CN103320495A - 一种抗厌氧菌药物制剂的微生物及无菌检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗厌氧药物制剂的微生物或无菌检测方法，包括如下步骤：（1）配制稀释液，（2）配制供试液，（3）薄膜过滤和冲洗，（4）检查，其中，稀释液采用的是环糊精水溶液。本发明的检测方法可以有效地检验厌氧菌类微生物和无菌检验。

Description

一种抗厌氧菌药物制剂的微生物及无菌检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，更具体地说，涉及一种抗厌氧菌药物制剂的微生物检测方法。 

背景技术

常用的抗厌氧菌药物有林可霉素类、氯霉素和硝基咪唑类等。林可霉素类药物对梭状芽孢杆菌和梭状菌属以外的各种厌氧菌的作用均强大，但不易透过血脑屏障。氯霉素对各类厌氧菌和许多需氧菌的作用良好。在脑脊液中浓度较高，但具有骨髓抑制作用，故主要留作中枢神经系统厌氧菌感染的选用药物。 

硝基咪唑类药物是目前抗厌氧菌的首选药物。甲硝唑是第一代5-硝基咪唑类药物、替硝唑是第二代5-硝基咪唑类药物、奥硝唑是第三代硝基咪唑类药物。奥硝唑是活性最强、副作用最小的2-甲基-5-硝基咪唑类化合物，是上述两代产品的替代品，临床上应用相当广泛。国外20世纪80年代就对其进行相关性研究，目前已经在德国、法国、意大利、澳大利亚等国投产上市。现收载于捷克药典（1991年）。该药近些年来才进入我国市场，目前已上市的剂型有片剂、胶囊剂、分散片和注射液。 

注射类产品中微生物污染的危害性，各国药典及药物分析人员均十分重视。微生物和无菌检查方法的研究，目的是找到有效、合理和科学的检查方法。注射用药品，在生产过程中，均会有一定的灭菌和无菌保证方法，但是，往往是这样的措施使污染的微生物受到损伤，使微生物处于休眠或者亚致死状态，另外抗菌药物本身对微生物的有抑制或杀灭作用。但是，受损伤、处于休眠或亚致死状态的微生物进入人体后，在体液的相对营养良好的条件下，微生物会复苏、繁殖，以致影响人体的健康，甚至是威胁生命。因此，在药品的微生物和无菌检查过程中，通常是要消除产品本身对微生物的抑制作用，使受损伤、处于休眠或亚致死状态的微生物在良好的营养条件下复苏、生长繁殖，从而得以检出，以此来保证药品的安全。 

例如，作为第三代硝基咪唑类药物，奥硝唑的抗厌氧菌的特性，决定了其在无菌方法建立上的难度非常大。已经和正在使用的咪唑类抗厌氧药物的无菌检查法，即使采用薄膜过滤法，经过稀释液（如0.9氯化钠溶液或者0.1%蛋白胨水溶液）的稀释，通过大量的冲洗液冲洗滤膜（超过1000ml/膜），阳性对照菌生孢梭菌仍会出现无法生长的情况；而同时进行的不处理样品的阳性对照则生长良好。这说明，薄膜过滤器中残留的微量的奥硝唑可影响检验过程中微生物的正常生长，目前的方法是加大冲洗量，但依靠这单一的手段，无法彻底去除残留的微量奥硝唑，另外，过量的冲洗也是无菌检查过程中不允许的。因为过量超量的冲洗，可能造成滤膜孔径的变化使检验结果无效，也可能因为长时间液体的剪切力造成微生物的损伤和死亡，出现漏检的情况。 

因此，对于抗厌氧菌药物制剂的微生物和无菌检查，需要找到一种有效、科学、合理且可操作性强的检测方法，即可减少薄膜过滤法中滤膜的吸附作用，利用较少的冲洗量即可达到比较彻底的消除抑菌作用的效果，同时，能够更方便更准确的得到药品的无菌检查结果。 

发明内容

本发明人在抗厌氧药物制剂微生物和无菌检验的研究中令人惊奇地发现了一种检验方法，采用环糊精溶液，经薄膜过滤法有效地检验厌氧菌类微生物和无菌检验。 

本发明的目的是提供一种抗厌氧药物制剂的微生物和无菌检测方法。 

具体地说，本发明提供了一种抗厌氧药物制剂的微生物或无菌检测方法，包括如下步骤： 

（1）配制稀释液

配制1%-20%（w/v）环糊精水溶液：取1g-200g的环糊精，用1000ml水溶解，分装，灭菌;

（2）配制供试液

取抗厌氧菌药物制剂，转移至步骤（1）所得到环糊精水溶液中；

（3）薄膜过滤和冲洗

将步骤（2）得到的供试液进行薄膜过滤，然后用冲洗液冲洗滤膜；

（4）检查

按照《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ H无菌检验或J微生物限度检验所述检查法检查。

在本发明的实施方案中，其中，所述抗厌氧菌药物选自硝基咪唑类药物，如：奥硝唑、甲硝唑、替硝唑、塞克硝唑、左旋或右旋奥硝唑；或抗厌氧药物，如喹诺酮类抗生素，包括左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星等。优选地，所述抗厌氧菌药物选自甲硝唑、替硝唑、奥硝唑或左旋奥硝唑、或莫西沙星、或加替沙星；特别优选地，选自奥硝唑或左旋奥硝唑。 

在本发明的实施方案中，其中，所述抗厌氧菌药物制剂，其制剂类型选自注射剂、口服固体制剂、滴眼剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、冲洗剂、擦剂、涂剂、或涂膜剂；优选地，选自注射剂或滴眼剂，更优选地，选自注射剂。 

在本发明的实施方案中，其中，稀释剂中所述环糊精选自α-环糊精或其衍生物、或β-环糊精或其衍生物，例如α-环糊精、β-环糊精、羟乙基β-环糊精、羟丙基β-环糊精、甲基β-环糊精、磺丁基β-环糊精、羧甲基β-环糊精、巯基β-环糊精、低聚乳酸基β-环糊精、羟丁基β-环糊精、或葡萄糖基氨基β-环糊精，优选地，选自羟丙基β-环糊精。 

在本发明的实施方案中，其中，所述冲洗液选自0.9%（w/v）氯化钠溶液或者0.1%（w/v）蛋白胨水溶液，优选地，选自0.9%（w/v）氯化钠溶液。这里，所述稀释剂的配制和处理采用按照《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ H无菌检验或J微生物限度检验中的方法。 

在本发明的实施方案中，其中，所述薄膜选自符合《中国药典》规定的醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、醋酸纤维和硝酸纤维混合膜、聚四氟乙烯膜，优选地，选自醋酸纤维膜。 

在本发明的一种优选实施方案中，本发明提供了一种抗厌氧药物的无菌检测方法如下： 

（1）、配制稀释剂

配制1%-20%（w/v）羟丙基β-环糊精溶液：取1g-200g的羟丙基β-环糊精，用1000ml水溶解，分装，灭菌, 灭菌温度121℃，灭菌时间15min；

（2）、制备供试液

取抗厌氧菌药物制剂，平均分成两组，每组分别全部转移至羟丙基β-环糊精溶液中；

（3）、薄膜过滤和冲洗

将步骤（2）得到的供试液进行薄膜过滤，然后用0.9%氯化钠溶液分次冲洗；

（4）检查

以生孢梭菌为阳性对照菌，按照《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ H所述检查法检查。

本发明提供的一种抗厌氧药物的无菌检测方法，是一种有效、科学、合理且可操作性强的无菌检测方法。与之前常用的检测方法比较，本发明所提供的无菌检测方法，采用一定浓度的环糊精溶液作为稀释液，在检测过程中利用环糊精的包埋作用，减少滤膜的吸附作用，利用较少的冲洗量即可达到比较彻底的消除抑菌作用的效果，能够更方便更准确的得到药品的无菌检查或微生物检查结果。 

实施例

实施例1

取奥硝唑注射液（装量6ml）20支，分为2组（10支为一组），每组分别全部转移至10%的羟丙基β-环糊精溶液400ml中，经薄膜过滤法处理，用0.9%氯化钠溶液分次冲洗（每膜不少于800ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，按照中国药典2010年版二部无菌检查法进行检查，结果为阴性。

实施例2

取甲硝唑注射液（装量100ml）15瓶，分为2组（一组为8瓶，另一组为7瓶），每组分别用同体积10%的羟丙基β-环糊精溶液进行1:1稀释，经薄膜过滤法处理，用0.9%氯化钠溶液分次冲洗（每膜不少于800ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，按照中国药典2010年版二部无菌检查法进行检查，结果为阴性。

实施例3

取替硝唑氯化钠注射液（装量100ml）15瓶，分为2组（一组为8瓶，另一组为7瓶），每组分别用同体积10%的羟丙基β-环糊精溶液进行1:1稀释，经薄膜过滤法处理，用0.9%氯化钠溶液分次冲洗（每膜不少于800ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，按照中国药典2010年版二部无菌检查法进行检查，结果为阴性。

实施例4

取左氧氟沙星氯化钠注射液（装量150ml）15瓶，分为2组（一组为8瓶，另一组为7瓶），每组分别用同体积10%的羟丙基β-环糊精溶液进行1:1稀释，经薄膜过滤法处理，用0.9%氯化钠溶液分次冲洗（每膜不少于500ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，按照中国药典2010年版二部无菌检查法进行检查，结果为阴性。

实施例5

取盐酸左氧氟沙星滴眼液（规格5ml:15mg）15支，全部转移至10%的羟丙基β-环糊精溶液400ml中，经薄膜过滤法处理，用0.9%氯化钠溶液分次冲洗（每膜不少于500ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，按照中国药典2010年版二部无菌检查法进行检查，结果为阴性。

实施例6

取奥硝唑注射液（装量6ml）20支，分为2组（10支为一组），每组分别全部转移至5%的β-环糊精溶液400ml中，经薄膜过滤法处理，用0.9%氯化钠溶液分次冲洗（每膜不少于800ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，按照中国药典2010年版二部无菌检查法进行检查，结果为阴性。

实施例7

取奥硝唑注射液（装量6ml）20支，分为2组（10支为一组），每组分别全部转移至5%的羧甲基β-环糊精溶液400ml中，经薄膜过滤法处理，用0.9%氯化钠溶液分次冲洗（每膜不少于800ml），以生孢梭菌为阳性对照菌，按照中国药典2010年版二部无菌检查法进行检查，结果为阴性。

实施例8

   取1ml（含50~100cfu）金黄色葡萄球菌菌液，加至10%的羟丙基β-环糊精溶液400ml中，用封闭式薄膜过滤器全部过滤，以0.9％氯化钠溶液800ml为冲洗液，冲洗8次；枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同法操作；细菌筒分别将硫乙醇酸盐流体培养基加入滤器内，真菌筒分别将改良马丁培养基加入滤器内，置规定温度培养，逐日观察，结果见表1。

表1 10%羟丙基-β-环糊精溶液对药典无菌检查的6株阳性菌生长的影响

从表中结果可以看出，用10%的羟丙基β-环糊精溶液作为稀释液与50~100cfu的菌液混合后，采用薄膜过滤法处理后，以0.9％氯化钠溶液800ml为冲洗液，冲洗8次后，6株验证菌株均能生长良好，说明10%的羟丙基β-环糊精溶液对细菌和真菌的生长没有影响。同样，对1%，5%，15%，20%的羟丙基β-环糊精溶液进行了上述实验，结果相同。

本实验例证明羟丙基β-环糊精溶液对细菌和真菌的生长没有影响。 

实施例9

取奥硝唑注射液40支，10支为一组，每组分别全部转移至10%的羟丙基β-环糊精溶液400ml中，经薄膜过滤法处理，用不同的冲洗液分次冲洗，以生孢梭菌为阳性对照菌，结果如表2。

表2 不同冲洗液冲洗对生孢梭菌的生长情况

由表2的结果可知，采用中国药典推荐的三种冲洗液，0.9%氯化钠溶液、0.1%蛋白胨水溶液和pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，阳性对照菌生孢梭菌均生长良好。又使用了含中和剂（3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂）的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，阳性对照菌生孢梭菌生长良好。聚山梨酯80和卵磷脂可以消除防腐剂和抗生素的抑菌作用，作为常用的中和剂经常在药品的无菌检查中使用，这也是欧洲药典7.1和美国药典32中推荐的中和剂。

对比例1

   取奥硝唑注射液20支，10支为一组，每组分别全部转移至0.9%氯化钠溶液400ml中，经薄膜过滤法处理，用不同的冲洗液分次冲洗，以生孢梭菌为

阳性对照菌，结果如表3。

表3 不同冲洗液冲洗对生孢梭菌的生长情况

由表3的结果可知，使用0.9%氯化钠溶液作为稀释剂的情况下，采用中国药典推荐的三种冲洗液，0.9%氯化钠溶液、0.1%蛋白胨水溶液和pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，阳性对照菌生孢梭菌均不生长。又使用了含中和剂（3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂）的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，阳性对照菌生孢梭菌仍不生长。聚山梨酯80和卵磷脂可以消除防腐剂和抗生素的抑菌作用，作为常用的中和剂经常在药品的无菌检查中使用，这也是欧洲药典7.1和美国药典32中推荐的中和剂。

对比例2

实验过程同实例2，将稀释液改为含中和剂（3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂）的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，含中和剂3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂）的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液在大多数抗厌氧菌药物无菌检验中均可以消除假阴性，结果生孢梭菌均不能生长。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。 

Claims (6)

1.一种抗厌氧菌药物制剂的微生物或无菌检测方法，包括如下步骤：

（1）配制稀释液

配制1%-20%（w/v）环糊精水溶液：取1g-200g的环糊精，用1000ml水溶解，分装，灭菌;

（2）配制供试液

取抗厌氧菌药物制剂，转移至步骤（1）所得到环糊精水溶液中；

（3）薄膜过滤和冲洗

将步骤（2）得到的供试液进行薄膜过滤，然后用冲洗液冲洗滤膜；

（4）检查

按照《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ H无菌检验或J微生物限度检验所述检查法检查。

2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述抗厌氧菌药物选自硝基咪唑类药物，如：奥硝唑、甲硝唑、替硝唑、塞克硝唑、左旋或右旋奥硝唑；或抗厌氧药物，如喹诺酮类抗生素，包括左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星等；优选地，所述抗厌氧菌药物选自甲硝唑、替硝唑、奥硝唑或左旋奥硝唑、或莫西沙星、或加替沙星；特别优选地，选自奥硝唑或左旋奥硝唑。

3.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述抗厌氧菌药物制剂，其制剂类型选自注射剂、口服固体制剂、滴眼剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、洗剂、冲洗剂、擦剂、涂剂、或涂膜剂；优选地，选自注射剂或滴眼剂，更优选地，选自注射剂。

4.如权利要求1所述的检测方法，其中，稀释剂中所述环糊精选自α-环糊精或其衍生物、或β-环糊精或其衍生物，例如α-环糊精、β-环糊精、羟乙基β-环糊精、羟丙基β-环糊精、甲基β-环糊精、磺丁基β-环糊精、羧甲基β-环糊精、巯基β-环糊精、低聚乳酸基β-环糊精、羟丁基β-环糊精、或葡萄糖基氨基β-环糊精，优选地，选自羟丙基β-环糊精。

5.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述冲洗液选自0.9%（w/v）氯化钠溶液、0.1%（w/v）蛋白胨水溶液、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液或者含中和剂（3%聚山梨酯80和0.3%卵磷脂）的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，优选地，选自0.9%（w/v）氯化钠溶液。

6.一种抗厌氧药物的无菌检测方法如下：

（1）、配制稀释剂

配制1%-20%（w/v）羟丙基β-环糊精溶液：取1g-200g的羟丙基β-环糊精，用1000ml水溶解，分装，灭菌, 灭菌温度121℃，灭菌时间15min；

（2）、制备供试液

取抗厌氧菌药物制剂，平均分成两组，每组分别全部转移至羟丙基β-环糊精溶液中；

（3）、薄膜过滤和冲洗

将步骤（2）得到的供试液进行薄膜过滤，然后用0.9%氯化钠溶液分次冲洗；

（4）检查

以生孢梭菌为阳性对照菌，按照《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ H所述检查法检查。