CN109694899A - 一种含有chg成分的湿巾产品中微生物限度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有CHG成分的湿巾产品中微生物限度的检测方法，包括步骤S1，取湿巾样品，制备供试液；步骤S2，检测供试液中的需氧菌总数和霉菌酵母菌总数；步骤S3，取步骤S1中的供试液制备初增菌液A，检测初增菌液A中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌；步骤S4，取步骤S1中的供试液制备初增菌液B，检测初增菌液B中的沙门氏菌。本发明提供的方法中，采用含有吐温‑80的无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液对滤膜进行冲洗，中和了湿巾配方中的杀菌剂成分CHG，并采用含有吐温‑80和卵磷脂的培养基进行培养，有效降低了检测中假阴性的可能性，提高了湿巾产品中微生物限度检测的准确度。
Description
技术领域
本发明属于一次性卫生用品领域，具体涉及一种含有CHG成分湿巾产品中微生物限度的检测方法。
背景技术
微生物限度检测，检测能够自行繁殖的微生物的数量，是湿巾产品能否上市的重要指标，其原理是通过对湿巾产品的取样检测，通过相应的培养基培养，将湿巾中的微生物培养出来，如果湿巾中的微生物指标不符合标准要求，则判断产品不合格，不允许上市。
目前，一般都采用薄膜过滤法进行微生物限度的检测，并参照USP61和USP62测试。而市面上销售的人体清洁湿巾配方中一般会具有杀菌剂CHG(洗必泰)，据目前的测试方法会存在假阴性的结果。要想准确检测湿巾中的微生物，必须要对消除防腐剂对检测方法的干扰。而目前业内并没有针对含有杀菌剂CHG的湿巾产品中微生物限度的检测方法。因此，为了能够消除湿巾中防腐剂对微生物限度检测的影响，保证湿巾产品中微生物指标判断的准确性，亟需一种能够准确检测含有CHG成分的湿巾产品中微生物限度的方法。
发明内容
为了解决上述生产中的问题，本发明提供了一种含有CHG(洗必泰)成分的湿巾产品中微生物限度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，取湿巾样品加入到缓冲液中，制备供试液；
步骤S2，将供试液采用滤膜过滤，并采用缓冲液对滤膜进行冲洗，检测滤液中的需氧菌总数和霉菌酵母菌总数；
步骤S3，取步骤S1中的供试液制备初增菌液A，检测初增菌液A中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌；
步骤S4，取步骤S1中的供试液制备初增菌液B，检测初增菌液B中的沙门氏菌；
其中，所述缓冲液为含有0.5％吐温-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
进一步地，所述步骤S1具体操作如下，剪取10g样品置于无菌三角瓶中，并加入90ml缓冲液，将无菌三角瓶置于摇床上摇匀，即得到质量体积比为1:10的供试液。
进一步地，所述步骤S2具体操作如下，取1ml 1:10供试液通过膜过滤器过滤，再取100ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行过滤冲洗，取一次过滤膜贴于大豆-酪蛋白消化物琼脂平板，将所述平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天，用于检测需氧菌总数，取另一次过滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂平板，将所述平板置于20-25℃培养箱中培养5-7天，用于检测霉菌酵母菌总数。
进一步地，所述步骤S3中，初增菌液A的制备方法为，取10ml1:10的供试液至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液A，所述大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中含有0.5％吐温80和0.07％卵磷脂。
进一步地，所述步骤S3中，初增菌液A中的金黄色葡萄球菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至甘露醇氯化钠琼脂(MSA)上涂匀，30-35℃倒置培养18-72小时；若MSA平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阴性，判断供试品未检出金黄色葡萄球菌。
进一步地，所述步骤S3中，初增菌液A中的大肠埃希菌的检测方法为，取1ml初增菌液A中挑取一环至麦康凯琼脂培养基(MCA)上涂匀，在42℃-44℃再培养18-72小时；若MCA中菌落呈黑紫色，有金属光泽，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出大肠埃希菌。
进一步地，所述步骤S3中，初增菌液A中的铜绿假单胞菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至十六烷基三甲基溴化铵(CM)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-72小时；若CM上菌落或菌落周围呈蓝绿色，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
进一步地，所述步骤S4的操作如下，取100ml的1:10供试液过滤后，将滤膜放至100ml TSB中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液B，取0.1ml的初增菌液B至10mlRVS肉汤培养基中，在30℃-35℃条件下培养18-24小时，用接种环从RVS肉汤中挑取一环至木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基(XLD)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-48小时；若XLD平板上出现有生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为沙门氏菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出沙门氏菌。
进一步地，所述步骤S2-S4中还设置有阴性对照。
相关术语说明
其中，所述TSAWLP：大豆酪蛋白消化物琼脂培养基(含有0.5％吐温80和0.07％卵磷脂)
所述SDAWLP：沙氏葡萄糖琼脂培养基(含有0.5％吐温80和0.07％卵磷脂)
所述TSB：大豆酪蛋白消化物肉汤
所述MSA：甘露醇氯化钠琼脂
所述CM：十六烷基三甲基溴化铵培养基
所述MCB：麦康凯肉汤培养基
所述MCA：麦康凯琼脂培养基
所述RV：增菌肉汤
所述XLD：木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1.本发明的检测方法中，采用含有0.5％吐温-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液处理供试液，在处理过程中既不影响微生物生长，也能很好中和杀菌剂CHG(洗必泰)，从而保证检测结果的准确性，为生产企业检测湿巾中微生物生长状况提供真实可靠数据。
2.本发明中采用仅添加0.7％的卵磷脂制备初增菌液A，消除了对所检测的所有菌种的假阴性结果，且相对于同时添加卵磷脂和吐温而言，既节约成本又能够保证检测的精确性。
3.本发明采用薄膜过滤法，并在此基础上增加冲洗液对滤膜进行冲洗的步骤，能够有效中和防腐剂，且操作简单方便，实用性强。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
实施例1制备供试液
把剪刀的前端在注射针红外线加热消毒器中消毒至少5秒钟，然后冷却至少5秒钟，剪开样品包装袋，从样品上部剪取10g样品至90ml含有0.5％吐温-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的罐子中，标记上简短的数字批号、抽样日期。将罐子放置摇床上，以190-220转/分的速度振荡至少10分钟，即得到质量体积比为1:10的供试液。
实施例2需氧菌总数和霉菌酵母菌总数的测定
将膜过滤器安装在装置上，量取100ml含0.5％吐温80的pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至过滤器中，再加入1ml的1:10供试液，过滤，再用100ml含0.5％吐温80的pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗两次然后过滤，将滤膜贴在已制备好的大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基上，倒置于30-35℃培养3-5天。同样操作，将另一次滤膜贴在沙氏葡萄糖琼脂培养基上，倒置于20-25℃培养5-7天。
检测结果如表1所述，其中，
Inoculums Product：接种浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液于平板上。
Product Challenge：在含有样品的供试液中同时添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照实施例1-2的方法取样并过滤，接种滤膜。
Neutralizing Agent Control：供试液中不添加样品，添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照实施例1-2的方法过滤，接种滤膜。
Product Control：供试液按照实施例1-2的方法过滤，接种滤膜。
检测结果如表1所示，本发明检测的菌落回收率均在70％以上，符合药典规定中回收率的要求。同时，经过菌液回收率检测可知，采用缓冲液对滤膜进行冲洗，既不影响微生物生长，也能很好中和防腐剂，从而保证检测结果的准确性。
实施例3金黄色葡萄球菌的检测
取10ml1:10的供试液至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，所述大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中含有0.5％吐温80和0.07％卵磷脂，即得初增菌液A。用接种环从初增菌液A中挑取一环至甘露醇氯化钠琼脂(MSA)上涂匀，30-35℃倒置培养18-72小时；若MSA平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阴性，判断供试品未检出金黄色葡萄球菌。检测结果如表2所示。
其中，Product Challenge：在含有样品的供试液中同时添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Neutralizing Agent Control：供试液中不添加样品，添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Product Control：并按照本实施例的方法检测。
表2金黄色葡萄球菌的检测
实施例4大肠埃希菌的检测
取10ml1:10的供试液至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，所述大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中含有0.5％吐温80和0.07％卵磷脂，即得初增菌液A。用接种环从初增菌液A中挑取一环至麦康凯琼脂培养基(MCA)上涂匀，在30℃-35℃再培养18-72小时；若MCA中菌落呈黑紫色，有金属光泽，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出大肠埃希菌。检测结果如表3所示。
其中，Product Challenge：在含有样品的供试液中同时添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Neutralizing Agent Control：供试液中不添加样品，添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Product Control：并按照本实施例的方法检测。
表3大肠埃希菌的检测
实施例5铜绿假单胞菌的检测
取10ml1:10的供试液至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，所述大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中含有0.5％吐温80和0.07％卵磷脂，即得初增菌液A。用接种环从初增菌液A中挑取一环至十六烷基三甲基溴化铵(CM)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-72小时；若CM上菌落或菌落周围呈蓝绿色，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。检测结果如表4所示。
其中，Product Challenge：在含有样品的供试液中同时添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Neutralizing Agent Control：供试液中不添加样品，添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Product Control：并按照本实施例的方法检测。
表4铜绿假单胞菌的检测
实施例6沙门氏菌的检测
取10ml的1:10供试液至100mlRVS增菌肉汤培养基中，在30℃-35℃条件下培养18-24小时，用接种环从RVS增菌肉汤中挑取一环至木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基(XLD)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-48小时；若XLD平板上出现有生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为沙门氏菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出沙门氏菌。检测结果如表5所示。
其中，Product Challenge：在含有样品的供试液中同时添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Neutralizing Agent Control：供试液中不添加样品，添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照本实施例的方法检测。
Product Control：并按照本实施例的方法检测。
表5沙门氏菌的检测
实施例7
按照实施例1方法制备供试液，其中缓冲液中不添加吐温80，接种浓度103cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液于9.9ml的所述供试液中，并涂布与TSA平板上。同时，接种浓度103cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液于9.9ml的pH＝7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液中，并涂布与TSA平板上。将平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天，检测其中需氧菌数量，结果如表6所示。
表6需氧菌数量的检测
从表6中可以看出，在供试液中不含吐温80的情况下，需氧菌Staphylococcusaureus、Pseudomonas aeruginosa、Bacilus subtilis、Candida albicans、Aspergillusniger中均会出现假阴性，从而影响检测结果的准确性。因此，在缓冲液中添加吐温80可以有效中和防腐剂对需氧菌生长的影响。
实施例8
取10ml1:10的供试液至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，所述大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中含有不同质量分数的卵磷脂，即得初增菌液A，检测需氧菌的数量，此外，在同时添加不同质量分数的卵磷脂和吐温80的初增菌液A中，检测需氧菌的数量。数据见表7。可以看出，在含有不同浓度的卵磷脂的培养基中，各种需氧菌的生长情况是不同的。此外，同时添加卵磷脂和吐温的初增菌液A中，由于过多的添加中和剂，需氧菌的生长也会受到不同程度的影响，因此也会出现假阴性的结果。综上，仅有在添加0.7％卵磷脂的初增菌液A中，才能避免所有的需氧菌检测过程中出现假阴性的结果。
表7不同需氧菌的检测
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种含有CHG成分的湿巾产品中微生物限度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，取湿巾样品加入到缓冲液中，制备供试液；
步骤S2，将供试液采用滤膜过滤，并采用缓冲液对滤膜进行冲洗，检测滤液中的需氧菌总数和霉菌酵母菌总数；
步骤S3，取步骤S1中的供试液制备初增菌液A，检测初增菌液A中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌；
步骤S4，取步骤S1中的供试液制备初增菌液B，检测初增菌液B中的沙门氏菌；
其中，所述缓冲液为含有质量分数为0.5％吐温-80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1具体操作如下，剪取10g样品置于无菌三角瓶中，并加入90ml缓冲液，将无菌三角瓶置于摇床上摇匀，得到质量体积比为1:10的供试液。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2具体操作如下，取1ml 1:10供试液通过膜过滤器过滤，再取100ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液进行过滤冲洗，取一次过滤膜贴于大豆-酪蛋白消化物琼脂平板，将所述平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天，用于检测需氧菌总数，取另一次过滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂平板，将所述平板置于20-25℃培养箱中培养5-7天，用于检测霉菌酵母菌总数。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，初增菌液A的制备方法为，取10ml1:10的供试液至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液A，所述大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中含有质量分数为0.7％卵磷脂。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，初增菌液A中的金黄色葡萄球菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至甘露醇氯化钠琼脂(MSA)上涂匀，30-35℃倒置培养18-72小时；若MSA平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与前述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阴性，判断供试品未检出金黄色葡萄球菌。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，初增菌液A中的大肠埃希菌的检测方法为，取1ml初增菌液A中挑取一环至麦康凯琼脂培养基(MCA)上涂匀，在42℃-44℃再培养18-72小时；若MCA中菌落呈黑紫色，有金属光泽，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出大肠埃希菌。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，初增菌液A中的铜绿假单胞菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至十六烷基三甲基溴化铵(CM)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-72小时；若CM上菌落或菌落周围呈蓝绿色，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S4的操作如下，取100ml的1:10供试液过滤后，将滤膜放至100ml TSB中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液B，取0.1ml的初增菌液B至10mlRVS肉汤培养基中，在30℃-35℃条件下培养18-24小时，用接种环从RVS肉汤中挑取一环至木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基(XLD)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-48小时；若XLD平板上出现有生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为沙门氏菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出沙门氏菌。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2-S4中还设置有阴性对照。
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