CN105324490A - 微生物检测方法 - Google Patents

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Abstract

提供对含有多种抗菌性物质的中药提取物制剂、生药，在同一试验条件下可适用于特定微生物试验和活菌数试验这两者而通用性高、能够有效地降低被测试样中的抗菌性物质的影响、可高精度地检测对象微生物的微生物检测方法。一种具有抗菌活性的被测试样中的微生物检测方法，其特征在于，包括：制备含有具有抗菌活性的被测试样的试样液的工序和用培养基培养对象微生物的工序，在所述微生物检测方法中，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液和/或培养基。

Description

微生物检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测方法，更详细而言，涉及可降低被测试样中所含的抗菌性物质的影响、高精度地检测对象微生物的微生物检测方法。
背景技术
在食品、医药品等领域中，为了确保质量、安全性，进行产品、原料的微生物检查。对于其试验方法，各领域中规定了官方方法，对于医药品，日本药典中收载了各种微生物试验方法。其中，对于非无菌制剂及其原料，规定了微生物限度试验法，其中包括测量活菌数的活菌数试验和与特定的病原性微生物等相关的特定微生物试验。进而，对于生药，一般试验法5.02中的生药试验法中规定了生药的微生物限度试验法。但是，在将微生物限度试验法应用到中药提取物制剂及作为其原料的生药的情况下，因它们中所含的抗菌性物质(包含抗真菌性物质，以下同样)的影响而对象微生物的生长繁殖受到抑制，因此存在无法准确地检测对象微生物的问题。
为了除去被测试样的抗菌活性，通常想到的是将抗菌活性灭活(抑制物质的中和)、提高试样液的稀释率或者增加培养基的量、膜过滤等。但是，由于中药提取物制剂及作为其原料的生药等中含有多种抗菌性物质，因此利用特定的灭活剂将所述抗菌性物质有效地灭活是极其困难的。例如，已知有为了灭活抗菌性物质而在培养基中添加卵磷脂和聚山梨醇酯的方法，然而虽然相对于对羟基苯甲酸酯类、汞等防腐剂的灭活可获得高的效果，但对于中药提取物制剂的灭活，大多无法获得充分的效果。实际上，在作为中药原料的生药中含有从低分子到高分子的多种化合物，并且，这些化合物大多从分子结构方面看是特征性的成分(萜类化合物、生物碱、黄酮类化合物、醌类、氨基酸、脂肪酸、糖类等)，且含有许多抗菌性物质(萜类化合物、生物碱、黄酮类化合物、鞣酸类等)。由于中药提取物制剂包含多种生药，因此含有广范围的很多抗菌性物质。进而，中药提取物制剂由于其制法而含有许多不溶性微粒，无法使用用于除去抗菌性物质的通用的膜过滤。另一方面，若提高稀释率或增加培养基的量，则灵敏度降低，因此不能说是应当优先选择的方法。
针对这样的问题，本申请人已经提出了通过在培养基中添加活性炭和酸性白土或活性白土来除去被测试样中的抗菌性物质的方法(专利文献1)。该方法虽然在特定微生物试验中有用，但在利用使用琼脂培养基的琼脂平板混释法(plate-countmethod)的活菌数试验中，培养基因活性炭而着色，并且培养基的透明度因酸性白土或活性白土而下降，因此难以识别菌落。进而，由于不易将这些物质分离除去，因此存在难以准确地识别菌落而进行测量的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/038625小册子
发明内容
发明要解决的问题
因此，期望开发出一种对含有多种抗菌性物质的中药提取物制剂、生药，在同一试验条件下可适用于特定微生物试验和活菌数试验这两者而通用性高、能够有效地降低被测试样中的抗菌性物质的影响、可高精度地检测对象微生物的微生物检测方法，本发明的课题是提供这样的微生物检测方法。
用于解决问题的方案
本发明人等为解决上述课题而认真研究，结果发现：(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂能够将被测试样中所含的各种抗菌性物质吸附除去，由于对微生物发育所需的营养成分的吸附作用弱，因此可在不抑制对象微生物的发育的情况下提高检测精度，进而即使添加该吸附剂，培养基也不着色，吸附剂在作用之后也能够容易地被清除，因此利用琼脂平板混释法等也能进行准确的测量，从而完成了本发明。
即，本发明为具有抗菌活性的被测试样中的微生物检测方法，其特征在于，包括：制备含有具有抗菌活性的被测试样的试样液的工序和用培养基培养对象微生物的工序，在所述微生物检测方法中，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液和/或培养基。
发明的效果
本发明的微生物检测方法由于有效地将被测试样中所含的抗菌性物质吸附除去，因此可在培养时不抑制对象微生物的发育的情况下准确而精度良好地检测对象微生物。另外，由于能够降低各种抗菌性物质的影响，因此作为检测对象的微生物的范围广，而且可适用于很多中药提取物制剂或生药等，适用对象广泛、通用性高。进而，即使在培养基中添加本发明所使用的(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂，培养基也不着色或不透明化，吸附剂在作用之后也能够容易地被分离除去，因此利用琼脂平板混释法等也能够准确地识别菌落，可迅速、准确地测量。
附图说明
图1是在实施例6中，以大黄甘草汤为被测试样，将枯草杆菌(Bacillu ssubtilis)的添加回收率对稀释倍数作图而成的图表。
图2是在实施例6中，以大承气汤为被测试样，将枯草杆菌的添加回收率对稀释倍数作图而成的图表。
具体实施方式
本发明方法是用于检测具有抗菌活性的被测试样中的微生物的方法，其特征在于，该方法包括制备含有被测试样的试样液的工序和用培养基培养对象微生物的工序，在所述方法中，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液制备工序中的试样液和培养工序中的培养基中的任意一者或两者。
作为具有抗菌活性的被测试样(以下，有时简称为“被测试样”)，可以举出中药提取物制剂、生药等。中药提取物制剂是对用水、乙醇等水溶性溶剂提取中药处方而成的提取物成分进行制剂化而成的制剂，对其剂型没有特别限定，为粉末、颗粒剂、片剂、液体制剂、丸剂、胶囊剂等均可。另外，中药是古代中国所著的医学书中所记载的生药的配混比、使用的标准(症状)传到日本并独自地发展而成的，中药处方是根据处方来决定生药的种类和配混比例。作为中药处方的具体例，可以例示葛根汤、葛根汤加川芎辛夷、乙字汤、安中散、十味败毒汤、八味地黄丸、大柴胡汤、小柴胡汤、柴胡桂枝汤、柴胡桂枝干姜汤、柴胡加龙骨牡蛎汤、半夏泻心汤、黄连解毒汤、半夏厚朴汤、五苓散、桂枝加术附汤、小青龙汤、防已黄芪汤、小半夏加茯苓汤、消风散、当归芍药散、加味逍遥散、桂枝茯苓丸、桂枝加龙骨牡蛎汤、麻黄汤、越婢加术汤、麦门冬汤、真武汤、吴茱萸汤、人参汤、大黄牡丹皮汤、白虎加人参汤、四逆散、木防已汤、半夏白术天麻汤、当归四逆加吴茱萸生姜汤、苓桂术甘汤、猪苓汤、补中益气汤、六君子汤、桂枝汤、七物降下汤、钓藤散、十全大补汤、荆芥连翘汤、润肠汤、薏苡仁汤、疏经活血汤、抑肝散、麻杏甘石汤、五淋散、温清饮、清上防风汤、治头疮一方、桂枝加芍药汤、桃核承气汤、防风通圣散、五积散、炙甘草汤、归脾汤、参苏饮、女神散、芍药甘草汤、茯苓饮、香苏散、四物汤、甘麦大枣汤、柴陷汤、调胃承气汤、四君子汤、龙胆泻肝汤、芎归胶艾汤、麻杏薏甘汤、平胃散、柴胡清肝汤、二陈汤、桂枝人参汤、抑肝散加陈皮半夏、大黄甘草汤、神秘汤、当归饮子、六味丸、二术汤、治打扑一方、清肺汤、竹茹温胆汤、滋阴至宝汤、滋阴降火汤、五虎汤、柴朴汤、大防风汤、黄芪建中汤、小建中汤、大建中汤、升麻葛根汤、当归汤、酸枣仁汤、辛夷清肺汤、通导散、温经汤、牛车肾气丸、人参养荣汤、小柴胡汤加桔梗石膏、立效散、清心莲子饮、猪苓汤合四物汤、三黄泻心汤、柴苓汤、胃苓汤、茯苓饮合半夏厚朴汤、茵陈五苓散、苓姜术甘汤、苓甘姜味辛夏仁汤、黄连汤、三物黄芩汤、排脓散及汤、当归建中汤、川芎茶调散、桂枝茯苓丸加薏苡仁、麻子仁丸、麻黄附子细辛汤、启脾汤、大承气汤、桂枝加芍药大黄汤、茵陈蒿汤、清暑益气汤、加味归脾汤、桔梗汤等，这些中药处方的生药的组合、配混比率被记载于“漢方医薬品集”(財団法人日本医薬情報センター编，平成23年出版)、“改訂一般用漢方処方の手引き”(財団法人日本公定書協会监修，日本漢方生薬製剤協会编，平成21年出版)等。
另外，生药是对动植物的药用部分、细胞内容物、分泌物、提取物或矿物进行清洗、去皮、切断、干燥、筛选等加工后而得到的物质。作为具体例，可以例示阿胶、棕儿茶、大茴香籽、威灵仙、茵陈蒿、淫羊藿、茴香、乌药、延胡索、黄芪、黄芩、黄柏、樱皮、黄连、远志、艾叶、诃子、何首乌、葛根、滑石、儿茶、洋甘菊、瓜蒌根、瓜蒌仁、干姜、甘草、桔梗、枳实、菊花、缬草根、羌活、杏仁、金银花、枸杞子、苦参、荆芥、桂皮、决明子、老鹤草、胶饴、红花、香附子、粳米、厚朴、牛黄、牛膝、吴茱萸、牛蒡子、胡麻、五味子、柴胡、细辛、山楂、山栀子、山茱萸、山椒、酸枣仁、山药、地黄、地骨皮、紫根、蒺藜子、炙甘草、芍药、车前子、车前草、庶虫、十药、缩砂、生姜、松藤、小麦、菖蒲根、升麻、辛夷、神曲、石决明、石膏、川芎、石楠叶、美远志、前胡、川骨(nupharrhizome)、蝉蜕、番泻叶、苍术、皂角刺、桑白皮、桑根皮、苏木、苏叶、大黄、大枣、泽泻、竹茹、竹节人参、知母、茶叶、丁香、钓藤钩、猪苓、陈皮、天南星、天麻、天门冬、橙花、冬瓜子、当归、橙皮、桃仁、当药、独活、杜仲、动物胆、人参、忍冬、贝母、麦芽、麦门冬、巴豆、薄荷、北沙参、半夏、百合、白芷、白术、枇杷叶、槟榔、茯苓、附子、制附子(SpecificProcessedAconiteRoot)、加工附子(PowderedProcessedAconiteRoot)、防已、茅根、芒硝、防风、朴樕、牡丹皮、蛇麻草、牡蛎、麻黄、麻子仁、蜜蜂花叶、木通、木防已、木香、益智、益母草、熊胆、薏苡仁、薰衣草花、龙眼肉、龙骨、龙胆、良姜、连翘、莲子和羌活等，大黄、甘草和黄连特别有用。
制备含有上述被测试样的试样液。在被测试样为液体的情况下，可以将其直接作为试样液。在被测试样为固态物质的情况下，根据需要，进行粉碎、破碎、磨碎等处理后，悬浮于适当的稀释液中，制备试样液。作为稀释液，没有特别限定，可以适宜使用日本药典(参照第16版修订一般试验法4.05微生物限度试验法和5.02生药的微生物限度试验法，以下相同)收载的蛋白胨食盐缓冲液、磷酸缓冲液等缓冲液、液体培养基等。作为液体培养基，可以举出大豆·酪蛋白·消化培养基(以下，简称为SCD培养基)、沙氏液体培养基等。从测定的灵敏度、准确性等观点出发，稀释率优选为10～1000倍，更优选为10～60倍，进一步优选为10～30倍，特别优选为10～20倍。
在培养基中添加如上操作制得的试样液，培养对象微生物。在使用SCD培养基等液体培养基作为稀释液的情况下，可以不另外添加到培养基中而直接将其作为培养基来进行培养。对培养基没有特别限制，例如，可根据检测对象的微生物的种类等适宜地选择日本药典收载的培养基，具体而言，可以举出大豆·酪蛋白·消化琼脂培养基(以下，简称为SCDA培养基)、卵磷脂·聚山梨醇酯80加大豆·酪蛋白·消化琼脂培养基(以下，简称为SCDLPA培养基)、沙氏·葡萄糖琼脂培养基(以下，简称为SDA培养基)、马铃薯·葡萄糖琼脂培养基(以下，简称为PDA培养基)、葡萄糖·蛋白胨琼脂培养基(以下，简称为GPA培养基)等。也可以根据对象微生物的种类等适宜地设定培养条件，例如，根据日本药典的微生物限度试验法进行设定即可。
本发明方法中，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于上述试样液和/或培养基。需要说明的是，本说明书中，“(甲基)丙烯酸”是指丙烯酸和/或甲基丙烯酸。作为(甲基)丙烯酸酯系吸附剂，没有特别的限制，但细孔的众数半径(干燥时)优选为更优选另外，比表面积优选为100～700，更优选为130～570(m2/g)，细孔容量优选为0.4～1.5，更优选为0.5～1.3(ml/g)。若是这样的范围，则选择性地吸附抗菌性物质的作用优异，对微生物的生长抑制的抑制效果高，因此适合。作为(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的市售品，可以举出DIAION(注册商标)HP2MG(三菱化学株式会社制：比表面积＝570m2/g、细孔容量＝1.3ml/g)、LEWATIT(注册商标)VPOC1600(朗盛株式会社制： 比表面积＝130m2/g、细孔容量＝0.5ml/g)、PuroSorbPAD950(PuroliteCorporation制：比表面积＝535m2/g、细孔容量＝1.3ml/g)、AmberliteTMXADTM7HP(OrganoCorporation制：比表面积＝500m2/g、细孔容量＝0.6ml/g)等。
作为使上述(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液和/或培养基的方法，没有特别限定，只要使试样液和/或培养基与(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂接触即可。例如，在使其作用于试样液的情况下，只要在如上操作制得的试样液中添加(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂即可。具体而言，将(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂与被测试样一起添加到稀释液中、或者在预先添加有(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的稀释液中添加被测试样等，使试样液中含有(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂即可。这样操作，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于含有被测试样的试样液，由此，从被测试样中溶出的抗菌性物质被(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂吸附除去。另外，通过对含有被测试样和(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的试样液进行规定时间的搅拌混合，能够更有效地将抗菌性物质吸附除去。对搅拌混合时间没有特别限定，例如，进行10～60分钟左右的搅拌混合即可。试样液中的(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的含量优选为3～20质量％，适宜为5～10质量％。若是在该范围，则可获得良好的检测精度，另外对移液管的操作性也没有影响。在这样使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液之后，可以使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂原样残存于试样液中，也可以将其从试样液中分离除去。作为分离除去方法，没有特别限制，通过利用了筛、滤纸等的公知的固液分离手段进行分离即可。
通过这样使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液，能够充分地降低被测试样中的抗菌活性，因此，即使从试样液中除去该吸附剂，在上述培养基中也不添加该吸附剂而进行培养，对象微生物也表现出良好的发育，可获得高的检测精度。另一方面，本发明方法中，也可以进一步使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于培养基，在不将该吸附剂从试样液中除去的情况下将其直接添加到培养基中即可，在除去了的情况下，另外在培养基中添加该吸附剂即可。通过这样在培养基中含有(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的状态下进行培养，能够将培养基中的抗菌性物质吸附除去。培养基中的(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的含量优选为3～20质量％，更优选为5～10质量％。若是在该范围，则可得到高的检测精度。
另外，也可不使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液，而使该吸附剂仅作用于培养基。使该吸附剂作用于培养基的方法、在培养基中的添加量与上述是同样的。
本发明方法中，即使在活菌数试验的培养基中添加(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂，培养基也不着色而维持透明性，因此可准确地识别在培养后形成的菌落。进而，若将(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂从试样液分离除去后添加到培养基中，进行培养，则可以更准确地进行菌落的识別，因此，例如在琼脂平板混释法等中，可准确、迅速地进行菌落的测量。
本发明所使用的(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂对广泛的抗菌性物质表现出吸附作用，并且，对微生物的增殖所需的营养成分的吸附作用弱，因此，本发明方法可以适用于广泛的被测试样和微生物。另外，由于(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂不给培养基带来着色等影响，也容易分离除去，因此试验方法也不受限制。因此，本发明方法可适用于例如日本药典收载的微生物限度试验法中规定的总好氧性微生物数、总真菌数等活菌数试验；耐胆汁酸革兰氏阴性菌(bile-tolerantgram-negativebacteria)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)等特定微生物试验。进行特定微生物试验时，在如上所述使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液和/或培养基并进行培养之后，用根据对象微生物的种类而适宜地使用的选择培养基进行培养，由此，检测灵敏度提高。
实施例
以下，基于实施例等更详细地说明本发明。需要说明的是，本发明不受这些实施例等的任何限制。
参考例1
菌悬浮液的制备：
按照第16版修订日本药典中的一般试验法4.05微生物限度试验法，制备微生物试验中使用的接种用菌液。
(试验菌株)
大肠杆菌(Escherichiacoli，以下，简称为ECO)：IFONo.3972
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，以下，简称为SAU)：IFONo.13276
绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa，以下，简称为PAE)：IFONo.13275
枯草杆菌(Bacillussubtilis，以下，简称为BSU)：IFONo.3134
白色念珠菌(Candidaalbicans，以下，简称为CAL)：IFONo.1594
巴西曲霉(Aspergillusbrasiliensis，以下，简称为ABR)：NBRCNo.9455
生孢梭菌(Clostridiumsporogenes,以下，简称为CSP)：NCTCNo.12935
(菌悬浮液的制备)
在装入至100mL容量的三角烧瓶中的SCD培养基50mL中，接种斜面培养基保存菌株(接种环)，ECO、SAU、PAE在30～35℃下培养，CAL在20～25℃下培养，制成菌悬浮液。
对于BSU，对培养菌液进行加热处理，杀灭营养细胞，制备孢子悬浮液。
对于ABR，用PDA培养基在20～25℃下培养，观察到形成良好的孢子后，刮下得到的孢子，制备孢子液。
(接种用菌液的制备)
用蛋白胨食盐缓冲液等对这些菌悬浮液进行梯度稀释，制备接种用菌液。
实施例1
吸附剂的研究(1)：
称取试样(大承气汤提取物颗粒；株式会社津村制)10g，加入到添加有10质量％吸附剂的蛋白胨食盐缓冲液90mL(在200mL三角烧瓶中制备)中，搅拌，制备试样液。作为吸附剂，使用DIAION(注册商标)HP20(苯乙烯系)、DIAION(注册商标)HP2MG(甲基丙烯酸系)、SEPABEADS(注册商标)SP700(苯乙烯系)、SEPABEADS(注册商标)SP207(苯乙烯系)(均是三菱化学株式会社制)。另外，准备使用10质量％脱脂牛奶代替10质量％吸附剂而同样操作制得的试样液、加入了3质量％活性炭以及5质量％活性白土的SCD培养基。分取各试样液，使它们通过筛子(不锈钢制)，制成10倍稀释试样液。分取所述10倍稀释试样液各10mL到试管中。在各试管中以成为100CFU/mL以下的方式添加参考例1中制备的SAU的接种用菌液，静置2小时后，分注到培养皿中，用SCDLPA培养基(日本制药株式会社制)混释。在30～35℃下培养5天以内后，实施菌落测定。对于在10倍稀释试样液中添加了蛋白胨食盐缓冲液的样品(空白)、以及在经过滤的添加有10质量％吸附剂的SCD培养基10mL中与上述同样地添加了菌液的样品(试样非添加区)，也同样地进行菌落测定，根据下式算出回收率。若回收率为50％以上，则判定为适合：○；若低于50％，则判定为不适合：×。
回收率(％)＝{(A-B)×100}/C
A：各试验区的菌落数
B：空白的菌落数
C：试样非添加区的菌落数
[表1]
吸附剂 母体结构 判定
HP20 苯乙烯系 ○
HP2MG 甲基丙烯酸系 ○
SP700 苯乙烯系 ×
SP207 苯乙烯系 ×
脱脂牛奶 - ×
活性炭3％/活性白土5％ - ○
添加了HP20或HP2MG的情况的回收率为50％以上，表现出与添加了活性炭3质量％和活性白土5质量％的SCD培养基同等的抗菌性物质吸附能力。另外，添加了活性炭3质量％和活性白土5质量％的SCD培养基由于培养基为黑色且不透明，因此难以识别菌落，而添加了HP20或HP2MG的培养基是透明的，因此容易识別菌落，可迅速、准确地测定菌落数。
实施例2
吸附剂的研究(2)：
称取试样(大承气汤提取物颗粒；株式会社津村制)10g，加入到以成为3、5、10质量％的方式添加了吸附剂(HP20、HP2MG)的SCD培养基90mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌，制备试样液。分取这些试样液，使它们通过筛子，制成10倍稀释试样液。分取所述10倍稀释试样液各10mL到试管中。在各试验区中以成为100CFU/mL以下的方式添加参考例1中制备的SAU的接种用菌液，静置1小时后，分注到培养皿中，用SCDA培养基混释。在30～35℃下培养5天以内后，实施菌落测定。与实施例1同样地操作，算出回收率，判定适合性。另外，由于向培养皿分注合成吸附剂(移液管操作)时存在操作困难的情况，因此根据下述基准评价其难易。将结果示于表2。
(移液管操作性的评价基准)
○：用通常的灭菌带刻度移液管进行的液体的操作上没有问题。
×：存在称取困难、无法均一地分取、堵塞等问题等，给操作带来障碍。
[表2]
HP2MG在任意含量下均表现出良好的回收率。与此相对，对于HP20，为10质量％时表现出良好的回收率，但为5质量％以下时是不充足的。另外，对于HP2MG，即使是10％，操作性也良好，但对于HP20，即使是3质量％，移液管操作也困难。
实施例3
添加回收试验(1)：
称取被确认抗菌活性高的中药提取物制剂(小青龙汤、润肠汤、大黄甘草汤、大承气汤；株式会社津村制、均是提取物颗粒)10g，加入到添加了5、10质量％HP2MG的SCD培养基90mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌，制备试样液。分取所述试样液，使它们通过筛子，制成10倍稀释试样液。分取所述10倍稀释试样液各10mL到试管中。在各试验区中以分别为100CFU/mL以下的方式添加参考例1中制备的BSU或PAE的接种用菌液，静置1小时后，分注到培养皿中，用SCDA培养基混释。在30～35℃下培养5天以内后，实施菌落测定。与实施例1同样地操作，算出回收率。若回收率为50％以上，则判定为适合：○；若低于50％，则判定为不适合：×。将结果示于表3。
[表3]
通过添加HP2MG，对于全部的试验对象中药提取物制剂，BSU、PAE均表现出良好的回收率。
实施例4
吸附剂的研究(3)：
将被确认对BSU表现出抗菌活性的润肠汤的提取物粉末、二术汤和大承气汤的中药提取物颗粒(均是株式会社津村制)；以及被确认对SAU表现出抗菌活性的润肠汤的提取物粉末和大承气汤的中药提取物颗粒(均是株式会社津村制)作为活菌数试验的被测试样。另外，将被确认对ECO表现出抗菌活性的大柴胡汤、大黄甘草汤、通导散的中药提取物粉末(均是株式会社津村制)作为大肠杆菌试验的被测试样。根据第16版修订日本药典一般试验法4.05的微生物限度试验法，对各中药提取物制剂进行活菌数试验和大肠杆菌试验。对于中药提取物颗粒，称取各试样10g，加入到添加了10质量％的表4中示出的吸附剂的SCD培养基90mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌30分钟，制备试样液。分取这些试样液，使它们通过筛子，制成10倍稀释的试样液。对于提取物粉末，除了称取各试样5g，加入到添加了10质量％的表4中示出的吸附剂的SCD培养基95mL中以外，同样地操作，制成20倍稀释的试样液。
(活菌数试验)
在制备的试样液中以接种菌数为100CFU以下的方式添加参考例1中制备的BSU或SAU的接种用菌液，搅拌。将搅拌后的试样液过滤，将滤液分注到培养皿中，用SCDA培养基混释。在30～35℃下培养5天以内，实施BSU或SAU的菌落测定。与实施例1同样地操作，算出回收率。若回收率为50％以上，则判定为适合：○；若低于50％，则判定为不适合：×。
(大肠杆菌试验)
在制备的试样液中以接种菌数为50CFU以下的方式添加ECO，在30～35℃下培养24小时。培养后，将培养液涂抹于麦康凯琼脂培养基，在30～35℃下培养24小时，确认ECO的发育。若ECO发育，则判定为适合：+；若不发育，则判定为不适合：－。将这些结果示于表4。
[表4]
※注册商标
在使用添加了作为(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的PuroSorbPAD950、LEWATITVPOC1600和DIAIONHP2MG的SCD培养基的情况下，BSU、SAU和ECO均观察到发育。与此相对，为苯乙烯系、其他吸附剂时，3个菌种均没有观察到发育。
实施例5
活菌数试验(琼脂平板混释法)：
对下表5中示出的中药提取物颗粒128个处方(均是株式会社津村制)，以SAU、PAE、BSU、CAL、ABR作为受试菌，进行活菌数试验。对CAL、ABR进行总好氧性菌数(TAMC)测定和总真菌数(TYMC)测定，对SAU、PAE、BSU进行TAMC测定。
称取各试样10g，加入到以成为10质量％的方式添加了HP2MG的SCD培养基90mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌，制备试样液。分取这些试样液，使它们通过筛子，制成10倍稀释试样液。分取所述10倍稀释试样液各10mL到试管中。以分别为100CFU/mL以下的方式添加参考例1中制备的各接种用菌液，静置1小时。
(TAMC测定)
对接种后的10倍稀释试样液进行搅拌，然后，分注1mL到培养皿中，用SCDA培养基混释。在30～35℃下、5天以内的培养条件下实施菌落测定，与实施例1同样地操作，算出回收率。若回收率为50％以上，则判定为适合：○；若低于50％，则判定为不适合：×。
(TYMC测定)
对接种后的10倍稀释试样液进行搅拌，然后，分注1mL到培养皿中，用SDA培养基混释。在20～25℃下、5天以内的培养条件下实施菌落测定，与实施例1同样地操作，算出回收率。若回收率为50％以上，则判定为适合：○；若低于50％，则判定为不适合：×。将结果示于表5～8。
[表5]
[表6]
[表7]
[表8]
中药提取物制剂128个处方、7个菌株的896个试验区之中，回收率低于50％的只有1试验区，可以确认是通用性非常高的方法。
需要说明的是，对于回收率低于50％的1试验区，通过稍微改变试验方法，也可能使回收率为50％以上。
实施例6
添加回收试验(2)：
确认稀释倍数对添加回收率的影响。称取被确认对BSU具有抗菌性的中药提取物粉末(大黄甘草汤、大承气汤；均是株式会社津村制)5g，加入到SCD培养基95mL或添加了10质量％HP2MG的SCD培养基95mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌，得到稀释倍数20倍的试样液。同样地，在SCD培养基或添加了10质量％HP2MG的SCD培养基中以成为30、50、和100倍稀释的方式添加该中药提取物粉末，搅拌，得到稀释倍数30、50、和100倍的试样液。在稀释倍数20、30、50、100倍的各试验区中以接种菌数为100CFU/mL以下的方式添加参考例1中制备的BSU的接种用菌液，静置1小时。然后，使由添加了HP2MG的SCDB制备的试样液通过筛子，将各试样液分注到培养皿中，用SCDA培养基混释。在30～35℃下培养5天以内后，进行菌落测定，与实施例1同样地操作，算出回收率。若回收率为50％以上，则判定为适合：○；若低于50％，则判定为不适合：×。将结果示于表9及图1和图2中。
[表9]
对于用不添加HP2MG的SCD培养基制备的试样液，若不稀释到50～100倍，则不能回收50％以上的BSU，对于添加了10％HP2MG的SCD培养基，在20倍稀释下，得到了50％以上的回收率。因此判断：对于大黄甘草汤提取物和大承气汤提取物的对BSU的活菌数试验，通过添加10质量％HP2MG，在稀释倍数30倍以下、优选稀释倍数20倍～30倍稀释下，可实施试验。
实施例7
添加回收试验(3)：
称取被确认对BSU具有抗菌性的中药提取物粉末11个处方(半夏厚朴汤、人参汤、半夏白术天麻汤、桃核承气汤、调胃承气汤、平胃散、大黄甘草汤、竹茹温胆汤、黄连汤、麻子仁丸、大承气汤；均是株式会社津村制)5g，加入到SCD培养基95mL或添加了10质量％HP2MG的SCD培养基95mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌，制备试样液。分取试样液，使它们通过筛子，分别制成20倍稀释试样液。在各试验区中以接种菌数为100CFU/mL以下的方式添加参考例1中制备的BSU的接种用菌液，静置1小时后，分注到培养皿中，用SCDA培养基混释。在30～35℃下培养5天以内后，进行菌落测定，与实施例1同样地操作，算出回收率。若回收率为50％以上，则判定为适合：○；若低于50％，则判定为不适合：×。将结果示于表10。
[表10]
处方名 SCD培养基 添加了HP2MG的SCD培养基
半夏厚朴汤 × ○
人参汤 × ○
半夏白术天麻汤 × ○
核桃承气汤 × ○
调胃承气汤 × ○
平胃散 × ○
大黄甘草汤 × ○
竹茹温胆汤 × ○
黄连汤 × ○
麻子仁丸 × ○
大承气汤 × ○
试样非添加区 ○ ○
对于用SCD培养基制备的试样液，任何一个处方的BSU的回收率都低于50％，但对于添加了10％HP2MG的SCD培养基，均得到了50％以上的回收率。因此，对于半夏厚朴汤、人参汤、半夏白术天麻汤、桃核承气汤、调胃承气汤、平胃散、竹茹温胆汤、黄连汤以及麻子仁丸提取物粉末的对BSU的活菌数试验，通过添加10质量％HP2MG，在稀释倍数20下，可以实施试验。
实施例8
特定微生物试验(大肠杆菌)：
(直接培养法)
称取被确认对大肠杆菌具有抗菌活性的中药提取物粉末(乙字汤、大柴胡汤、小柴胡汤、加味逍遥散、润肠汤、桃核承气汤、芍药甘草汤、大黄甘草汤、通导散、柴苓汤、茵陈蒿汤；均是株式会社津村制)5g，添加到SCD培养基95mL或添加了10质量％HP2MG的SCD培养基95mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌，制备20倍稀释的试样液。在试样液中以接种菌数为50CFU以下的方式添加参考例1中制备的ECO的接种用菌液，在30～35℃下培养24小时。培养后，将培养液涂抹于麦康凯琼脂培养基，在30～35℃下培养24小时，确认ECO的发育。若ECO发育，则判定为适合：+；若不发育，则断定为不适合：－。将结果示于表11。
对于利用SCD培养基的培养，任意中药提取物粉末都没有观察到ECO的发育，但在添加了10％HP2MG的SCD培养基中，除了大黄甘草汤以外的10个处方均观察到发育，表示可以进行ECO的检测。
(稀释法)
将直接培养法(20倍稀释)中没有观察到ECO发育的大黄甘草汤提取物粉末用添加了10％HP2MG的SCD培养基制备20倍稀释的试样液。在该试样液中以接种菌数为100CFU以下的方式添加ECO之后，将20倍稀释液20mL分注到40mL的SCD培养基中，制成60倍稀释液，在30～35℃下培养24小时。培养后，将培养液涂抹于麦康凯琼脂培养基，在30～35℃下培养24小时，确认ECO的发育。若ECO发育，则判定为适合：+；若不发育，则判定为不适合：－。将结果示于表11。
[表11]
因此，判断：对于乙字汤、大柴胡汤、小柴胡汤、加味逍遥散、润肠汤、桃核承气汤、芍药甘草汤、通导散、柴苓汤以及茵陈蒿汤提取物粉末的对ECO的特定微生物试验，通过添加10质量％HP2MG，在稀释倍数20倍下可以实施试验。另外，对于在直接培养法(20倍稀释)中没有观察到ECO发育的大黄甘草汤提取物粉末，通过用SCD培养基稀释为60倍，也观察到ECO的发育，确认可进行检测。
实施例9
特定微生物试验(梭状芽孢杆菌(Clostridia))：
将确认对梭状芽孢杆菌具有抗菌活性的中药提取物颗粒(麻黄汤、茵陈蒿汤；均是株式会社津村制)10g加入到SCD培养基90mL或添加了10质量％HP2MG的SCD培养基90mL中，进行搅拌，制备10倍稀释的试样液。在90mL的强化梭状芽孢杆菌培养基中接种各试样液10mL后，以接种菌数为50CFU以下的方式添加CSP菌液(SYSMEXbioMérieuxCo.，Ltd.制BioBall(注册商标)MultiShot550ClostridiumsporogenesNCTC12935)，在30～35℃下厌氧的条件下进行48小时培养。培养后，将培养液涂抹到哥伦比亚琼脂培养基中，在30～35℃下厌氧的条件下进行48小时培养，确认CSP的发育。若CSP发育，则断定为适合：+；若不发育，则断定为不适合：-。将结果示于表12。
[表12]
处方名 试样液制备中使用SCD培养基 试样液制备中使用添加了HP2MG的SCD培养基
麻黄汤 - +
茵陈蒿汤 - +
因此，对于麻黄汤和茵陈蒿汤提取物粉末的对CSP的特定微生物试验，用SCD培养基制备试样液时，没有观察到CSP的发育，但确认在添加了10％HP2MG的SCD培养基中可以检测，判定可实施试验。
实施例10
特定微生物试验(大肠杆菌)：
称取被确认对大肠杆菌具有抗菌活性的生药(大黄)5g，加入到SCD培养基95mL或添加了10质量％HP2MG的SCD培养基95mL(在200mL容积三角烧瓶中制备)中，搅拌，得到稀释倍数20倍的试样液。同样地，在SCD培养基或添加了10质量％HP2MG的SCD培养基中以成为100和200倍稀释的方式添加生药(大黄)，搅拌，得到稀释倍数为100、200倍的试样液。在各试样液中以接种菌数为50CFU以下的方式添加参考例1中制备的ECO的接种用菌液，在30～35℃下培养24小时。培养后，将培养液涂抹于麦康凯琼脂培养基，在30～35℃下培养24小时，确认ECO的发育。若ECO发育，则断定为适合：+；若不发育，则断定为不适合：－。将结果示于表13。
[表13]
在利用SCD培养基的培养中，虽然100倍稀释下观察到ECO的发育，但20倍稀释下没有观察到发育。另一方面，在添加了10％HP2MG的SCD培养基中，20倍稀释下观察到ECO的发育。因此，确认了，对于大黄的对大肠杆菌的特定微生物试验，通过添加10质量％HP2MG，即使不稀释也可以检测，判定可实施试验。
产业上的可利用性
本发明的微生物检测方法可降低多种抗菌性物质的影响、以高精度检测被测试样中的微生物。因此，作为具有抗菌活性的中药提取物制剂、生药的微生物试验法极其有用。

Claims (11)

1.一种具有抗菌活性的被测试样中的微生物检测方法，其特征在于，包括：制备含有具有抗菌活性的被测试样的试样液的工序和用培养基培养对象微生物的工序，在所述微生物检测方法中，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液和/或培养基。
2.根据权利要求1所述的微生物检测方法，其中，(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的细孔的众数(细孔)半径为
3.根据权利要求1或2所述的微生物检测方法，其中，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液。
4.根据权利要求3所述的微生物检测方法，其中，在试样液中添加(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂。
5.根据权利要求3或4所述的微生物检测方法，其中，试样液中的(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的含量为3～20质量％。
6.根据权利要求3～5中的任一项所述的微生物检测方法，其中，对含有具有抗菌活性的被测试样和(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的试样液进行规定时间的搅拌混合。
7.根据权利要求1～6中的任一项所述的微生物检测方法，其中，在使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于试样液之后，将(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂从试样液中分离除去。
8.根据权利要求1～7中的任一项所述的微生物检测方法，其中，使(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂作用于培养基。
9.根据权利要求8所述的微生物检测方法，其中，在培养基中添加(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂。
10.根据权利要求8或9所述的微生物检测方法，其中，培养基中的(甲基)丙烯酸酯系合成吸附剂的含量为3～20质量％。
11.根据权利要求1～10中的任一项所述的微生物检测方法，其中，具有抗菌活性的被测试样为中药提取物制剂或生药。
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