SE452336B - Forfarande for pavisning av sjukdomsalstrande mikroorganismer vilka adsorberats extrakorporalt pa en selektivt bindande adsorbent - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 40 452 336 Z delarna och-möjliggör att för diagnostiska ändamål isolera sjuk- domsalstrare, vilka vid en okänd tidpunkt intränger i patientens kretslopp, eventuellt åstadkomma befrielse från vidhäftande anti- biotikarester och genomföra en bestämning med minsta möjliga ar- betskostnad.

Denna uppgift löstes enligt uppfinningen genom ett förfarande för påvisning av sjukdomsalstrare, såsom bakterier, svampar och virus, vilka adsorberats ur blod som i närvaro av ett koagulerings- hämmande medel bringats att cirkulera extrakorporalt över ett selek- tivt bindande adsorbens. Förfarandet kännetecknas därav, att det selektivt bindande adsorbenset införes i ett lämpligt näringsmedium resp, odlas i äggkultur, varvid identidifering sker genom i och för sig känd bakteriologisk, mykologisk eller elektronmikroskopisk teknik resp. virologisk teknik.

Den till grund för uppfinningen liggande hemoperfusions- principen användes sedan en längre tid för behandling av svåra intoxikationer, t.ex. sömnmedelsförgiftningar. Det rör sig vid detta förfarande om en avskiljning av läkemedel ur blodet genom adsorption till kol, alltså en rent terapeutisk behandling.

Det var överraskande, att numera ett diagnostiskt medel kan ställas till förfogande, vilket möjliggör påvisning av infekti- ösa partiklar, dvs mikroorganismer såsom bakterier och svampar ävensom virus, utan att medföra signifikativa förändringar hos de naturliga blodbeståndsdelarna, såsom erytrocyter, leukocyter och trombocyter. ' Som adsorptionsmedel lämpar sig biokompatibla, dvs framför allt blodäfördragbara, alltså hemokompatibla, alstraren selek- tivt bindande polymerer, varvid dessa insättas som adsorbens per se, men även kan anbringas på en porös bärare, dvs alla ifrågakommande polymerer kan förutom som skitbildare även an- vändas som "bead-material", försåvitt de är eller kan göras till- räcklig porösa.

Som polymerer kan exempelvis användas polyakrylater eller polymetakrylater, såsom polyhydroxietylmetakrylat ("Poly-HEMA").

Som ytterligare polymerer kan anföras adsorberande hartser såsom "Amberlite XAD II", cellulosaacetat, kollodium och nylon. Som bärare för skiktbildare kan exempelvis användas porösa material som glas, keramiska material, t.ex. lera, metalloxider som alu- míniumoxid, titanoxid, zirkoniumoxid, kiseldioxid eller aktivt koll Därvid har akrylhydrogelbeskiktade vegetabiliska kol 10 15 20 25 30 35 40 3 ' 452 536 ; ("Haemocolé¿EÄ Smith & Nephew, England), visat sig lämpliga. An- delen beskiktningsmedel utgör 0,5-10 %, företrädesvis 2 1 av ad- sorbensets totalvikt. Förfarandet vid beskiktningen är välkänt för fackmannen och erfordrar ingen närmare förklaring.

Vidare användbart är som adsorbens med uppångat kol beskik- z tat, poröst material, såsom glas. Lämpat är även poröst glas, ' § som gjorts biokompatibelt genom koppling med heparin och/eller I albumin, som verkar antitrombogent. För bindning av heparin kan förbindningen t.ex. åstadkommas medelst en vattenlöslig karbodi- imid. Som glas lämpar sig så kallat "Controlled bor glass" (pro- ducent Corníng Glass och Electronucleonics).

Adsorptionsmedlen kan förutom i form av små partiklar eller granuler t.ex. även föreligga i form av plattor eller folier, vilka inlägges i hemoperfusionskammaren och lätt uttagas och in- föras i näríngssubstraten eller näringslösningen.

Bestämningen av sjukdomsalstrarna sker företrädesvis i ad- sorberat tillstånd. Häri ligger en väsentlig fördel, enär adsor- benset med därpå bundna alstrare direkt kan införas i närings- mediet. Härvid kan i och för sig kända mikrobiologiska, virolo- ...p-n.. giska eller elektronmikroskopiska påvisningsmetoder användas. ; Härför användes det med alstrarna anrikade adsorbenset vid fall av bakterier och svampar på följande sätt: Med en steril pincett intryckes i ett lämpligt näringsmedium ca 20-30 adsor- bens-partiklar möjligast skonsamt i näringssubstratets yta. Sam- tidigt kan flytande näringsmedier beskickas med några partiklar.

Odlingen sker vid 37°C. Den slutliga identifieringen sker enligt sedvanliga bakteriologiska och mykologiska rutinmetoder. Vid fall av virus sker odlingen på äggkulturer.

Det är vidare möjligt att tvätta adsorbenset med buffert, att avvattna med alkohol, att behandla med buffrad glutaraldehyd “ och att genomföra en rasterelektronmikroskopisk undersökning.

Förfarandet enligt uppfinningen genomföras lämpligen 1 en an- ordning som innefattar en i vardera änden öppen, ett biokompatibelt, alstrarna selektivt bindande adsorbens (5) innehållande pelare (1), i vilken adsorbenset (5) sammanhålles genom filter (2) med till- slutande lock (3), varvid locken har öppningar med anslutning för blodtillförande och blodbortledande slangledningar (4).

Locken (3) kan exempelvis vara så beskaffade, att de skru- vas på pelaren. I varje fall är de lätt och utan risk för kont- aminering borttagbara för snabb och bekväm tömning av innehållet, 10 15 20 ZS 30 35 40 452 356 4 vilket är“av mycket väsentlig betydelse. Blodavflödet kan vara försett med ett transfusionsbestick (6) med filter (7). Som ma- terial för anordningen är inerta, lätt bearbetbara plaster såsom teflon lämpade.

Den för rent diagnostiska ändamål avsedda anordningen har med fördel små dimensioner. Pelaren har en diameter av ca 1-3 cm och en höjd av ca Z-10 cm. Genom den ringa volymen utlöses inga teoretiskt i och för sig möjliga biverkningar, sásom blodtrycks- fall, trombocytopeni, förlust av immunglobuliner, adsorption av administrerade läkemedel, hemolys.

Den beskrivna anordningen har en ringa volym och är därför kliniskt riskfri, vilket innebär ett väsentligt tekniskt framsteg.

Den är snabb och bekväm att handhava och belastas med relativt låga framställningskostnader; den kan sålunda användas såsom slit- och slängartikel.

I den i figur 1 visade anordningen, kapseln, är alla delar med fördel framställda av polytetrafluoreten och kapseln kan däri- genom steriliseras i autoklav vid 130°C. Kapseln fylles med akryl- hydrogelinkapslat träkol och efter omsurgsfull sköljning med fysio- logisk koksaltlösning steriliseras vid 130°C i autoklav.

Djurförsök För jämförelse av effektiviteten hos en konventionell blod- kultur med en kultur från perfusionskol utfördes närmast följan- de djurförsök. Som försöksdjur användes 250-3OO g vägande Wistar- åh: råttor. En experimentell sepsis åvägabringades genom en intrave- nös (i.v.) injektion av definierade organismtal av Candida albi- cans. Tillgâng_ti1l hemoperfusion åstadkoms genom PVC-slangar i iliakalkärlen. Slangarna anbringades under eternarkos. Den fort- satta undersökningen skedde på vakna djur i restriktionsbur.

Med en flödeshastighet av 1-2 ml/min befordrades råttans blod medelst en valspump från en artär över kolkapseln tillbaka in i en ven. Kapseln innehöll 3 g akrylhydrogelbeskiktat träkol ("Haemocol' , Firma Smith & Nephew, England), pch systemets res- terande blodfyllningsvolym uppgick till 3 ml. Vid försökets bör- jan fylldes systemet med färskt blod från ett donatordjur. Vid början av perfusionen antikoagulerades med 100 IE heparin Och den senare erforderliga hepariniseringen anpassades efter Lee- -white-koagulationstid. 60 min efter i.v.-injektionen av 1 ml av Candida-suspensio- nen uttogs närmast en arteriell blodkultur, och i anslutning 10 15 20 25 30 35 40 452 336 5 därtill-påbörjades perfusionen som bedrevs 1 h. Efter avslutad hemoperfusion tvättades det aktiva kolet under sterila betingel- ser med Ringerlösning. En del av kolpartiklarna användes för kulturförsök och den andra delen efter fixering med glutaralde- hyd, Sörensen-buffert för rasterelektronmikroskopisk undersök- ning.

Mikrobiologisk kulturdiagnostik Den mikrobiologiska såsom bakteriologiska bearbetningen av perfusionskolet från djurförsöken skedde på så sätt, att omedel- bart efter avslutningen av djurförsöket uttogs perfusionskolet under sterila betingelser och upparbetades.

Därvid fördelades med steril pincett per platta ca 20 st kolpartiklar på de fasta näringsmedierna och intrycktes lätt in- under ytan. Som näringssubstrat insattes för originalkulturer Saboraud-maltos-agar och för anrikningarna flytande Saboraud- -näringsmedium. Som kontroll för påvisning av eventuella för- oreningar användes samtidigt blodagarplattor och Mac Conkey-nä- ringssubstrat. Gjutna plattor iordningställdes genom övergjut- ning av ca 20 över en petriskål fördelade kolpartiklar med fly- tande agarmedium.

På 2:a, Uzde och 8:de dagen överympades från flytande an- rikningar (tioglykolat, druvsockerbuljong) material på samma näringssubstrat i fast form, som de vilka insatts för original- kulturerna.

Preparationsteknik för rasterelektronrnilwoskopisk undersökning Kolpartiklarna fixerades efter uttagningen ur patronen 2Uh i 2-3-procentig till pH 7,2 buffrad glutaraldehyd.

Det fixerade materialet tvättades därpå flera gånger i buffertlösning och avvattnades med alkohol med stigande halt.

Från ren alkohol överfördes preparaten i minst Ä steg i "Frigen 11" (alkohol/"Frigen": 2/1, 1/1, 1/2, rent "Frigen") och konser- verades i ett tryckkärl enligt kritisk-punkt-metoden.

Efter anbringning av kolpartiklarna på rasterelektronmikro- skopets provtallrikar anbringades ett elektriskt ledande skikt medelst ett "Sputter"-aggregat. Undersökningen genomfördes med "Stereoscan Mark II A" från firma Cambridge Ltd, England.

Med diagnostisk hemoperfusion eftersträvades i motsats till förut diskuterade tekniker en optimering av undersökningsmate- rialet. Man förblir härvid inkopplad en längre tid i kretsloppet J så att sjukdomsalstraren efter utströmning genom denna "fälla" 10 15 20 25 30 35 40 452 ass 6 måste upptagas av kolkapseln.

De med diagnostisk hemoperfusion genomförda försäæn på råtta utvisar en större känslighet för perfusionsmetoden gentemot liquoidvenylen. Kompletterande experiment med grampositiva och gramnegativa mikroorganismer talar för att denna utsago även gäller för bakterier. Den överlägsna påvisningskänsligheten doku- menterar sig vid en infektionsdos på 105 till 107 mikroorganis- mer per djur genom positiva hemoperfusionskulturer vid övervägan- de negativa liquoidvenyler. Vid liquoidvenylerna erhölls i 2 fall en tillväxt vid en jämförelsevis sen tidpunkt. I ett fall förblev kulturerna från kol och liquoidvenyl negativa.

Det bör framhållas att mikroorganismerna vid hemoperfusions- metoden i regel odlades direkt och icke på omvägen över en fly- tande anrikning. Den bakteriologiska upparbetningen av kolpar- tiklarna för odling är enkel och genomförbar på varje bakterio- logiskt rutinlaboratorium.

Mikroorganismernas bindningsstabilitet till kolytan möjlig- gör en separering av mikroorganismer från vídhäftande antibiotika- rester genom en enkel tvättningsprocedur.

Genomföring av förfarandet på människor En teflonkapsel fylles med 2 % akrylhydrogelbeskiktat aktivt kol (Smith & Nephew, England), steriliseras i autoklav och före- nas i ett extrakorporalt kretslopp med patienten. Anslutningen av kapseln till patienten sker i regel genom unilateral punktion av arteria femoralis och Vena femoralis medelst Seldinger-teknik.

Blodet genomströmmar kapseln uppifrån nedåt. Det är icke nödvän- digt att i systemet ínkoppla en blodpump. Som ytterligare säk- ring mot luft- eller partikelembolier tjänstgör ett kommersiellt perfusionsbeslag i det venösa återflödet. För förhindrande av en trombosering i det extrakorporala kretsloppet injiceras före per- fusionens början 5000 IE heparin i.v.Skall perfusionen pågå läng- re tid än 60 min, är ytterligare heparintillförsel under kontroll av Lee-White-koaguleringstiden erforderlig. Efter önskad konfiakt- tid med strömmande blod från patienten avbrytes åter det extra- korporala kretsloppet. Det aktiva kolet kan genom tvättning med en steril elektrolyslösning befrias från vidhäftande antibiotika- rester, förrän det tillsammans med de jämväl vidhäftande sjuk- domsalstrarna sättes till ett näringsmedium. I detta medium sker _ därpå, såsom ovan beskrivits, identífieringen av mikroorganis- merna och testning av deras känslighet mot olika antibiotika och 10 15 20 25 30 35 40 452 336 7 antimykotika. Genom denna testning erhålles pålitliga data,.vil- ka sannolikt kan bevara patientens liv.

För teknisk genomföring av den diagnostiska hemoperfusionen förefinnes, allt efter patientens kliniska tillstånd, två alter- nativ. Patienter med sepsis utvecklar mycket ofta som sekundär- sjukdom en akut njursvikt. När patienten på grund av njursvikten ovillkorligen måste behandlas med hemodialys, så räcker det att helt enkelt inkoppla kapseln i slangsystemet för dialysen, och närmare bestämt i den arteriella skänkeln, dock först efter blod- pumpen. Allt efter flödet erhålles därigenom automatiskt en kon- takt för kolet med 100-200 ml blod per min.

För patienter med sepsis vilka har friska njurar har ett annat tillvägagångssätt visat sig lämpligt. Kolkapseln befrias först genom perfusion med en heparin-koksaltlösning (1000 IE på 1000 ml) från luftblåsor. Nästa steg är punktion av var för sig en artär och en ven hos patienten med plastkanyler som bör upp- visa en minsta lumen på 1,4 mm. Det förfares enligt Seldinger- -teknik. Därpå förenas den arteriella punktionskanylen med övre änden av kapseln och den venösa kanylen över ett transfusions- bestick med den undre änden. Sedan klämmorna öppnats injiceras _p ännu en gång 5000 IE heparin i systemet för förhindrande av en hå koagulation. Systemets perfusion sker därpå tryckpassivt, dvs utan mellanliggande inkoppling av en pump, genom differensen mellan det arteriella och venösa trycket. Den optimala varaktig- heten av den diagnostiska hemoperfusionen ligger vid ca 60 min.

Det genomsnittliga flödet vid den ovan beskrivna tryckpassiva perfusionen ligger vid 30 ml/min.

Sålunda kan sammanlagt följande fördelar fastställas vid hemoperfusionsmetoden gentemot de konventionella förfarandena.

Hemoperfusionen kännetecknas gentemot den konventionella blodkulturtekniken genom en större påvisningskänslighet. Dess- utom erbjuder hemoperfusionen den fördelen, att kulturresultat och därmed antibíogram från resistenstestningen föreligger ti- digare. Genom en sköljningsprocedur efter hemoperfusionen kan man förhindra, att antibiotikarester medföljer in i kulturen.

En huvudfördel föreligger dock i en länge tids inkoppling i kretsloppet hos patienten. Därmed ökas sannolikheten för att tidpunkten för en mikroorganismutströmning icke försummas.

Vid konventionella blodkulturer är det en nackdel, att de i regel måste upprepas flera gånger. De kärlanslutníngar, som 10 15 20 452 336 erfordras vid hemoperfusionen, är ofta redan tillgängliga genom annan indikation (dialys, hjärtkirurgi, arteriell tryckkontroll, osv.). I denna situation är det tillräckligt att förena kapseln med ovan angivna anslutningar. I synnerhet under en dialysbehand- ling är en inkoppling av kapseln i det arteríella systemet icke förenat med några problem._ De vid terapeutisk hemoperfusion av förgiftningar beskrivna biverkningarna är vid den diagnostiska perfusionen genom den för- minskade volymen på perfusionskapseln försumbart små. Vid Z pa- tienter utvisade kontroll av hemoglobin, erytrocyt-, leukocyt- och trombocyträkning ävensom LDH-aktivitet i serum före och ef- ter diagnostisk perfusion inga signifikativa förändringar.

Sammanfattningsvis erbjuder det nya systemet enligt uppfin- ningen för klinikern en berikning av hans diagnostiska möjlig- heter vid misstanke på septikemi. Patienten utsättes genom diag- nostiken icke för någon fara. Sannolikheten att uppnå ett rätt- visande resultat är större än vid de hittills kända förfarande- na. Dessutom är vid fall av ett positivt kulturutslag såväl mikroorganismidentifieringen som även antibiogrammet att förvän- ta tidigare än hittills. N

Claims (10)

452 336 Patentkrav

1. Förfarande för påvisning av sjukdomsalstrare, såsom bakterier, svampar och virus, vilka adsorberats ur blod som i närvaro av ett koaguleringshämmande medel bríngats att cirkulera extrakorporalt över ett selektivt bindande adsorbens, k ä n - n e t e c k n a t därav, att det selektivt bindande adsorbenset införes i ett lämpligt näringsmedium resp. odlas i äggkultur, varvid identifiering sker genom i och för sig känd bakteriologisk, mykologisk eller elektronmikroskopisk teknik resp. virologisk teknik.

2. Z. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att adsorbenset är en alstrarna selektivt bindande polymer, varvid denna kan anbringas på en porös bärare.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att polymeren är ett polyakrylat eller -metakrylat såsom polyhydroxietylmetakrylat.

4. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att polymeren är ett adsorberande harts såsom "Amberlite XAD II".

5. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att polymeren är cellulosaacetat, kollodium eller nylon.

6. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att den porösa bäraren utgöres av glas, ett keramiskt material, en metalloxid, kiseldioxid eller aktivt kol.

7. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att adsorbenset eventuellt helt eller delvis utgöres av med en polymer enligt något av krav Z-6 beskiktat aktivt kol.

8. Förfarande enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att beskiktningen utgör 0,5-10 procent, företrädesvis 2 procent av adsorbensets totalvikt.

9. Pörfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att adsorbenset är ett med uppångat kol beskiktat poröst material, såsom glas.

10. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att adsorbenset är med heparin och/eller albumín kopplat glas.