CN110846377B - 一种药敏试剂盒及其制备方法以及细菌药敏检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药敏试剂盒及其制备方法以及细菌药敏检测方法，属于药物检测技术领域。本发明试剂盒包括药敏板、液体培养基和固体培养基平板；本发明选用常规和最新兽用药物制作药敏板，并根据不同的感染细菌配制不同的培养基平板，所制备的药敏试剂盒具有试验结果精确、耗时短、操作简便且成本低廉的特点，适合于规模化养殖场及基层兽医单位进行细菌性疫病的药敏试验，从而实现动物精准用药。

Description

一种药敏试剂盒及其制备方法以及细菌药敏检测方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，更具体的说是涉及一种药敏试剂盒及其制备方法以及细菌药敏检测方法。
背景技术
养殖场在动物生产中，部分存在滥用抗生素的情况，比如为了提高抗生素的预防和促生长效果，长时间、超剂量使用抗生素，导致动物体内菌群严重失调，加速了耐药菌株的产生和传递。随着人们食品安全意识的提高和对细菌耐药情况的日益重视，多种抗生素已经禁止在畜禽养殖中使用，因此，筛选对病原菌敏感的药物能够实现动物疾病用药的精准控制，既减少药物治疗的成本又减缓耐药菌株产生的速度。
目前用于微生物药敏检验的方法主要有纸片扩散法和稀释法。纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，通过细菌生长情况来判断细菌对纸片内药物成分的敏感性。此法在临床实验中存在操作繁琐、一次检测药物和样本数量有限、不能得到准确抑菌率的缺点。稀释法是将抗菌药物配成一定浓度后倍比稀释，向药液中加入定量的菌液并根据待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度来判断药物的最小抑菌浓度(MIC)。稀释法通常使用微生物药敏板进行，但目前产品的药敏板存在样式单一、包被药物种类有限、仅适用检测少量样本MIC的情况，不能满足各种类型细菌的药敏试验，也不能满足大量样本的检测需求
因此，提供一种药敏试剂盒及其制备方法以及细菌药敏检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种药敏试剂盒及其制备方法以及细菌药敏检测方法，解决了市售药敏检测产品中药物种类陈旧单一、操作繁琐、进行大批量检测时消耗材料过多的问题；本发明具有提高检测精准度、单次检测样本量大，适用于兽医临床的特点，能满足多种类型细菌检测需求。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种兽用细菌药物敏感性检测试剂盒，包括药敏板、液体培养基和固体培养基平板；
所述药敏板包被有适用于细菌药敏试验的药物；所述药物浓度为标准菌株的最小抑菌浓度；
所述液体培养基包括LB液体培养基、肉浸液肉汤培养基和脑心浸液肉汤培养基；
LB液体培养基用于大肠埃希菌增菌，肉浸液肉汤培养基用于金黄色葡萄球菌增菌，脑心浸液肉汤培养基用于链球菌增菌。
所述固体培养基平板包括普通营养琼脂培养基平板、麦康凯琼脂培养基平板、BP琼脂培养基平板和KF链球菌琼脂培养基平板；
普通营养琼脂培养基平板：用于已经确定类型细菌的增菌(即使用分离培养基对细菌进行分离鉴定后，若还需增菌，可使用此培养基作为辅助，减少鉴别培养基的使用)，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和链球菌均可在上面有不同程度的生长；麦康凯琼脂培养基平板：用于分离鉴定大肠埃希菌，大肠埃希菌在上面会生长为桃红色菌落；BP琼脂培养基平板：用于分离鉴定金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌在上面会生长为灰黑色至黑色有光泽的菌落；KF链球菌琼脂培养基平板：用于分离鉴定链球菌，链球菌在上面会生长为红色至粉红色中心的菌落。
进一步，所述药敏板包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；所述检测孔包被有适用于细菌药敏试验的药物。
进一步，所述药敏板包括板体和板盖；所述板体包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；所述板盖标识有与所述板体相对应的检测孔及药物浓度、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔。
进一步，所述药敏板包括大肠埃希菌药敏板、金黄色葡萄球菌药敏板和链球菌药敏板；
所述大肠埃希菌药敏板包被阿莫西林、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、头孢噻呋钠、土霉素、硫酸链霉素、硫酸新霉素、多西环素、甲氧苄啶、环丙沙星；
所述金黄色葡萄球菌药敏板包被青霉素、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、头孢噻呋钠、硫酸链霉素、硫酸新霉素、多西环素、甲氧苄啶、林可霉素、泰乐菌素；
所述链球菌药敏板包被青霉素、阿莫西林、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻呋钠、多西环素、甲氧苄啶、林可霉素、环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶、泰乐菌素。
进一步，一种兽用细菌药物敏感性检测试剂盒的制备方法，包括制备药敏板，制备液体培养基和制备固体培养基平板；
所述制备药敏板的步骤如下：向药敏板中加入适用于细菌药敏试验的药物和抗氧化包被液，热干燥并真空包装；
所述制备液体培养基的步骤如下：制备液体培养基，经高温高压灭菌后进行无菌包装，4℃保存；
所述制备固体培养基平板的步骤如下：配制固体培养基，制成平板，培养基凝固后进行真空包装，4℃保存。
进一步，所述药敏板为96孔板，具体如下：
Figure BDA0002301055360000031
其中，A1-H11区域为检测孔，每列包被适用于细菌药敏试验的不同药物；A12-B12为空白对照孔，加入液体LB培养基；D12-E12为阴性对照孔，加入灭活待测菌液；G12-H12为阳性对照孔，加入待测菌液；
阳性对照：对于多菌株的检测需求，可将待测菌株菌液混合后，加入阳性对照孔中(如，同时测8株大肠埃希菌的耐药性，则在向检测孔中加完对应菌液后，每种菌液吸取200μL至干净离心管或其他灭菌后容器中，充分混匀，再将混合的菌液吸取200μL分别加入两个阳性对照孔)。
阴性对照：用于排除死亡菌体沉淀对吸光度造成的影响和抑菌率的计算，所以加入的是当次检测菌株灭活后的菌液(与阳性对照相同，若检测多株菌，则将各份菌液均吸出200μL，混合后灭活，然后从灭活混合菌液中吸取200μL分别加入两个阴性对照孔)。
空白对照孔加入的是摇菌用培养基，目的是排除液体培养基被不当操作污染给实验结果带来的影响。
根据药物对不同细菌的最小抑菌浓度的4倍(即4MIC)作为稀释液浓度，并以不同稀释液浓度(针对不同菌株)中最大值的百倍浓度作为药敏板所用抗生素原液浓度(储存浓度)，将药物分别溶解于溶剂中；然后对抗生素原液进行稀释，具体如下：
Figure BDA0002301055360000041
Figure BDA0002301055360000051
其中，表中横线表示板内未包被此种药物；
使用无水乙醇溶解鼠尾草酚，配制好的溶液中鼠尾草酚浓度为0.2mg/mL，溶液除菌过滤后，得到包被液；
各药物对应的溶剂如下：
药物 溶剂 药物 溶剂 药物 溶剂
阿莫西林 水 头孢噻呋钠 水 多西环素 稀盐酸
氟苯尼考 二甲基亚砜 恩诺沙星 稀盐酸 甲氧苄啶 稀盐酸
土霉素 稀盐酸 硫酸链霉素 水 环丙沙星 水
替米考星 水 硫酸新霉素 水 青霉素 水
林可霉素 水 泰乐菌素 稀盐酸 庆大霉素 水
磺胺间甲氧嘧啶 稀盐酸  
制备药敏板：针对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌分别制备药敏板，检测孔包被不同的药物；向空白药敏板对应位置加入指定药物稀释液25μL，再加入25μL包被液，无菌条件下，50～60℃干燥处理12h，药敏板完全干燥后，使用真空包装机进行真空包装，于-20℃保存。
制备使用的空白96孔药敏板中各个孔位置与常规96孔板相同。本发明所述药敏板中药物稀释加样位置如下：
Figure BDA0002301055360000052
Figure BDA0002301055360000061
进一步，所述LB液体培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L，pH值为7.0～7.4；
所述肉浸液肉汤培养基包括以下浓度的组分：牛肉粉3g/L、氯化钠5g/L、蛋白胨12g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH值为7.4～7.6；
所述脑心浸液肉汤培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，pH值为7.2～7.6；
所述普通营养琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH值为7.0～7.4；
所述麦康凯琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨20g/L、乳糖10.0g/L、牛胆盐5.0g/L、氯化钠5.0g/L、中性红0.075g/L、琼脂13.0g/L，pH值为7.2～7.6；
所述BP琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏5.0g/L、酵母提取物1.0g/L、丙酮酸钠10.0g/L、甘氨酸12.0g/L、氯化锂5.0g/L、琼脂15.0g/L、卵黄亚碲酸钾5ml/L，pH值为7.0～7.4；
所述KF链球菌琼脂培养基包括以下浓度的组分：3号月示蛋白胨10g/L、麦芽糖20g/L、乳糖1g/L、酵母膏10g/L、氯化钠5g/L、叠氮化钠0.4g/L、甘油磷酸钠10g/L、氯化三苯基四氮唑0.1g/L、溴甲酚紫0.015g/L、琼脂15g/L，pH值为7.0～7.4。
进一步，一种细菌药敏检测方法，使用上述试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)无菌采集病料病变组织接种到对应培养基平板，使病变组织中的细菌样本接种至培养基平板，接种后的平板置于36～38℃条件下培养，12～16h后观察细菌生长形态，并挑取形态特征符合要求的的菌落接种于液体LB培养基，36～38℃、160～180rpm条件下培养，10～12h后获得菌液；
(2)使用液体LB培养基稀释菌液，调整菌液在630nm下的吸光度值为0.2～0.4，之后取200μL菌液与9.8mL液体LB培养基混合，得到细菌浓度约为1×106的药敏检测用初始菌液；
(3)制备药敏板，药敏板加入药液后于50-60℃无菌热干燥，干燥后真空包装，于-20℃保存；
(4)根据检测需要，向药敏板对应检测孔和阳性对照孔滴加100μL稀释菌液(药敏板内加入指定药物稀释液25μL，药物稀释液浓度为4MIC。经烘干后，加入100μL稀释菌液，则药敏板内药物浓度为对各菌株的最小抑菌浓度MIC)，轻微震荡使药敏板底部药物充分与菌液接触；
本发明所述药敏板加入菌液后，板内药物浓度如下：单位(μg/mL)
大肠埃希菌药敏板：
Figure BDA0002301055360000081
金黄色葡萄球菌药敏板：
Figure BDA0002301055360000082
链球菌药敏板：
Figure BDA0002301055360000083
加样完成后的15～30min内，将药敏板置于36～38℃条件下培养，8～10h后测定检测孔吸光度，并依据吸光度值直接判断病料组织中细菌对检测孔中所含药物成分的敏感性，或将吸光度值代入公式计算，得到检测孔中所含药物成分对病料组织中细菌的具体抑菌率；
抑菌率计算公式为：
抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％；
判定标准：抑菌率>90％为对药物敏感(S)，抑菌率70～90％为对药物中度敏感(I)，抑菌率<70％为对药物不敏感(R)。
进一步，药敏板培养后进行抑菌率计算时，板内阳性对照吸光度值大于阴性对照吸光度值，且空白对照吸光度值小于阴性对照时，才能对检测结果进行判定；若阳性对照吸光度值过小，表明测试菌体自然死亡，不能进行结果判定，应重新摇菌、稀释菌液进行试验。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种药敏试剂盒及其制备方法以及细菌药敏检测方法，选用常规和最新兽用药物制作药敏板，并根据不同的感染细菌配制不同的培养基平板，所制备的药敏试剂盒具有试验结果精确、耗时短、操作简便且成本低廉的特点，适合于规模化养殖场及基层兽医单位进行细菌性疫病的药敏试验，从而实现动物精准用药。本发明的试剂盒包括灭菌封装的液体培养基和固体培养基平板，可以随时取用，避免现配现用造成的时间浪费；且本发明同时制备三种药敏板：大肠埃希菌药敏板、金黄色葡萄球菌药敏板和链球菌药敏板，每种药敏板包被11种药物，可以同时鉴定3种细菌，以及同时筛选最佳药物，能够充分节约时间，快速制定用药方案，及时防治相关细菌性疫病，减轻规模化养殖场损失。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种兽用细菌药物敏感性检测试剂盒，包括药敏板、液体培养基和固体培养基平板；
药敏板包括板体和板盖；板体包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；板盖标识有与所述板体相对应的检测孔及药物浓度、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔。
药敏板包括大肠埃希菌药敏板、金黄色葡萄球菌药敏板和链球菌药敏板；
大肠埃希菌药敏板包被阿莫西林、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、头孢噻呋钠、土霉素、硫酸链霉素、硫酸新霉素、多西环素、甲氧苄啶、环丙沙星；
金黄色葡萄球菌药敏板包被青霉素、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、头孢噻呋钠、硫酸链霉素、硫酸新霉素、多西环素、甲氧苄啶、林可霉素、泰乐菌素；
链球菌药敏板包被青霉素、阿莫西林、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻呋钠、多西环素、甲氧苄啶、林可霉素、环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶、泰乐菌素。
液体培养基包括LB液体培养基、肉浸液肉汤培养基和脑心浸液肉汤培养基；LB液体培养基用于大肠埃希菌增菌，肉浸液肉汤培养基用于金黄色葡萄球菌增菌，脑心浸液肉汤培养基用于链球菌增菌。
固体培养基平板包括普通营养琼脂培养基平板、麦康凯琼脂培养基平板、BP琼脂培养基平板和KF链球菌琼脂培养基平板；
普通营养琼脂培养基平板：用于已经确定类型细菌的增菌(即使用分离培养基对细菌进行分离鉴定后，若还需增菌，可使用此培养基作为辅助，减少鉴别培养基的使用)，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和链球菌均可在上面有不同程度的生长；麦康凯琼脂培养基平板：用于分离鉴定大肠埃希菌，大肠埃希菌在上面会生长为桃红色菌落；BP琼脂培养基平板：用于分离鉴定金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌在上面会生长为灰黑色至黑色有光泽的菌落；KF链球菌琼脂培养基平板：用于分离鉴定链球菌，链球菌在上面会生长为红色至粉红色中心的菌落。
实施例2
一种兽用细菌药物敏感性检测试剂盒的制备方法，包括制备药敏板，制备液体培养基和制备固体培养基平板；
制备药敏板的步骤如下：向药敏板中加入适用于细菌药敏试验的药物和抗氧化包被液，热干燥并真空包装；
药敏板为96孔板，具体如下：
Figure BDA0002301055360000111
其中，A1-H11区域为检测孔，每列包被适用于细菌药敏试验的不同药物；A12-B12为空白对照孔，加入液体LB培养基；D12-E12为阴性对照孔，加入灭活待测菌液；G12-H12为阳性对照孔，加入待测菌液；
阳性对照：对于多菌株的检测需求，可将待测菌株菌液混合后，加入阳性对照孔中(如，同时测8株大肠埃希菌的耐药性，则在向检测孔中加完对应菌液后，每种菌液吸取200μL至干净离心管或其他灭菌后容器中，充分混匀，再将混合的菌液吸取200μL分别加入两个阳性对照孔)。
阴性对照：用于排除死亡菌体沉淀对吸光度造成的影响和抑菌率的计算，所以加入的是当次检测菌株灭活后的菌液(与阳性对照相同，若检测多株菌，则将各份菌液均吸出200μL，混合后灭活，然后从灭活混合菌液中吸取200μL分别加入两个阴性对照孔)。
空白对照孔加入的是摇菌用培养基，目的是排除液体培养基被不当操作污染给实验结果带来的影响。
根据药物对不同细菌的最小抑菌浓度的4倍(即4MIC)作为稀释液浓度，并以不同稀释液浓度(针对不同菌株)中最大值的百倍浓度作为药敏板所用抗生素原液浓度(储存浓度)，将药物分别溶解于溶剂中；然后对抗生素原液进行稀释，具体如下：
Figure BDA0002301055360000121
其中，表中横线表示板内未包被此种药物；
使用无水乙醇溶解鼠尾草酚，配制好的溶液中鼠尾草酚浓度为0.2mg/mL，溶液除菌过滤后，得到包被液；
各药物对应的溶剂如下：
药物 溶剂 药物 溶剂 药物 溶剂
阿莫西林 水 头孢噻呋钠 水 多西环素 稀盐酸
氟苯尼考 二甲基亚砜 恩诺沙星 稀盐酸 甲氧苄啶 稀盐酸
土霉素 稀盐酸 硫酸链霉素 水 环丙沙星 水
替米考星 水 硫酸新霉素 水 青霉素 水
林可霉素 水 泰乐菌素 稀盐酸 庆大霉素 水
磺胺间甲氧嘧啶 稀盐酸  
制备药敏板：针对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌分别制备药敏板，检测孔包被不同的药物；向空白药敏板对应位置加入指定药物稀释液25μL，再加入25μL包被液，无菌条件下，50～60℃干燥处理12h，药敏板完全干燥后，使用真空包装机进行真空包装，于-20℃保存。
制备使用的空白96孔药敏板中各个孔位置与常规96孔板相同。本发明药敏板中药物稀释加样位置如下：
Figure BDA0002301055360000131
Figure BDA0002301055360000141
制备液体培养基的步骤如下：
液体LB培养基包含以下组分：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.0～7.4，之后121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至室温，一瓶5mL分装入高压灭菌后的玻璃瓶中并用封口膜密封，每个药敏试剂盒中配有50mL，共10瓶。
肉浸液肉汤培养基包含以下组分：牛肉粉3g/L、氯化钠5g/L、蛋白胨12g/L、磷酸氢二钾2g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.4～7.6，之后121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至室温，一瓶5mL分装入高压灭菌后的玻璃瓶中并用封口膜密封，每个药敏试剂盒中配有50mL，共10瓶。
脑心浸液肉汤包括以下组分：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.2～7.6，之后121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至室温，一瓶5mL分装入高压灭菌后的玻璃瓶中并用封口膜密封，每个药敏试剂盒中配有50mL，共10瓶。
制备固体培养基平板的步骤如下：
普通营养琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.0～7.4。配制的营养琼脂培养基制作营养琼脂平板的操作如下：配置好的营养琼脂培养基121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至60℃时倾倒于一次性平皿中(每皿倾倒15～20mL)，培养基凝固后既成营养琼脂平板。平板4皿一扎进行真空包装，每个药敏试剂盒中放置2扎，即8个平皿。
麦康凯琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨20.0g/L、乳糖10.0g/L、牛胆盐5.0g/L、氯化钠5.0g/L、中性红0.075g/L以及琼脂13.0g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.2～7.6。配制的麦康凯琼脂培养基制作麦康凯琼脂平板的操作如下：配置好的麦康凯琼脂培养基121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至60℃时倾倒于一次性平皿中(每皿倾倒15～20mL)，培养基凝固后既成麦康凯琼脂平板。平板4皿一扎进行真空包装，每个药敏试剂盒中放置2扎，即8个平皿。
BP琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏5.0g/L、酵母提取物1.0g/L、丙酮酸钠10.0g/L、甘氨酸12.0g/L、氯化锂5.0g/L、琼脂15.0g/L，培养基煮沸冷却后调节pH值为7.0～7.4。配制的BP琼脂培养基制作BP琼脂平板的操作如下：配制好的BP琼脂培养基121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至60℃时加入5mL卵黄亚碲酸钾，充分摇匀后倾倒于一次性平皿中(每皿倾倒15～20mL)，培养基凝固后既成BP琼脂平板。平板4皿一扎进行真空包装，每个药敏试剂盒中放置2扎，即8个平皿。
KF链球菌琼脂培养基，包括以下组分：3号月示蛋白胨10g/L，麦芽糖20g/L，乳糖1g/L，酵母膏10g/L，氯化钠5g/L，叠氮化钠0.4g/L，甘油磷酸钠10g/L，氯化三苯基四氮唑0.1g/L，溴甲酚紫0.015g/L，琼脂15g/L；KF链球菌培养基的pH值为7.0～7.4。配制的KF链球菌琼脂培养基制作KF链球菌琼脂平板的操作如下：配置好的KF链球菌琼脂培养基121℃高压灭菌15min，紫外下放置冷却至60℃时倾倒于一次性平皿中(每皿倾倒15～20mL)，培养基凝固后既成KF链球菌琼脂平板。平板4皿一扎进行真空包装，每个药敏试剂盒中放置2扎，即8个平皿。
实施例3
一种细菌药敏检测方法，使用上述试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)无菌采集病料病变组织接种到对应培养基平板，使病变组织中的细菌样本接种至培养基平板，接种后的平板置于36～38℃条件下培养，12～16h后观察细菌生长形态，并挑取形态特征符合要求的的菌落接种于液体LB培养基，36～38℃、160～180rpm条件下培养，10～12h后获得菌液；
(2)使用液体LB培养基稀释菌液，调整菌液在630nm下的吸光度值为0.2～0.4，之后取200μL菌液与9.8mL液体LB培养基混合，得到细菌浓度约为1×106的药敏检测用初始菌液；
(3)制备药敏板，药敏板加入药液后于50-60℃无菌热干燥，干燥后真空包装，于-20℃保存；
(4)根据检测需要，向药敏板对应检测孔和阳性对照孔滴加100μL稀释菌液(药敏板内加入指定药物稀释液25μL，药物稀释液浓度为4MIC，加入100μL稀释菌液，药敏板内药物浓度为对各菌株的最小抑菌浓度MIC)，轻微震荡使药敏板底部药物充分与菌液接触；
本发明所述药敏板加入菌液后，板内药物浓度如下：单位(μg/mL)
大肠埃希菌药敏板：
Figure BDA0002301055360000161
金黄色葡萄球菌药敏板：
Figure BDA0002301055360000162
链球菌药敏板：
Figure BDA0002301055360000171
加样完成后的15～30min内，将药敏板置于36～38℃条件下培养，8～10h后测定检测孔吸光度，并依据吸光度值直接判断病料组织中细菌对检测孔中所含药物成分的敏感性，或将吸光度值代入公式计算，得到检测孔中所含药物成分对病料组织中细菌的具体抑菌率；
抑菌率计算公式为：
抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％；
判定标准：抑菌率>90％为对药物敏感(S)，抑菌率70～90％为对药物中度敏感(I)，抑菌率<70％为对药物不敏感(R)。
进一步，药敏板培养后进行抑菌率计算时，板内阳性对照吸光度值大于阴性对照吸光度值，且空白对照吸光度值小于阴性对照时，才能对检测结果进行判定；若阳性对照吸光度值过小，表明测试菌体自然死亡，不能进行结果判定，应重新摇菌、稀释菌液进行试验。
实验例
利用三种药敏板与商品化药敏纸片，检测7株野生大肠埃希菌/金黄色葡萄球菌/链球菌对11种抗菌药物的敏感性，同时以标准菌株药敏结果作为药敏板与商品化纸片的效果控制组；
大肠埃希菌组：
纸片法药敏结果如下(敏感—S，中介—I，耐药—R)：
Figure BDA0002301055360000181
使用药敏板进行试验后，根据吸光度值计算得到抑菌率如下：
Figure BDA0002301055360000182
注：表中最后一列为对照列，对照列吸光度值均为两对照孔吸光度的平均值。其中空白对照孔(A12-B12)内加入的是稀释菌液用的液体LB培养基，测定吸光度为0.0418，阴性对照孔(D12-E12)内加入的是100μL灭活菌液，测定吸光度为0.0874，阳性对照孔(G12-H12)内加入的是100μL待测菌液，吸光度为0.4216。抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％。抑菌率>90％，细菌对板内包被药物敏感性为敏感(S)；90％>抑菌率>80％，细菌对板内药物敏感性为中介(I)；抑菌率<80％，细菌对板内包被药物敏感性为耐药(R)。其中标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922。
金黄色葡萄球菌组：
纸片法药敏结果如下(敏感—S，中介—I，耐药—R)：
Figure BDA0002301055360000191
使用药敏板进行试验后，根据吸光度值计算得到抑菌率如下：
Figure BDA0002301055360000192
Figure BDA0002301055360000201
注：表中最后一列为对照列，对照列吸光度值均为两对照孔吸光度的平均值。其中空白对照孔(A12-B12)内加入的是稀释菌液用的液体LB培养基，测定吸光度为0.0628，阴性对照孔(D12-E12)内加入的是100μL灭活菌液，测定吸光度为0.0840，阳性对照孔(G12-H12)内加入的是100μL待测菌液，吸光度为0.6013。抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％。抑菌率>90％，细菌对板内包被药物敏感性为敏感(S)；90％>抑菌率>80％，细菌对板内药物敏感性为中介(I)；抑菌率<80％，细菌对板内包被药物敏感性为耐药(R)。其中标准菌株为金黄色葡萄球菌标准株ATCC29213。
链球菌组：
纸片法药敏结果如下(敏感—S，中介—I，耐药—R)：
Figure BDA0002301055360000202
使用药敏板进行试验后，根据吸光度值计算得到抑菌率如下：
Figure BDA0002301055360000211
注：表中最后一列为对照列，对照列吸光度值均为两对照孔吸光度的平均值。其中空白对照孔(A12-B12)内加入的是稀释菌液用的液体LB培养基，测定吸光度为0.0495，阴性对照孔(D12-E12)内加入的是100μL灭活菌液，测定吸光度为0.0736，阳性对照孔(G12-H12)内加入的是100μL待测菌液，吸光度为0.5584。抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％。抑菌率>90％，细菌对板内包被药物敏感性为敏感(S)；90％>抑菌率>80％，细菌对板内药物敏感性为中介(I)；抑菌率<80％，细菌对板内包被药物敏感性为耐药(R)。其中标准菌株为肺炎链球菌标准株ATCC49619。
经验证，使用本发明计算得到的抑菌率与商品化药敏纸片得到的细菌敏感性结果一致，建立的适用于药敏板的细菌药敏检测方法具有很强实用性。
本发明实施例提供的药敏试剂盒，设有分别由16种药物对应制作而成的3种细菌药物敏感性药敏板以及针对不同细菌配制的分离鉴定培养基，解决了市售药敏检测产品的药种陈旧单一、试验耗费材料多、操作繁琐以及试验结果不精确的问题；试剂盒中自制药敏板的包被药物选用国内外知名动保企业的常规和最新16种人/兽用药物，具备同时检测大批量样本对多种抗菌药物敏感性的特点，并提供了能够计算具体抑菌率的公式，改进了稀释法药敏试验中通过眼观测定药物敏感性导致的实验结果不精确的问题，能为规模化养殖场、基层兽医单位提供方便、准确的药敏检测器材，为科研单位提供兽用大样本药敏统计分析的基础材料。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种兽用细菌药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，包括药敏板、液体培养基和固体培养基平板；
所述药敏板包被有适用于细菌药敏试验的药物；所述药物浓度为标准菌株的最小抑菌浓度；
所述液体培养基包括LB液体培养基、肉浸液肉汤培养基和脑心浸液肉汤培养基；
所述固体培养基平板包括普通营养琼脂培养基平板、麦康凯琼脂培养基平板、BP琼脂培养基平板和KF链球菌琼脂培养基平板；
所述药敏板包括大肠埃希菌药敏板、金黄色葡萄球菌药敏板和链球菌药敏板；
所述大肠埃希菌药敏板包被阿莫西林、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、庆大霉素、土霉素、硫酸链霉素、硫酸新霉素、多西环素、甲氧苄啶、环丙沙星；
所述金黄色葡萄球菌药敏板包被青霉素、氟苯尼考、替米考星、恩诺沙星、头孢噻呋钠、硫酸链霉素、硫酸新霉素、多西环素、甲氧苄啶、林可霉素、泰乐菌素；
所述链球菌药敏板包被青霉素、阿莫西林、氟苯尼考、恩诺沙星、头孢噻呋钠、多西环素、甲氧苄啶、林可霉素、环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶、泰乐菌素；
所述药敏板为96孔板，具体如下：
Figure FDA0004082581250000011
其中，A1-H11区域为检测孔，每列包被适用于细菌药敏试验的不同药物；A12-B12为空白对照孔，加入液体LB培养基；D12-E12为阴性对照孔，加入灭活待测菌液；G12-H12为阳性对照孔，加入待测菌液；
根据药物对不同细菌的最小抑菌浓度的4倍作为稀释液浓度，并以不同稀释液浓度中最大值的百倍浓度作为药敏板所用抗生素原液浓度，将药物分别溶解于溶剂中；然后对抗生素原液进行稀释，具体如下：
Figure FDA0004082581250000021
其中，表中横线表示板内未包被此种药物；
使用无水乙醇溶解鼠尾草酚，配制好的溶液中鼠尾草酚浓度为0.2mg/mL，溶液除菌过滤后，得到包被液；
制备药敏板：针对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌分别制备药敏板，检测孔包被不同的药物；向空白药敏板对应位置加入指定药物稀释液25μL，再加入25μL包被液，无菌条件下，50～60℃干燥处理12h，药敏板完全干燥后，使用真空包装机进行真空包装，于-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种兽用细菌药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，所述药敏板包括板体和板盖；所述板体包括检测孔、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔；所述板盖标识有与所述板体相对应的检测孔及药物浓度、阳性对照孔、阴性对照孔和空白对照孔。
3.根据权利要求1所述的一种兽用细菌药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，
所述LB液体培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L，pH值为7.0～7.4；
所述肉浸液肉汤培养基包括以下浓度的组分：牛肉粉3g/L、氯化钠5g/L、蛋白胨12g/L，磷酸氢二钾2g/L，pH值为7.4～7.6；
所述脑心浸液肉汤培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，pH值为7.2～7.6；
所述普通营养琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH值为7.0～7.4；
所述麦康凯琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨20g/L、乳糖10.0g/L、牛胆盐5.0g/L、氯化钠5.0g/L、中性红0.075g/L、琼脂13.0g/L，pH值为7.2～7.6；
所述BP琼脂培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏5.0g/L、酵母提取物1.0g/L、丙酮酸钠10.0g/L、甘氨酸12.0g/L、氯化锂5.0g/L、琼脂15.0g/L、卵黄亚碲酸钾5ml/L，pH值为7.0～7.4；
所述KF链球菌琼脂培养基包括以下浓度的组分：3号
Figure FDA0004082581250000031
蛋白胨10g/L、麦芽糖20g/L、乳糖1g/L、酵母膏10g/L、氯化钠5g/L、叠氮化钠0.4g/L、甘油磷酸钠10g/L、氯化三苯基四氮唑0.1g/L、溴甲酚紫0.015g/L、琼脂15g/L，pH值为7.0～7.4。
4.一种细菌药敏检测方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一项所述的试剂盒进行检测，具体步骤如下：
(1)无菌采集病料病变组织接种到对应培养基平板，使病变组织中的细菌样本接种至培养基平板，接种后的平板置于36～38℃条件下培养，12～16h后观察细菌生长形态，并挑取形态特征符合要求的的菌落接种于液体LB培养基，36～38℃、160～180rpm条件下培养，10～12h后获得菌液；
(2)使用液体LB培养基稀释菌液，调整菌液在630nm下的吸光度值为0.2～0.4，之后取200μL菌液与9.8mL液体LB培养基混合，得到细菌浓度为1×106的药敏检测用初始菌液；
(3)根据检测需要，向所述药敏板对应检测孔和阳性对照孔滴加100μL稀释菌液，轻微震荡使药敏板底部药物充分与菌液接触，完成后的15～30min内，将药敏板置于36～38℃条件下培养，8～10h后测定检测孔吸光度，将吸光度值代入公式计算，得到检测孔中所含药物成分对病料组织中细菌的具体抑菌率；
抑菌率(％)＝[(A阳-A阴)-(A样-A阴)]/(A阳-A阴)×100％；
判定标准：抑菌率>90％为对药物敏感，抑菌率70～90％为对药物中度敏感，抑菌率<70％为对药物不敏感。
5.根据权利要求4所述的一种细菌药敏检测方法，其特征在于，药敏板培养后进行抑菌率计算时，板内阳性对照吸光度值大于阴性对照吸光度值，且空白对照吸光度值小于阴性对照时，才能对检测结果进行判定；若阳性对照吸光度值过小，表明测试菌体自然死亡，不能进行结果判定，应重新摇菌、稀释菌液进行试验。
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