했다.
(접종용 균액의 조제)
이들 균 현탁액을 펩톤 식염 완충액 등으로 단계 희석하여, 접종용 균액을 조제했다.
실시예 1
흡착제의 검토(1):
시료(대승기탕 엑기스 과립; 가부시키가이샤 츠무라제) 10g을 칭량하여 취하고, 10질량% 흡착제가 첨가된 펩톤 식염 완충액 90mL(200mL 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여, 시료액을 조제했다. 흡착제로서 DIAION(등록상표) HP20(스타이렌계), DIAION(등록상표) HP2MG(메타크릴계), 세파비즈(등록상표) SP700(스타이렌계), 세파비즈(등록상표) SP207(스타이렌계)을 사용했다(모두 미츠비시카가쿠 가부시키가이샤제). 또한 10질량% 흡착제 대신에, 10질량% 스킴 밀크를 사용하여 동일하게 조제한 시료액, 3질량% 활성탄 및 5질량% 활성 백토를 가한 SCD 배지를 준비했다. 각 시료액을 분취하고, 체(스테인리스제)를 통과시키고 10배 희석 시료액으로 했다. 이 10배 희석 시료액을 10mL씩 시험관에 분취했다. 각 시험관에, 참고예 1에서 조제한 SAU의 접종용 균액을 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 2시간 정치 한 뒤에 샤알레에 분주하고, SCDLPA 배지(니혼세야쿠 가부시키가이샤제)에서 혼석했다. 30∼35℃, 5일 이내에 배양 후, 집락 측정을 실시했다. 10배 희석 시료액에 펩톤 식염 완충액을 첨가한 것(블랭크) 및 여과한 10질량% 흡착제 첨가 SCD 배지 10mL에 상기와 동일하게 하여 균액을 첨가한 것(시료 비첨가구)에 대해서도 마찬가지로 집락 측정을 행하고, 하기 식으로부터 회수율을 산출했다. 회수율이 50% 이상이면 적합: ○, 50% 미만이면 부적합: ×로 판정했다.
회수율(%)＝{(A-B)×100}/C
A: 각 시험구의 집락수
B: 블랭크의 집락수
C: 시료 비첨가구의 집락수
Figure pct00001
HP20 또는 HP2MG를 첨가한 경우, 회수율이 50% 이상이 되고, 활성탄 3질량% 및 활성 백토 5질량% 첨가 SCD 배지에서 동등한 항균성 물질 흡착 능력을 나타냈다. 또한 활성탄 3질량% 및 활성 백토 5질량% 첨가 SCD 배지는 배지가 흑색이고 또한 불투명으로 되기 때문에 집락이 식별하기 어렵지만, HP20 또는 HP2MG를 첨가한 배지는 투명하기 때문에, 집락의 식별이 용이하여, 신속하고, 정확하게 집락수를 측정하는 것이 가능했다.
실시예 2
흡착제의 검토(2):
시료(대승기탕 엑기스 과립; 가부시키가이샤 츠무라제) 10g을 칭량하여 취하고, 3, 5, 10질량%가 되도록 흡착제(HP20, HP2MG)를 첨가한 SCD 배지 90mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여, 시료액을 조제했다. 이들 시료액을 분취하고, 체를 통과시켜 10배 희석 시료액으로 했다. 이 10배 희석 시료액을 10mL씩 시험관에 분취했다. 각 시험구에, 참고예 1에 의해 조제한 SAU의 접종용 균액을 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 1시간 정치한 후에 샤알레에 분주하고, SCDA 배지에서 혼석했다. 30∼35℃, 5일 이내에 배양 후, 집락 측정을 실시했다. 실시예 1과 동일하게 하여 회수율을 산출하고, 적합성을 판정했다. 또한 합성 흡착제는 샤알레에의 분주(피펫 조작)에 있어서 핸들링이 곤란하게 되는 경우가 있으므로, 그 난이에 대해 하기 기준에 의해 평가했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
(피펫 핸들링성의 평가 기준)
○: 일반적인 멸균 메스 피펫에서의 액체의 핸들링상 문제 없다.
×: 칭량 분취 곤란, 균일하게 분취할 수 없음, 막히는 등의 문제가 있는 등, 핸들링에 지장이 생긴다.
Figure pct00002
HP2MG는 어느 함유량에서도, 양호한 회수율을 나타냈다. 이에 반해 HP20에서는, 10질량%에서는 양호한 회수율을 나타냈지만, 5질량% 이하에서는 불충분했다. 또한 HP2MG는 10%에서도 핸들링성은 양호했지만, HP20은 3질량%에서도 피펫 조작이 곤란했다.
실시예 3
첨가 회수 시험(1):
항균 활성이 높은 것이 확인되어 있는 한방 엑기스 제제(소청룡탕, 윤장탕, 대황감초탕, 대승기탕; 가부시키가이샤 츠무라제, 모두 엑기스 과립)을 10g 칭량하여 취하고, 5, 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지 90mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여, 시료액을 조제했다. 이 시료액을 분취하고, 체를 통과시켜 10배 희석 시료액으로 했다. 이 10배 희석 시료액을 10mL씩 시험관에 분취했다. 각 시험구에, 참고예 1에서 조제한 BSU 또는 PAE의 접종용 균액을, 각각 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 1시간 정치한 후에 샤알레에 분주하고, SCDA 배지에서 혼석했다. 30∼35℃, 5일 이내에 배양 후, 집락 측정을 실시했다. 실시예 1과 동일하게 하여 회수율을 산출했다. 회수율이 50% 이상이면 적합: ○, 50% 미만이면 부적합: ×로 판정했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
HP2MG 첨가에 의해, 모든 시험 대상 한방 엑기스 제제에 대해, BSU, PAE 모두 양호한 회수율을 나타냈다.
실시예 4
흡착제의 검토(3):
BSU에 대하여 항균 활성을 나타내는 것이 확인되어 있는 윤장탕의 엑기스 분말, 이출탕 및 대승기탕의 한방 엑기스 과립(모두 가부시키가이샤 츠무라제) 및 SAU에 대해 항균 활성을 나타내는 것이 확인된 윤장탕의 엑기스 분말 및 대승기탕의 한방 엑기스 과립(모두 가부시키가이샤 츠무라제)을 생균수 시험의 피험 시료로 했다. 또한 ECO에 대해 항균 활성을 나타내는 것이 확인된 대시호탕, 대황감초탕, 통도산의 한방 엑기스 분말(모두 가부시키가이샤 츠무라제)를 대장균 시험의 피험 시료로 했다. 각 한방 엑기스 제제에 대해, 제16개정 일본약국방 일반 시험법 4.05의 미생물 한도 시험법에 준하여, 생균수 시험 및 대장균 시험을 행했다. 한방 엑기스 과립에 대해서는, 각 시료 10g을 칭량하여 취하고, 표 4에 나타내는 흡착제를 10질량% 첨가한 SCD 배지 90mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 30분간 교반하여, 시료액을 조제했다. 이들 시료액을 분취하고, 체를 통과시켜 10배 희석의 시료액으로 했다. 엑기스 분말에 대해서는, 각 시료 5g을 칭량하여 취하고, 표 4에 나타내는 흡착제를 10질량% 첨가한 SCD 배지 95mL에 가한 이외는 동일하게 하여 20배 희석의 시료액으로 했다.
(생균수 시험)
조제한 시료액에, 참고예 1에서 조제한 BSU 혹은 SAU의 접종용 균액을 접종균수가 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 교반했다. 교반 후의 시료액을 여과하고, 여과액을 샤알레에 분주하고, SCDA 배지에서 혼석했다. 30∼35℃, 5일 이내에 배양하고, BSU 혹은 SAU의 집락 측정을 실시했다. 실시예 1과 동일하게 하여 회수율을 산출했다. 회수율이 50% 이상이면 적합: ○, 50% 미만이면 부적합: ×로 판정했다.
(대장균 시험)
조제한 시료액에, ECO의 접종균수가 50CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 30∼35℃에서 24시간 배양했다. 배양 후, 배양액을 맥콘키 한천 배지에 도말하고, 30∼35℃에서 24시간 배양하여, ECO의 발육을 확인했다. ECO가 발육해 있으면 적합: ＋, 발육해 있지 않으면 부적합: －로 판정했다. 이들 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
(메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제인, PuroSorb PAD950, LEWATIT VPOC1600 및 DIAION HP2MG를 첨가한 SCD 배지를 사용한 경우, BSU, SAU 및 ECO 모두에서 발육이 확인되었다. 이에 반해 스타이렌계나 그 밖의 흡착제에서는 3균종 모두에서 발육을 확인한 것은 없었다.
실시예 5
생균수 시험(한천 평판 혼석법):
하기 표 5에 나타내는 한방 엑기스 과립 128 처방(모두 가부시키가이샤 츠무라제)에 대해, SAU, PAE, BSU, CAL, ABR을 공시균으로 하여 생균수 시험을 행했다. CAL, ABR에 대해서는, 총 호기성 균수(TAMC) 측정 및 총 진균수(TYMC) 측정을 행하고, SAU, PAE, BSU에 대해서는 TAMC 측정을 행했다.
각 시료 10g을 칭량하여 취하고, 10질량%가 되도록 HP2MG를 첨가한 SCD 배지 90mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여, 시료액을 조제했다. 이들 시료액을 분취하고, 체를 통과시켜 10배 희석 시료액으로 했다. 이 10배 희석 시료액을 10mL씩 시험관에 분취했다. 참고예 1에서 조제한 각 접종용 균액을 각각 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 1시간 정치했다.
(TAMC 측정)
접종한 10배 희석 시료액을 교반한 후, 샤알레에 1mL 분주하고, SCDA 배지에서 혼석했다. 배양 조건은 30∼35℃에서 5일 이내에 집락 측정을 실시하고, 실시예 1과 동일하게 하여 회수율을 산출했다. 회수율이 50% 이상이면 적합: ○, 50% 미만이면 부적합: ×로 판정했다.
(TYMC 측정)
접종한 10배 희석 시료액을 교반한 후, 샤알레에 1mL 분주하고, SDA 배지에서 혼석했다. 배양 조건은 20∼25℃에서 5일 이내에 집락 측정을 실시하고, 실시예 1과 동일하게 하여 회수율을 산출했다. 회수율이 50% 이상이면 적합: ○, 50% 미만이면 부적합: ×로 판정했다. 결과를 표 5∼8에 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
한방 엑기스 제제 128 처방, 7 균주의 896 시험구 중, 회수율 50% 미만으로 된 것은 1 시험구뿐으로, 대단히 범용성이 높은 방법인 것을 확인할 수 있었다.
또한, 회수율이 50% 미만으로 된 1 시험구에 대해서도, 다소의 시험법의 개변으로 회수율 50% 이상으로 하는 것이 가능하다.
실시예 6
첨가 회수 시험(2):
희석 배율의 첨가 회수율에 대한 영향을 확인했다. BSU에 대해 항균성이 있는 것이 확인된 한방 엑기스 분말(대황감초탕, 대승기탕; 모두, 가부시키가이샤 츠무라제)을 5g 칭량하여 취하고, SCD 배지 95mL 또는 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지 95mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여 희석 배율 20배 시료액을 얻었다. 마찬가지로, 당해 한방 엑기스 분말을 SCD 배지 또는 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지에 30, 50 및 100배 희석이 되도록 가하고, 교반하여 희석 배율 30, 50,및 100배 시료액을 얻었다. 희석 배율 20, 30, 50, 100배의 각 시험구에, 참고예 1에서 조제한 BSU의 접종용 균액을 접종 균수가 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 1시간 정치했다. 그 후에 HP2MG 첨가 SCDB에서 조제한 시료액은 체를 통과시키고, 각 시료액을 샤알레에 분주하고, SCDA 배지에서 혼석했다. 30∼35℃, 5일 이내에 배양 후, 집락 측정을 행하고, 실시예 1과 동일하게 하여 회수율을 산출했다. 회수율이 50% 이상이면 적합: ○, 50% 미만이면 부적합: ×로 판정했다. 결과를 표 9와 도 1 및 도 2에 나타낸다.
Figure pct00009
HP2MG를 첨가하지 않고 SCD 배지에서 조제한 시료액에서는 50∼100배까지 희석하지 않으면 50% 이상의 BSU를 회수할 수 없었지만, 10% HP2MG 첨가 SCD 배지에서는 20배 희석으로 50% 이상의 회수율이 얻어졌다. 따라서, 대황감초탕 엑기스 및 대승기탕 엑기스의 BSU에 대한 생균수 시험은, 10질량% HP2MG 첨가에 의해, 희석 배율 30배 이하, 바람직하게는, 희석 배율 20배∼30배 희석으로 시험 실시가 가능한 것을 알았다.
(실시예 7)
첨가 회수 시험(3):
BSU에 대해 항균성이 있는 것이 확인된 한방 엑기스 분말 11 처방(반하후박탕, 인삼탕, 반하백출천마탕, 도핵승기탕, 조위승기탕, 평위산, 대황감초탕, 죽여온담탕, 황련탕, 마자인환, 대승기탕; 모두, 가부시키가이샤 츠무라제)을 5g 칭량하여 취하고, SCD 배지 95mL 또는 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지 95mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여, 시료액을 조제했다. 시료액을 분취하고 체를 통과시키고, 각각 20배 희석 시료액으로 했다. 각 시험구에, 참고예 1에서 조제한 BSU의 접종용 균액을 접종균수가 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 1시간 정치한 후에 샤알레에 분주하고, SCDA 배지에서 혼석했다. 30∼35℃, 5일 이내에 배양 후, 집락 측정을 행하고, 실시예 1과 동일하게 하여 회수율을 산출했다. 회수율이 50% 이상이면 적합: ○, 50% 미만이면 부적합: ×로 판정했다. 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure pct00010
SCD 배지에서 조제한 시료액에서는, 어느 쪽의 처방에서도 BSU의 회수율은 50%에 미치지 못했지만, 10% HP2MG 첨가 SCD 배지에서는 모두 50% 이상의 회수율이 얻어졌다. 따라서, 반하후박탕, 인삼탕, 반하백출천마탕, 도핵승기탕, 조위승기탕, 평위산, 죽여온담탕, 황련탕 및 마자인환 엑기스 분말의 BSU에 대한 생균수 시험이, 10질량% HP2MG 첨가에 의해, 희석 배율 20배에서 시험 실시가 가능한 것을 알았다.
실시예 8
특정 미생물 시험(대장균):
(직접 배양법)
대장균에 대해 항균 활성이 있는 것이 확인된 한방 엑기스 분말(을자탕, 대시호탕, 소시호탕, 가미소요산, 윤장탕, 도핵승기탕, 작약감초탕, 대황감초탕, 통도산, 시령탕, 인진호탕; 모두, 가부시키가이샤 츠무라제) 5g을 칭량하여 취하고, SCD 배지 95mL 또는 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지 95mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여, 20배 희석의 시료액을 조제했다. 시료액에 참고예 1에서 조제한 ECO의 접종용 균액을 접종균수가 50CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 30∼35℃에서 24시간 배양했다. 배양 후, 배양액을 맥콘키 한천 배지에 도말하고, 30∼35℃에서 24시간 배양하고, ECO의 발육을 확인했다. ECO가 발육해 있으면 적합: ＋, 발육해 있지 않으면 부적합: －로 판정했다. 결과를 표 11에 나타낸다.
SCD 배지에서의 배양에서는 어느 쪽의 한방 엑기스 분말에 대해서도 ECO의 발육이 확인되지 않았지만, 10% HP2MG 첨가 SCD 배지에서는, 대황감초탕을 제외한 10 처방에 대해 발육이 확인되어, ECO의 검출이 가능한 것을 나타냈다.
(희석법)
직접 배양법(20배 희석)에서 ECO의 발육이 확인되지 않은 대황감초탕 엑기스 분말을 10% HP2MG 첨가 SCD 배지에서 20배 희석의 시료액을 조제했다. 당해 시료액에 ECO의 접종균수가 100CFU/mL 이하가 되도록 첨가한 후, 20배 희석액 20mL를 40mL의 SCD 배지에 분주하여 60배 희석액으로 하고, 30∼35℃에서 24시간 배양했다. 배양 후, 배양액을 맥콘키 한천 배지에 도말하고, 30∼35℃에서 24시간 배양하여, ECO의 발육을 확인했다. ECO가 발육해 있으면 적합: ＋, 발육해 있지 않으면 부적합: －로 판정했다. 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00011
따라서, 을자탕, 대시호탕, 소시호탕, 가미소요산, 윤장탕, 도핵승기탕, 작약감초탕, 통도산, 시령탕 및 인진호탕 엑기스 분말의 ECO에 대한 특정 미생물 시험이, 10질량% HP2MG 첨가에 의해, 희석 배율 20배에서 시험 실시가 가능한 것을 알았다. 또한 직접 배양법(20배 희석)에서 ECO의 발육이 확인되지 않은 대황감초탕 엑기스 분말에 대해서도, SCD 배지에서 60배로 희석함으로써 ECO의 발육이 확인되어, 검출이 가능하게 되는 것이 확인되었다.
실시예 9
특정 미생물 시험(클로스트리디아):
클로스트리디아에 대해 항균 활성이 있는 것이 확인된 한방 엑기스 과립(마황탕, 인진호탕; 모두 가부시키가이샤 츠무라제) 10g을, SCD 배지 90mL 또는 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지 90mL에 가하고 교반하여, 10배 희석의 시료액을 조제했다. 각 시료액 10mL를 90mL의 강화 클로스트리디아 배지에 접종한 뒤에, CSP 균액(시스멕스비오메류사제 BioBall(등록상표) MultiShot 550 Clostridium sporogenes NCTC12935)을 접종균수가 50CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 30∼35℃에서 48시간 혐기적 조건하에 배양했다. 배양 후, 배양액을 콜롬비아 한천 배지에 도말하고, 30∼35℃에서 48시간 혐기적 조건하 배양하여, CSP의 발육을 확인했다. CSP가 발육해 있으면 적합: ＋, 발육해 있지 않으면 부적합: －로 판정했다. 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure pct00012
따라서, 마황탕 및 인진호탕 엑기스 분말의 CSP에 대한 특정 미생물 시험에 있어서, SCD 배지에서 시료액을 조제한 경우에는, CSP의 발육이 확인되지 않았지만, 10% HP2MG 첨가 SCD 배지에서는 검출이 가능하게 되는 것이 확인되어, 시험 실시가 가능한 것을 알았다.
실시예 10
특정 미생물 시험(대장균):
대장균에 대하여 항균 활성이 있는 것이 확인된 생약(대황)을 5g 칭량하여 취하고, SCD 배지 95mL 또는 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지 95mL(200mL 용량 삼각 플라스크에서 조제)에 가하고, 교반하여 희석 배율 20배 시료액을 얻었다. 마찬가지로, 생약(대황)을 SCD 배지 또는 10질량% HP2MG 첨가 SCD 배지에 100 및 200배 희석이 되도록 가하고, 교반하여 희석 배율 100, 200배 시료액을 얻었다. 각 시료액에 참고예 1에서 조제한 ECO의 접종용 균액을 접종균수가 50CFU/mL 이하가 되도록 첨가하고, 30∼35℃에서 24시간 배양했다. 배양 후, 배양액을 맥콘키 한천 배지에 도말하고, 30∼35℃에서 24시간 배양하여, ECO의 발육을 확인했다. ECO가 발육해 있으면 적합: ＋, 발육해 있지 않으면 부적합: －로 판정했다. 결과를 표 13에 나타낸다.
Figure pct00013
SCD 배지에서의 배양에서는, 100배 희석에서 ECO의 발육이 확인되었지만, 20배 희석에서는 발육은 확인되지 않았다. 한편, 10% HP2MG 첨가 SCD 배지에서는 20배 희석에서 ECO의 발육이 확인되었다. 따라서, 대황의 대장균에 대한 특정 미생물 시험에 있어서, 10질량% HP2MG 첨가에 의해, 희석하지 않아도 검출이 가능하게 되는 것이 확인되어, 시험 실시가 가능한 것을 알았다.
본 발명의 미생물 검출 방법은 다양한 항균성 물질의 영향을 저감하여, 피험 시료 중의 미생물을 고정밀도로 검출하는 것이 가능하다. 따라서, 항균 활성을 갖는 한방 엑기스 제제나 생약의 미생물 시험법으로서 극히 유용한 것이다.

Claims (11)

  1. 항균 활성을 갖는 피험 시료를 함유하는 시료액을 조제하는 공정 및 대상 미생물을 배양 배지에서 배양하는 공정을 포함하고, 시료액 및/또는 배양 배지에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 항균 활성을 갖는 피험 시료 중의 미생물 검출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제의 미세구멍의 최빈도(미세구멍) 반경이 50∼1000Å인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    시료액에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    시료액 중에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    시료액 중의 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제의 함유량이 3∼20질량%인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항균 활성을 갖는 피험 시료 및 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 함유하는 시료액을 소정 시간 교반 혼합하는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 시료액에 작용시킨 후, (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 시료액으로부터 분리 제거하는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양 배지에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    배양 배지 중에 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    배양 배지 중의 (메타)아크릴산 에스터계 합성 흡착제의 함유량이 3∼20질량%인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항균 활성을 갖는 피험 시료가 한방 엑기스 제제 또는 생약인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017175999A (ja) * 2016-03-29 2017-10-05 株式会社ツムラ 大建中湯の効果予測方法および投与量決定方法
CN107022597A (zh) * 2017-04-01 2017-08-08 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 抗炎胶囊中微生物限度检查方法
JP2019201557A (ja) * 2018-05-21 2019-11-28 Jnc株式会社 レジオネラ属細菌用培地の製造方法
CN109694899A (zh) * 2019-02-20 2019-04-30 扬州倍加洁日化有限公司 一种含有chg成分的湿巾产品中微生物限度的检测方法
CN111850089A (zh) * 2019-04-28 2020-10-30 成都倍特药业股份有限公司 抑菌性β受体激动剂药物的微生物限度检查方法及组合物
CN112103089B (zh) * 2020-08-17 2022-07-12 上海大学 氮掺杂石墨烯量子点/土元粉基多孔碳复合材料电极、其应用及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008038625A1 (fr) 2006-09-28 2008-04-03 Tsumura & Co. Milieu de culture de cellules microbiennes et procédé de culture de cellules microbiennes
US20090239256A1 (en) * 2005-06-09 2009-09-24 South Australian Water Corporation Detection of Micro-Organisms

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE885951Q (fr) * 1977-12-02 1981-02-16 Baylor College Medicine Resine et procede pour separer des agents antimicrobiens contenus dans les fluides corporels
SE452336B (sv) * 1978-06-16 1987-11-23 Boehringer Mannheim Gmbh Forfarande for pavisning av sjukdomsalstrande mikroorganismer vilka adsorberats extrakorporalt pa en selektivt bindande adsorbent
US5314855A (en) * 1992-11-09 1994-05-24 Akzo N.V. Adsorbent compositions and methods of manufacture
JPH06226092A (ja) * 1993-02-09 1994-08-16 Mitsubishi Kasei Corp 合成吸着剤の回生方法
AU2010290872B2 (en) * 2009-09-02 2015-06-11 Piramal Enterprises Limited Antibiotic compounds
JP2012152116A (ja) * 2011-01-24 2012-08-16 Kracie Seiyaku Kk 生薬の生菌数測定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090239256A1 (en) * 2005-06-09 2009-09-24 South Australian Water Corporation Detection of Micro-Organisms
WO2008038625A1 (fr) 2006-09-28 2008-04-03 Tsumura & Co. Milieu de culture de cellules microbiennes et procédé de culture de cellules microbiennes
US20100062515A1 (en) * 2006-09-28 2010-03-11 Tsumura & Co. Microbial culture medium and microbial culture method

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aquino et al., Adsorption of human immunoglobulin G onto ethacrylate and histidine-linked methacrylate. *
Saikia et al., Revisiting adsorption of biomolecules on polymeric resins. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2008, Vol. 315, Issue 1-3, pp. 196-204 *

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