JP5975000B2

JP5975000B2 - 微生物検出方法

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Publication number: JP5975000B2
Application number: JP2013179920A
Authority: JP
Inventors: 山本　博章; 博章山本; 勲福田
Original assignee: Tsumura and Co
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Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2016-08-23
Anticipated expiration: 2033-08-30
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Description

本発明は微生物検出方法に関し、より詳細には、被験試料に含まれる抗菌性物質の影響を低減し、対象微生物を高精度に検出することが可能な微生物検出方法に関する。

食品や医薬品等の分野では、品質や安全性を確保するため、製品や原料の微生物検査が行われている。その試験方法については、各分野で公定法が規定されており、医薬品については、日本薬局方に各種の微生物試験方法が収載されている。このうち、非無菌製剤及びその原料については、微生物限度試験法が規定され、これには生菌数を計測する生菌数試験及び特定の病原性微生物等に関する特定微生物試験が含まれる。更に、生薬については、一般試験法５．０２に生薬試験法に生薬の微生物限度試験法が規定されている。しかし、微生物限度試験法を漢方エキス製剤及びその原料である生薬に適用した場合、これらに含まれる抗菌性物質（抗真菌性物質を含む、以下同じ）の影響により、対象微生物の生育が阻害されるため、対象微生物が正確に検出されないという問題があった。

一般に被験試料の抗菌活性を除去するためには、抗菌活性を不活化すること（阻害物質の中和）や試料液の希釈率を上げること又は培地の増量、膜ろ過等が考えられる。しかし、漢方エキス製剤及びその原料である生薬等には多様な抗菌性物質が含まれているため、特定の不活化剤によってこれらの抗菌性物質を有効に不活化することは極めて困難である。例えば、抗菌性物質の不活化のため、培地にレシチン及びポリソルベートを添加する方法が知られているが、パラベン類や水銀等の防腐剤の不活化に対しては高い効果が得られるものの、漢方エキス製剤の不活化には十分な効果が得られないことが多い。実際、漢方薬の原料である生薬には低分子から高分子まで多様な化合物が含まれており、かつそれら化合物の多くは、分子構造から特徴的な成分(テルペノイド、アルカロイド、フラボノイド、キノン類、アミノ酸、脂肪酸、糖類等)であり、多くの抗菌性物質（テルペノイド、アルカロイド、フラボノイド、タンニン類等）を含んでいる。漢方エキス製剤は、数種の生薬からなるため、広範囲で多くの抗菌性物質を含んでいる。更に漢方エキス製剤は、その製法に由来して多くの不溶性微粒子を含んでおり、抗菌性物質除去のために汎用される膜ろ過を使用できない。一方、希釈率を上げる又は培地を増量すると感度が低下するため、優先的に選択すべき方法とはいえない。

このような問題に対し、本出願人は既に、培地中に活性炭と酸性白土または活性白土を添加することによって、被験試料中の抗菌性物質を除去する方法を提案している（特許文献１）。この方法は、特定微生物試験においては有用であるが、カンテン培地を使用するカンテン平板混釈法による生菌数試験においては、活性炭によって培地が着色すると共に、酸性白土又は活性白土により培地の透明度が下がるため、集落を識別することが難しい。更に、それらの物質は分離除去が容易ではないため、集落を正確に識別して計測することが困難であるという問題があった。

国際公開第２００８／０３８６２５パンフレット

したがって、多様な抗菌性物質を含有する漢方エキス製剤や生薬に対し同一の試験条件で、特定微生物試験及び生菌数試験の両方に適用可能で汎用性が高く、被験試料中の抗菌性物質の影響を有効に低減することができ、対象微生物を高精度に検出し得る微生物検出方法が望まれており、本発明はそのような微生物検出方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤は、被験試料に含まれる広範な抗菌性物質を吸着除去することができるが、微生物の発育に必要な栄養成分に対しては吸着作用が弱いため、対象微生物の発育が阻害されず検出精度を向上し得ること、さらに当該吸着剤を添加しても培地が着色することがなく、作用させた後は容易に取り除くこともできるため、カンテン平板混釈法等によっても正確な計測が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、抗菌活性を有する被験試料を含有する試料液を調製する工程及び対象微生物を培養培地で培養する工程を含み、試料液及び／又は培養培地に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させることを特徴とする抗菌活性を有する被験試料中の微生物検出方法である。

本発明の微生物検出方法は、被験試料中に含まれる抗菌性物質を効果的に吸着除去するため、培養時に対象微生物の発育が阻害されることがなく、これを正確に精度よく検出することが可能である。また広範な抗菌性物質の影響を低減することができるため、検出対象となる微生物の範囲が広く、また多くの漢方エキス製剤又は生薬に適用できるなど適用対象も広範で汎用性が高い。さらに本発明で使用する（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤は、培地中に添加しても培地が着色又は不透明化することがなく、作用させた後は分離除去が容易であるため、カンテン平板混釈法等によっても集落を正確に識別することができ、迅速、正確に計測することが可能である。

実施例６において、大黄甘草湯を被験試料とし、希釈倍率に対するBacillus subtilis（バチルス・サブチルス）の添加回収率をプロットしたグラフである。実施例６において、大承気湯を被験試料とし、希釈倍率に対するBacillus subtilis（バチルス・サブチルス）の添加回収率をプロットしたグラフである。

本発明方法は、抗菌活性を有する被験試料中の微生物を検出する方法であり、この方法には、被験試料を含有する試料液を調製する工程及び対象微生物を培養培地で培養する工程が含まれるが、試料液調製工程における試料液と培養工程における培養培地のいずれか一方又は双方に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させることを特徴とする。

抗菌活性を有する被験試料（以下、単に「被験試料」ということがある）としては、漢方エキス製剤、生薬等を挙げることができる。漢方エキス製剤は、漢方処方を水、エタノール等の水溶性溶媒を用いて抽出したエキス成分を製剤化したものであり、その剤形は特に限定されるものではなく、粉末、顆粒剤、錠剤、液剤、丸剤、カプセル剤等のいずれでもよい。また、漢方薬は、古代中国において書かれた医学書に記載された生薬の配合比や使用の目安（症状）が、日本に伝わり独自に発展したものであり、漢方処方は、処方により生薬の種類と配合比率が定められたものである。漢方処方の具体例としては、カッ根湯、カッ根湯加川キュウ辛夷、乙字湯、安中散、十味敗毒湯、八味地黄丸、大柴胡湯、小柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴胡桂枝乾姜湯、柴胡加竜骨牡蛎湯、半夏瀉心湯、黄連解毒湯、半夏厚朴湯、五苓散、桂枝加朮附湯、小青竜湯、防已黄耆湯、小半夏加茯苓湯、消風散、当帰シャク薬散、加味逍遙散、桂枝茯苓丸、桂枝加竜骨牡蛎湯、麻黄湯、越婢加朮湯、麦門冬湯、真武湯、呉茱萸湯、人参湯、大黄牡丹皮湯、白虎加人参湯、四逆散、木防已湯、半夏白朮天麻湯、当帰四逆加呉茱萸生姜湯、苓桂朮甘湯、猪苓湯、補中益気湯、六君子湯、桂枝湯、七物降下湯、釣藤散、十全大補湯、荊芥連翹湯、潤腸湯、ヨク苡仁湯、疎経活血湯、抑肝散、麻杏甘石湯、五淋散、温清飲、清上防風湯、治頭瘡一方、桂枝加シャク薬湯、桃核承気湯、防風通聖散、五積散、炙甘草湯、帰脾湯、参蘇飲、女神散、シャク薬甘草湯、茯苓飲、香蘇散、四物湯、甘麦大棗湯、柴陥湯、調胃承気湯、四君子湯、竜胆瀉肝湯、キュウ帰膠ガイ湯、麻杏ヨク甘湯、平胃散、柴胡清肝湯、二陳湯、桂枝人参湯、抑肝散加陳皮半夏、大黄甘草湯、神秘湯、当帰飲子、六味丸、二朮湯、治打撲一方、清肺湯、竹ジョ温胆湯、滋陰至宝湯、滋陰降火湯、五虎湯、柴朴湯、大防風湯、黄耆建中湯、小建中湯、大建中湯、升麻カッ根湯、当帰湯、酸棗仁湯、辛夷清肺湯、通導散、温経湯、牛車腎気丸、人参養栄湯、小柴胡湯加桔梗石膏、立効散、清心レン子飲、猪苓湯合四物湯、三黄瀉心湯、柴苓湯、胃苓湯、茯苓飲合半夏厚朴湯、茵チン五苓散、苓姜朮甘湯、苓甘姜味辛夏仁湯、黄連湯、三物黄ゴン湯、排膿散及湯、当帰建中湯、川キュウ茶調散、桂枝茯苓丸加ヨク苡仁、麻子仁丸、麻黄附子細辛湯、啓脾湯、大承気湯、桂枝加シャク薬大黄湯、茵チン蒿湯、清暑益気湯、加味帰脾湯、桔梗湯等が例示でき、それら漢方処方の生薬の組合せや配合比率は、「漢方医薬品集」(財団法人日本医薬情報センター編、平成２３年発行)や、「改訂一般用漢方処方の手引き」（財団法人日本公定書協会監修、日本漢方生薬製剤協会編、平成２１年発行）等に記載されている。

また生薬は、動植物の薬用とする部分、細胞内容物、分泌物、抽出物又は鉱物を、洗浄、皮去り、切断、乾燥、選別などのよう加工を行ったものである。具体例としては、阿膠、阿仙薬、アニス実、威霊仙、茵チン蒿、淫羊カク、茴香、烏薬、延胡索、黄耆、黄ゴン、黄柏、桜皮、黄連、遠志、ガイ葉、詞子、何首烏、カッ根、滑石、カッチ、カミツレ、カ楼根、カ楼仁、乾姜、甘草、桔梗、枳実、菊花、吉草根、羌活、杏仁、金銀花、枸杞子、苦参、荊芥、桂皮、決明子、ゲンノショウコ、コウイ、紅花、香附子、粳米、厚朴、牛黄、牛膝、呉茱萸、牛蒡子、胡麻、五味子、柴胡、細辛、山ザ子、山梔子、山茱萸、山椒、酸棗仁、山薬、地黄、地骨皮、紫根、シツリ子、炙甘草、シャク薬、車前子、車前草、シャ虫、十薬、縮砂、生姜、松藤、小麦、菖蒲根、升麻、辛夷、神ギク、石決明、石膏、川キュウ、石南葉、セネガ、前胡、川骨、蝉退、センナ、蒼朮、ソウ角刺、桑白皮、桑根皮、蘇木、蘇葉、大黄、大棗、沢瀉、竹ジョ、竹節人参、知母、茶葉、丁子、釣藤鈎、猪苓、陳皮、天南星、天麻、天門冬、橙花、冬瓜子、当帰、橙皮、桃仁、当薬、独活、杜仲、動物胆、人参、忍冬、貝母、麦芽、麦門冬、巴豆、薄荷、浜防風、半夏、百合、白シ、白朮、枇杷葉、檳榔子、茯苓、附子、修治附子、加工附子、防已、茅根、芒硝、防風、樸ソク、牡丹皮、ホップ、牡蛎、麻黄、麻子仁、メリッサ葉、木通、木防已、木香、益智、益母草、熊胆、ヨク苡仁、ラベンダー花、竜眼肉、竜骨、竜胆、良姜、連翹、レン肉、和羌活等が例示でき、大黄、甘草及び黄連において特に有用である。

上記被験試料を含有する試料液を調製する。被験試料が液体の場合は、これをそのまま試料液とすることができる。被験試料が固形物の場合は、必要に応じ、粉砕、破砕、磨砕等の処理をしてから適当な希釈液に懸濁して試料液を調製する。希釈液としては特に限定されないが、日本薬局方（第１６改正一般試験法４．０５微生物限度試験法及び５．０２生薬の微生物限度試験法参照、以下同じ）収載のペプトン食塩緩衝液、リン酸緩衝液などの緩衝液や液体培地などが好適に用いられる。液体培地としては、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト培地（以下、ＳＣＤ培地と略す）、サブロー液体培地等が挙げられる。希釈率は、測定の感度、正確性等の観点から、１０〜１０００倍が好ましく、１０〜６０倍がより好ましく、１０〜３０倍がさらに好ましく、特に１０〜２０倍が好ましい。

上記のように調製した試料液を培養培地に添加して対象微生物を培養する。希釈液としてＳＣＤ培地などの液体培地を用いた場合には、別途培養培地に添加することなく、これをそのまま培養培地として培養することができる。培養培地は特に制限されるものではなく、例えば、日本薬局方収載の培地を検出対象の微生物の種類等に応じて適宜選択することができ、具体的には、ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地（以下、ＳＣＤＡ培地と略す）、レシチン・ポリソルベート８０加ソイビーン・カゼイン・ダイジェストカンテン培地（以下、ＳＣＤＬＰＡ培地と略す）、サブロー・ブドウ糖カンテン培地（以下、ＳＤＡ培地と略す）、ポテト・デキストロースカンテン培地（以下、ＰＤＡ培地と略す）、グルコース・ペプトンカンテン培地（以下、ＧＰＡ培地と略す）等が挙げられる。培養条件も対象微生物の種類等に応じて適宜設定されるが、例えば、日本薬局方の微生物限度試験法に準じて設定すればよい。

本発明方法においては、上記試料液及び／又は培養培地に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させる。なお、本明細書において、「（メタ）アクリル酸」とは、アクリル酸および／またはメタクリル酸を意味する。（メタ）アクリル酸エステル系吸着剤としては、特に制限されるものではないが、細孔の最頻度半径（乾燥時）が５０〜１０００Åであることが好ましく、５０〜５００Åがより好ましい。また比表面面積は、好ましくは１００〜７００、より好ましくは１３０〜５７０（ｍ^２／ｇ）であり、細孔容量は好ましくは０．４〜１．５、より好ましくは０．５〜１．３（ｍｌ／ｇ）である。このような範囲であると、抗菌性物質を選択的に吸着する作用に優れ、微生物の発育阻止を抑制する効果が高いため好適である。（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤の市販品として、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２ＭＧ(三菱化学株式会社製：細孔の最頻度半径＝２４０Å、比表面積＝５７０ｍ^２／ｇ、細孔容量＝１．３ｍｌ／ｇ)、ＬＥＷＡＴＩＴ（登録商標）ＶＰＯＣ１６００(ランクセス株式会社製：細孔の最頻度半径＝７５Å、比表面積＝１３０ｍ^２／ｇ、細孔容量＝０．５ｍｌ／ｇ)、ＰｕｒｏＳｏｒｂＰＡＤ９５０（ピュロライト株式会社製：細孔の最頻度半径＝５００〜１０００Å、比表面積＝５３５ｍ^２／ｇ、細孔容量＝１．３ｍｌ／ｇ）、アンバーライト^ＴＭＸＡＤ^ＴＭ７ＨＰ（オルガノ株式会社製：細孔の最頻度半径＝５０Å、比表面積＝５００ｍ^２／ｇ、細孔容量＝０．６ｍｌ／ｇ）等を挙げることができる。

上記（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を試料液及び／又は培養培地に作用させる方法としては、特に限定されるものではなく、試料液及び／又は培養培地を（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤に接触させればよい。例えば、試料液に作用させる場合、上記のように調製した試料液中に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を添加すればよい。具体的には、希釈液に被験試料とともに（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を添加するか、予め（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を添加した希釈液に、被験試料を添加するなどして、試料液中に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を含有せしめればよい。このようにして、被験試料を含有する試料液に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させることにより、被験試料から溶出した抗菌性物質が（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤に吸着除去される。また、被験試料及び（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を含有する試料液を所定時間撹拌混合することによって、より効率的に抗菌性物質を吸着除去できる。撹拌混合時間は特に限定されないが、例えば、１０〜６０分程度撹拌混合すればよい。試料液中の（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤の含有量は、３〜２０質量％が好ましく、５〜１０質量％が好適である。この範囲であると、良好な検出精度が得られ、またピペットハンドリング性にも影響がない。このように（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を試料液に作用させた後、（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を試料液中にそのまま残存させていてもよいが、これを試料液から分離除去することもできる。分離除去方法としては特に制限されるものではなく、篩、ろ紙などを利用した公知の固液分離手段によって分離すればよい。

このように試料液に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させることによって、被験試料中の抗菌活性は十分に低減されるため、試料液から当該吸着剤を除去し、上記培養培地にも当該吸着剤を添加することなく培養しても、対象微生物は良好な発育を示し、高い検出精度が得られる。一方、本発明方法では、さらに培養培地にも（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させることもでき、当該吸着剤を試料液から除去しなかった場合には、これをそのまま培養培地に添加すればよく、除去した場合には、別途培養培地中に当該吸着剤を添加すればよい。このように培養培地中に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤が含まれた状態で培養することにより、培養培地中の抗菌性物質を吸着除去することができる。培養培地中の（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤の含有量は、３〜２０質量％が好ましく、５〜１０質量％がより好ましい。この範囲であると高い検出精度が得られる。

また、試料液に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させずに、培養培地にのみ当該吸着剤を作用させてもよい。当該吸着剤を作用させる方法や培養培地中の添加量は上記と同様である。

本発明方法では、生菌数試験の培養培地中に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤が添加されていても、培地は着色されず透明性を維持しているため、培養後に形成された集落を正確に識別することが可能である。さらに、（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を試料液より分離除去してから培養培地に添加、培養すると、集落の識別をより正確に行えるため、例えば、カンテン平板混釈法等においても、集落の計測を正確、迅速に行うことが可能である。

本発明で用いる（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤は広範な抗菌性物質に対して吸着作用を示し、かつ、微生物の増殖に必要な栄養成分に対しては吸着作用が弱いため、本発明方法は、広範な被験試料及び微生物に対して適用することができる。また、（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤は、培地に着色等の影響を与えることなく、分離除去も容易であるため、試験方法も制限されるものではない。したがって、本発明方法は、例えば、日本薬局方収載の微生物限度試験法に規定される総好気性微生物数、総真菌数等の生菌数試験、胆汁酸抵抗性グラム陰性菌、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、クロストリジア、カンジダ・アルビカンス等の特定微生物試験に適用することができる。特定微生物試験の場合は、上記のように、試料液及び／又は培養培地に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させて培養した後、対象微生物の種類に応じて適宜使用される選択培地で培養することにより、検出感度が向上する。

以下、本発明を実施例等に基づいてより詳細に説明する。なお、本発明はこれら実施例等により何ら制限されるものではない。

参考例１
菌懸濁液の調製：
第１６改正日本薬局方一般試験法４．０５微生物限度試験法に準じて、微生物試験に使用する接種用菌液を調製した。
（試験菌株）
大腸菌（Escherichia coli，以下、ＥＣＯと略す）：IFO No.3972
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus，以下、ＳＡＵと略す）:IFO No.13276
緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa，以下、ＰＡＥと略す）：IFO No.13275
バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis，以下、ＢＳＵと略す）：IFO No.3134
カンジダ・アルビカンス（Candida albicans，以下、ＣＡＬと略す）：IFO No.1594
アスペルギルス・ブラジリエンシス（Aspergillus brasiliensis，以下、ＡＢＲと略す）：NBRC No.9455
クロストリジア（Clostridium sporogenes, 以下、ＣＳＰと略す）：NCTC No.12935
（菌懸濁液の調製）
100mL容の三角フラスコに入れたＳＣＤ培地５０ｍＬに斜面培地保存菌株を１エーゼ（白金耳）接種し、ＥＣＯ、ＳＡＵ、ＰＡＥは３０〜３５℃で、ＣＡＬは２０〜２５℃で培養して、菌懸濁液とした。
ＢＳＵは培養菌液を加熱処理し、栄養細胞を殺滅して胞子懸濁液を調製した。
ＡＢＲはＰＤＡ培地で２０〜２５℃で培養し、良好な胞子形成が認められたら、得られた胞子をかき取り、胞子液を調製した。
（接種用菌液の調製）
これらの菌懸濁液をペプトン食塩緩衝液等で段階希釈し、接種用菌液を調製した。

実施例１
吸着剤の検討（１）：
試料（大承気湯エキス顆粒；株式会社ツムラ製）１０ｇを秤取し、１０質量％吸着剤が添加されたペプトン食塩緩衝液９０ｍＬ（２００ｍＬ三角フラスコにて調製）に加え、攪拌し、試料液を調製した。吸着剤として、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２０（スチレン系）、ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ２ＭＧ（メタクリル系）、セパビーズ（登録商標）ＳＰ７００（スチレン系）、セパビーズ（登録商標）ＳＰ２０７（スチレン系）を使用した（いずれも三菱化学株式会社製）。また１０質量％吸着剤に代えて、１０質量％スキムミルクを用いて同様に調製した試料液、３質量％活性炭および５質量％活性白土を加えたＳＣＤ培地を用意した。各試料液を分取し、篩（ステンレス製）を通過させて１０倍希釈試料液とした。この１０倍希釈試料液を１０ｍＬずつ試験管に分取した。各試験管に、参考例１で調製したＳＡＵの接種用菌液を１００ＣＦＵ/ｍＬ以下になるように添加し、２時間静置したのちにシャーレに分注し、ＳＣＤＬＰＡ培地（日本製薬株式会社製）にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内で培養後、集落測定を実施した。１０倍希釈試料液にペプトン食塩緩衝液を添加したもの（ブランク）及びろ過した１０質量％吸着剤加ＳＣＤ培地１０ｍＬに上記と同様にして菌液を添加したもの（試料非添加区）についても同様に集落測定を行い、下記式より回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。

回収率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）×１００｝／Ｃ
Ａ：各試験区の集落数
Ｂ：ブランクの集落数
Ｃ：試料非添加区の集落数

ＨＰ２０又はＨＰ２ＭＧを添加した場合、回収率が５０％以上となり、活性炭３質量％及び活性白土５質量％添加ＳＣＤ培地と同等の抗菌性物質吸着能力を示した。また活性炭３質量％及び活性白土５質量％添加ＳＣＤ培地は、培地が黒色且つ不透明となるため集落が識別し難いが、ＨＰ２０又はＨＰ２ＭＧを添加した培地は透明であるため、集落の識別が容易で、迅速、正確に集落数を測定することが可能であった。

実施例２
吸着剤の検討（２）：
試料（大承気湯エキス顆粒；株式会社ツムラ製）１０ｇを秤取し、３、５、１０質量％となるように吸着剤（ＨＰ２０、ＨＰ２ＭＧ）を添加したＳＣＤ培地９０ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌し、試料液を調製した。これら試料液を分取し、篩を通過させて１０倍希釈試料液とした。この１０倍希釈試料液を１０ｍＬずつ試験管に分取した。各試験区に、参考例１により調製したＳＡＵの接種用菌液を１００ＣＦＵ/ｍＬ以下になるように添加し、１時間静置したのちにシャーレに分注し、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内で培養後、集落測定を実施した。実施例１と同様にして回収率を算出し、適合性を判定した。また合成吸着剤はシャーレへの分注（ピペット操作）においてハンドリングが困難になるケースがあるので、その難易について下記基準により評価した。結果を表２に示す。

（ピペットハンドリング性の評価基準）
○：一般的な滅菌メスピペットでの液体のハンドリング上問題ない。
×：秤取困難、均一に分取出来ない、つまる等の問題があるなど、ハンドリングに支障が出る。

ＨＰ２ＭＧはいずれの含有量でも、良好な回収率を示した。これに対し、ＨＰ２０では、１０質量％では良好な回収率を示したものの、５質量％以下では不十分であった。また、ＨＰ２ＭＧは１０質量％でもハンドリング性は良好であったが、ＨＰ２０は３質量％でもピペット操作が困難であった。

実施例３
添加回収試験（１）：
抗菌活性が高いことが確認されている漢方エキス製剤（小青竜湯、潤腸湯、大黄甘草湯、大承気湯；株式会社ツムラ製、いずれもエキス顆粒）を１０ｇ秤取し、５、１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９０ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌し、試料液を調製した。この試料液を分取し、篩を通過させて１０倍希釈試料液とした。この１０倍希釈試料液を１０ｍＬずつ試験管に分取した。各試験区に、参考例１で調製したＢＳＵ又はＰＡＥの接種用菌液を、それぞれ１００ＣＦＵ/ｍＬ以下になるように添加し、1時間静置したのちにシャーレに分注し、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内で培養後、集落測定を実施した。実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。結果を表３に示す。

ＨＰ２ＭＧ添加により、すべての試験対象漢方エキス製剤について、ＢＳＵ、ＰＡＥとも良好な回収率を示した。

実施例４
吸着剤の検討（３）：
ＢＳＵに対して抗菌活性を示すことが確認されている潤腸湯のエキス粉末、二朮湯および大承気湯の漢方エキス顆粒（いずれも株式会社ツムラ製）およびＳＡＵに対して抗菌活性を示すことが確認されている潤腸湯のエキス粉末および大承気湯の漢方エキス顆粒（いずれも株式会社ツムラ製）を生菌数試験の被験試料とした。また、ＥＣＯに対して抗菌活性を示すことが確認されている大柴胡湯、大黄甘草湯、通導散の漢方エキス粉末（いずれも株式会社ツムラ製）を大腸菌試験の被験試料とした。各漢方エキス製剤について、第１６改正日本薬局方一般試験法４．０５の微生物限度試験法に準じ、生菌数試験及び大腸菌試験を行った。漢方エキス顆粒については、各試料１０ｇを秤取し、表４に示す吸着剤を１０質量％添加したＳＣＤ培地９０ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、３０分間攪拌し、試料液を調製した。これら試料液を分取し、篩を通過させて１０倍希釈の試料液とした。エキス粉末については、各試料５ｇを秤取し、表４に示す吸着剤を１０質量%添加したＳＣＤ培地９５ｍＬに加えた以外は同様にして２０倍希釈の試料液とした。
（生菌数試験）
調製した試料液に、参考例１で調製したＢＳＵもしくはＳＡＵの接種用菌液を接種菌数が１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、攪拌した。攪拌後の試料液をろ過し、ろ液をシャーレに分注して、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内で培養し、ＢＳＵもしくはＳＡＵの集落測定を実施した。実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。
（大腸菌試験）
調製した試料液に、ＥＣＯの接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。これらの結果を表４に示す。

（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤である、ＰｕｒｏＳｏｒｂＰＡＤ９５０、ＬＥＷＡＴＩＴＶＰＯＣ１６００およびダイヤイオンＨＰ２ＭＧを添加したＳＣＤ培地を用いた場合、ＢＳＵ、ＳＡＵ、およびＥＣＯの全てで発育が認められた。これに対し、スチレン系やその他の吸着剤では３菌種全てにおいて発育を認めたものは無かった。

実施例５
生菌数試験（カンテン平板混釈法）：
下記表５に示す漢方エキス顆粒１２８処方（いずれも株式会社ツムラ製）について、ＳＡＵ、ＰＡＥ、ＢＳＵ、ＣＡＬ、ＡＢＲを供試菌として生菌数試験を行った。ＣＡＬ、ＡＢＲについては、総好気性菌数（ＴＡＭＣ）測定及び総真菌数（ＴＹＭＣ）測定を行い、ＳＡＵ、ＰＡＥ、ＢＳＵについてはＴＡＭＣ測定を行った。
各試料１０gを秤取し、１０質量％となるようにＨＰ２ＭＧを添加したＳＣＤ培地９０ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌し、試料液を調製した。これら試料液を分取し、篩を通過させて１０倍希釈試料液とした。この１０倍希釈試料液を１０ｍＬずつ試験管に分取した。参考例１で調製した各接種用菌液を、それぞれ１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、１時間静置した。
（ＴＡＭＣ測定）
接種した１０倍希釈試料液を攪拌した後、シャーレに１ｍＬ分注し、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。培養条件は３０〜３５℃にて５日以内で集落測定を実施し、実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。
（ＴＹＭＣ測定）
接種した１０倍希釈試料液を攪拌した後、シャーレに１ｍＬ分注し、ＳＤＡ培地にて混釈した。培養条件は２０〜２５℃にて５日以内で集落測定を実施し、実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。結果を表５〜８に示す。

漢方エキス製剤１２８処方、７菌株の８９６試験区のうち、回収率５０％未満となったのは１試験区のみであり、非常に汎用性の高い方法であることが確認できた。
なお、回収率が５０％未満となった１試験区についても、多少の試験法の改変で回収率５０％以上にすることが可能である。

実施例６
添加回収試験（２）：
希釈倍率の添加回収率に対する影響を確認した。ＢＳＵに対して抗菌性があることが確認されている漢方エキス粉末（大黄甘草湯、大承気湯；いずれも、株式会社ツムラ製）を５ｇ秤取し、ＳＣＤ培地９５ｍＬまたは１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９５ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌して希釈倍率２０倍試料液を得た。同様に、当該漢方エキス粉末をＳＣＤ培地または１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地に３０、５０、および１００倍希釈になるように加え、攪拌して希釈倍率３０、５０、および１００倍試料液を得た。希釈倍率２０、３０、５０、１００倍の各試験区に、参考例１で調製したＢＳＵの接種用菌液を接種菌数が１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、１時間静置した。その後、ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤＢにて調製した試料液は篩を通過させて、各試料液をシャーレに分注し、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内にて培養後、集落測定を行い、実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。結果を表９と図１及び図２に示す。

ＨＰ２ＭＧを添加せずＳＣＤ培地で調製した試料液では５０〜１００倍まで希釈しないと５０%以上のＢＳＵを回収できなかったが、１０％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地では２０倍希釈で５０％以上の回収率が得られた。従って、大黄甘草湯エキス及び大承気湯エキスのＢＳＵに対する生菌数試験は、１０質量％ＨＰ２ＭＧ添加により、希釈倍率３０倍以下、好ましくは、希釈倍率２０倍〜３０倍希釈で試験実施が可能であることが判った。

実施例７
添加回収試験（３）：
ＢＳＵに対して抗菌性があることが確認されている漢方エキス粉末１１処方（半夏厚朴湯、人参湯、半夏白朮天麻湯、桃核承気湯、調胃承気湯、平胃散、大黄甘草湯、竹ジョ温胆湯、黄連湯、麻子仁丸、大承気湯；いずれも、株式会社ツムラ製）を５ｇ秤取し、ＳＣＤ培地９５ｍＬ又は１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９５ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌し、試料液を調製した。試料液を分取し篩を通過させて、それぞれ２０倍希釈試料液とした。各試験区に、参考例１で調製したＢＳＵの接種用菌液を接種菌数が１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、１時間静置したのちにシャーレに分注し、ＳＣＤＡ培地にて混釈した。３０〜３５℃、５日以内にて培養後、集落測定を行い、実施例１と同様にして回収率を算出した。回収率が５０％以上であれば適合：○、５０％未満であれば不適合：×と判定した。結果を表１０に示す。

ＳＣＤ培地で調製した試料液では、いずれの処方においてもＢＳＵの回収率は５０％に満たなかったが、１０％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地では全て５０％以上の回収率が得られた。従って、半夏厚朴湯、人参湯、半夏白朮天麻湯、桃核承気湯、調胃承気湯、平胃散、竹ジョ温胆湯、黄連湯及び麻子仁丸エキス粉末のＢＳＵに対する生菌数試験が、１０質量％ＨＰ２ＭＧ添加により、希釈倍率２０倍で試験実施が可能であることが判った。

実施例８
特定微生物試験（大腸菌）：
（直接培養法）
大腸菌に対して抗菌活性があることが確認されている漢方エキス粉末（乙字湯、大柴胡湯、小柴胡湯、加味逍遙散、潤腸湯、桃核承気湯、シャク薬甘草湯、大黄甘草湯、通導散、柴苓湯、茵チン蒿湯；いずれも、株式会社ツムラ製）５ｇを秤取し、ＳＣＤ培地９５ｍＬ又は１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９５ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌し、２０倍希釈の試料液を調製した。試料液に参考例１で調製したＥＣＯの接種用菌液を接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１１に示す。

ＳＣＤ培地での培養ではいずれの漢方エキス粉末についてもＥＣＯの発育が認められなかったが、１０％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地では、大黄甘草湯を除く１０処方について発育が認められ、ＥＣＯの検出が可能であることが示された。

（希釈法）
直接培養法（２０倍希釈）でＥＣＯの発育が認められなかった大黄甘草湯エキス粉末を１０％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地にて２０倍希釈の試料液を調製した。当該試料液にＥＣＯの接種菌数が１００ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加した後、２０倍希釈液２０ｍＬを４０ｍＬのＳＣＤ培地に分注して６０倍希釈液とし、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１１に示す。

従って、乙字湯、大柴胡湯、小柴胡湯、加味逍遙散、潤腸湯、桃核承気湯、シャク薬甘草湯、通導散、柴苓湯及び茵チン蒿湯エキス粉末のＥＣＯに対する特定微生物試験が、１０質量％ＨＰ２ＭＧ添加により、希釈倍率２０倍で試験実施が可能であることが判った。また、直接培養法（２０倍希釈）でＥＣＯの発育が認められなかった大黄甘草湯エキス粉末についても、ＳＣＤ培地で６０倍に希釈することでＥＣＯの発育が認められ、検出が可能となることが確認された。

実施例９
特定微生物試験（クロストリジア）：
クロストリジアに対して抗菌活性があることが確認されている漢方エキス顆粒（麻黄湯、茵チン蒿湯；いずれも、株式会社ツムラ製）１０ｇを、ＳＣＤ培地９０ｍＬ又は１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９０ｍＬに加えて攪拌し、１０倍希釈の試料液を調製した。各試料液１０ｍLを９０ｍLの強化クロストリジア培地に接種したのちに、ＣＳＰ菌液（シスメックスビオメリュー社製ＢｉｏＢａｌｌ（登録商標）ＭｕｌｔｉＳｈｏｔ５５０ Clostridium sporogenes NCTC12935）を接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で４８時間嫌気的条件下培養した。培養後、培養液をコロンビアカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で４８時間嫌気的条件下培養し、ＣＳＰの発育を確認した。ＣＳＰが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１２に示す。

従って、麻黄湯及び茵チン蒿湯エキス粉末のＣＳＰに対する特定微生物試験において、ＳＣＤ培地で試料液を調製した場合は、ＣＳＰの発育が認められなかったが、１０％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地では検出が可能となることが確認され、試験実施が可能であることが判った。

実施例１０
特定微生物試験（大腸菌）：
大腸菌に対して抗菌活性があることが確認されている生薬（大黄）を５ｇ秤取し、ＳＣＤ培地９５ｍＬ又は１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地９５ｍＬ（２００ｍＬ容三角フラスコにて調製）に加え、攪拌して希釈倍率２０倍試料液を得た。同様に、生薬（大黄）をＳＣＤ培地または１０質量％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地に１００および２００倍希釈になるように加え、攪拌して希釈倍率１００、２００倍試料液を得た。各試料液に参考例１で調製したＥＣＯの接種用菌液を接種菌数が５０ＣＦＵ／ｍＬ以下になるように添加し、３０〜３５℃で２４時間培養した。培養後、培養液をマッコンキーカンテン培地に塗抹し、３０〜３５℃で２４時間培養し、ＥＣＯの発育を確認した。ＥＣＯが発育していれば適合：＋、発育していなければ不適合：−と判定した。結果を表１３に示す。

ＳＣＤ培地での培養では、１００倍希釈でＥＣＯの発育が認められたものの２０倍希釈では発育は認められなかった。一方、１０％ＨＰ２ＭＧ加ＳＣＤ培地では２０倍希釈でＥＣＯの発育が認められた。従って、大黄の大腸菌に対する特定微生物試験において、１０質量％ＨＰ２ＭＧ添加により、希釈しなくても検出が可能となることが確認され、試験実施が可能であることが判った。

本発明の微生物検出方法は、多様な抗菌性物質の影響を低減して、被験試料中の微生物を高精度で検出することが可能である。したがって、抗菌活性を有する漢方エキス製剤や生薬の微生物試験法として極めて有用なものである。

Claims

抗菌活性を有する被験試料を含有する試料液を調製する工程及び対象微生物を培養培地で培養する工程を含み、試料液及び／又は培養培地に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させることを特徴とする抗菌活性を有する被験試料中の微生物検出方法。
（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤の細孔の最頻度(細孔)半径が５０〜１０００Åである請求項１記載の微生物検出方法。
試料液に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させるものである請求項１又は２に記載の微生物検出方法。
試料液中に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を添加するものである請求項３記載の微生物検出方法。
試料液中の（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤の含有量が３〜２０質量％である請求項３又は４記載の微生物検出方法。
抗菌活性を有する被験試料及び（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を含有する試料液を所定時間撹拌混合するものである請求項３〜５のいずれかの項記載の微生物検出方法。
（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を試料液に作用させた後、（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を試料液から分離除去するものである請求項１〜６のいずれかの項記載の微生物検出方法。
培養培地に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を作用させるものである請求項１〜７のいずれかの項記載の微生物検出方法。
培養培地中に（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤を添加するものである請求項８記載の微生物検出方法。
培養培地中の（メタ）アクリル酸エステル系合成吸着剤の含有量が３〜２０質量％である請求項８又は９記載の微生物検出方法。
抗菌活性を有する被験試料が漢方エキス製剤又は生薬である請求項１〜１０のいずれかの項記載の微生物検出方法。