CN115531395B - 脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用，属于生物制药技术领域。本发明首次证明脱氧胆酸具有良好的抑制婴儿链球菌活性，提供了脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌产品中的应用，为婴儿链球菌引起的疾病提供了新思路。

Description

脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用。
背景技术
据国外报道，老年人急性脑梗死病人或者呼吸道感染SARS-CoV-2的病人的粪便婴儿链球菌(streptococcus_infantis)丰度均升高，说明婴儿链球菌与疾病相关([1]Analysis of microbiota in elderly patients with acute cerebral infarction.[2]Depicting SARS-CoV-2 faecal viral activity in association with gut microbiotacomposition in patients with COVID-19)。因此开发针对婴儿链球菌的药物具有重要的参考价值。
胆汁酸是胆汁里的一个有效成分，是参与胆汁消化功能的重要成分之一。其含量变化在肝脏病诊断中具有重要的参考价值，此外还具有抑制肿瘤的效果。脱氧胆酸是肠道中最重要的次级胆汁酸之一，但是目前未见脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌产品中应用的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用，脱氧胆酸具有良好的抑制婴儿链球菌的活性，为防控婴儿链球菌引起的各种疾病提供了新手段。
本发明提供了脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用。
优选的，所述产品包括婴儿链球菌的抑菌剂。
优选的，所述婴儿链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对婴儿链球菌的MIC50为9.706μg/ml。
本发明提供了脱氧胆酸在制备预防和/或治疗由婴儿链球菌引起的疾病的药物中的应用。
优选的，所述与婴儿链球菌相关的疾病包括急性脑梗死和/或者新冠肺炎。
优选的，所述脱氧胆酸的结构式如式I所示；
优选的，所述婴儿链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对婴儿链球菌的MIC50为9.706μg/ml。
本发明提供了脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用。本发明采用体外抗菌活性测试首次证明脱氧胆酸对婴儿链球菌具有良好的抗菌活性，通过检测抑制50％受试菌所需最低抑菌浓度，结果表明，脱氧胆酸对受试的婴儿链球菌的MIC50为9.706μg/ml。这说明本发明为临床预防和/或治疗婴儿链球菌引起的各种疾病提供了新的技术手段。
附图说明
图1为脱氧胆酸浓度与婴儿链球菌生长抑制率关系图；
图2为脱氧胆酸浓度与咽颊炎链球菌生长抑制率关系图。
具体实施方式
本发明提供了脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用。
在本发明中，所述脱氧胆酸的CAS为83-44-3，分子式：C24H40O4，分子量：392.57，英文名称：deoxycholic acid，熔点：172-178℃。所述脱氧胆酸的结构式优选如式I所示；在本发明实施例中，所述脱氧胆酸购自Sigma公司，产品编号为30960。
在本发明中，所述产品优选包括婴儿链球菌的抑菌剂。所述婴儿链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对婴儿链球菌的MIC50为9.706μg/ml。所述婴儿链球菌的抑菌剂的溶剂优选为乙醇。
本发明提供了脱氧胆酸在制备预防和/或治疗由婴儿链球菌引起的疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述由婴儿链球菌引起的疾病优选包括以下一种或几种疾病：新生儿败血症、脑膜炎和肺炎。
本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的剂型即可，例如注射剂或粉剂。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。所述婴儿链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对婴儿链球菌的MIC50为9.706μg/ml。
下面结合实施例对本发明提供的脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
药品来源说明
1.供试品
名称：脱氧胆酸，市售品。
分子量：392.57g/mol。
产品编号：30960；品牌：Sigma。
供试品临用前用乙醇配制成最大浓度20mg/mL，依次对倍稀释。
2.对照品
名称：氯霉素，市售品。
产品编号：56757；品牌：MACKLIN。
实施例1
测试菌株及其培养方法
1.菌株：婴儿链球菌ATCC 700779
2.菌种来源：购于北京百欧博伟生物技术有限公司。
3.培养条件：Brain-Heart Infusion(BHI)，37℃孵育24h-48h。
4.菌种开启接种并培养
用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量(2-3滴)无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，用无菌吸管吸取0.3ml的无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在哥伦比亚血琼脂培养基上，37℃培养24小时后，挑取单个菌落于液体培养基中在相同的培养条件下培养增菌。
5.菌液工作液的准备
当OD600值达到0.5左右(约109CFU/ml)，经BHI肉汤梯度稀释(0、10、100、1 000、10000、100000、10000倍)后，取100μL菌悬液接种于固体培养基上，培养24h后计数活菌数，计算菌悬液浓度，再将此混悬菌液进行稀释，使菌悬液最终浓度约为2×106CFU/ml。菌种操作均在无菌条件下进行，实验完毕，所有耗材经灭菌再做丢弃处理。
实施例2
抑制50％受试菌所需最低抑菌浓度的测定(MIC50)
1.测试方法：采取微量肉汤稀释法，进行MIC50的测定
实验分为阳性对照组(即不含药物的菌悬液)、阴性对照组(含溶媒乙醇的培养基)和实验组(含不同浓度的脱氧胆酸菌悬液)。以上各组均设置3个平行组。将浓度为400μg/ml的脱氧胆酸实验液按对倍稀释溶于液体培养基中，使其终浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、0μg/ml。浓度为2×106CFU·mL-1菌悬液与各组药液按比例1：1各100μL，分别接种于无菌96孔板中，使菌悬液的终浓度为1×106CFU/ml(含105CFU/孔)，置于适当的培养条件下培养20h。同时设置对照品氯霉素，使其终浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0μg/ml。培养结束后，在黑色背景下进行肉眼观察，平皿内未见细菌生长的最低药物浓度即为脱氧胆酸的最低抑菌浓度(MIC)。所有菌种的IC测定实验重复3次。悬浮菌体测OD600值，不同浓度的供试品及对照抑菌率按照公式I计算得到。通过曲线拟合得函数计算而得MIC50。
抑菌率(％)＝1-(供试品OD值—阴性对照OD值)/(阳性对照OD值—阴性对照OD值)×100％ 公式I
2.结果判断
本次试验结果见表1，抑制率图见图1。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长，试验才有意义。
表1不同浓度脱氧胆酸对婴儿链球菌生长影响的吸光值测定
结果显示，阳性对照孔(即不含药物)内细菌正常生长，溶媒对照培养基孔无菌生长。对照品氯霉素对缓症链球菌的MIC值为4μg/ml，符合美国临床实验室标准化委员会(National committee for clinical library standardization,NCCLS)2001年的《抗微生物药物敏感试验的执行标准：第十一版信息增刊》M100-S11中氯霉素对缓症链球菌≤4μg/ml的标准，说明本实验方法是可靠的。
统计结果表明：脱氧胆酸对受试的婴儿链球菌的MIC50为9.706μg/ml。结果表明，脱氧胆酸有良好的抑制婴儿链球菌活性，研究结果以期为临床医生防控婴儿链球菌提供参考。
对比例1
一.测试菌株及其培养方法
1.菌株：咽颊炎链球菌ATCC 9895
2.菌种来源：购于购于宁波明舟生物科技有限公司。
3.培养条件：Brain-HeartInfusion(BHI)，37℃孵育24h～48h。
4.菌种开启接种并培养
用浸过75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量(2-3滴)无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，用无菌吸管吸取0.3ml的无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上，37℃培养24小时后，挑取单个菌落于液体培养基中在相同的培养条件下培养增菌。
5.菌液工作液的准备
当OD600值达到0.4左右(约108CFU/ml)，经BHI肉汤梯度稀释(0、10、100、1000、10000、100000、10000倍)后，取100μL菌悬液接种于固体培养基上，培养24h后计数活菌数，计算菌悬液浓度，再将此混悬菌液进行稀释，使菌悬液最终浓度约为2×106CFU/ml。菌种操作均在无菌条件下进行，实验完毕，所有耗材经灭菌再做丢弃处理。
二.不同浓度的脱氧胆酸对不同受试菌的抑菌率测定
1.测试方法：采取微量肉汤稀释法，进行抑菌率的测定
实验分为阳性对照组(即不含药物的菌悬液)、阴性对照组(含溶媒乙醇的培养基)和实验组(含不同浓度的脱氧胆酸菌悬液)。以上各组均设置3个平行组。将浓度为400μg/ml的脱氧胆酸实验液按对倍稀释溶于液体培养基中，使其终浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、0μg/ml。浓度为2×106CFU·mL-1菌悬液与各组药液按比例1：1各100μL，分别接种于无菌96孔板中，使菌悬液的终浓度为1×106CFU/ml(含105CFU/孔)，置于适当的培养条件下培养20h。同时设置对照品氯霉素，使其终浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0μg/ml。培养结束后，在黑色背景下进行肉眼观察，平皿内未见细菌生长的最低药物浓度即为脱氧胆酸的最低抑菌浓度(MIC)。所有菌种的抑制率测定实验重复3次。悬浮菌体测OD600值，不同浓度的供试品及对照抑菌率按照公式I计算得到。
2.结果判断
试验结果见表2，抑制率图见图2。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长，试验才有意义。
表2脱氧胆酸对咽颊炎链球菌生长影响的吸光值测定
结果显示，阳性对照孔(即不含药物)内细菌正常生长，溶媒对照培养基孔无菌生长。对照品氯霉素对缓症链球菌的MIC值为4μg/ml，符合美国临床实验室标准化委员会(National committee for clinical library standardization,NCCLS)2001年的《抗微生物药物敏感试验的执行标准：第十一版信息增刊》M100-S11中氯霉素对缓症链球菌≤4μg/ml的标准，说明本实验方法是可靠的。
统计结果表明：当脱氧胆酸浓度为100μg/ml时，其对受试的咽颊炎链球菌的抑制率为61.90％。
可见，脱氧胆酸对不同种类的菌的抑制活性表现出较大的差异。当脱氧胆酸浓度为100μg/ml时，其对受试的婴儿链球菌的抑制率为97.82％，而其对受试的咽颊炎链球菌的抑制率为61.90％。这表明脱氧胆酸对婴儿链球菌的抑菌活性显著优于咽颊炎链球菌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.脱氧胆酸在制备抗婴儿链球菌的产品中的应用，所述产品包括婴儿链球菌的抑菌剂。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述婴儿链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对婴儿链球菌的MIC50为9.706μg/ml。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述脱氧胆酸的结构式如式I所示；
式I。
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口腔連鎖球菌の生育ならびにグルカン生成に及ぼす胆汁酸の影響;石川康子等;《口腔衛生学会雑誌》;第34卷(第2期);第97-103页，第98页右栏第1、5-6段，图1，表1 *

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