CN115531394B - 脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用,属于生物制药技术领域。本发明通过体外抗菌活性测试首次证实脱氧胆酸具有良好的抑制缓症链球菌活性的作用,因此脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用,又鉴于缓症链球菌引起中毒性休克综合征、亚急性心内膜炎、前列腺炎、肺炎、心包炎、腹膜炎等多种疾病,因此,本发明为制备预防和/或治疗缓症链球菌引起的疾病提供了新的治疗思路。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,具体涉及脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用。
背景技术
缓症链球菌属于α-溶血性链球菌(亦称甲型溶血性链球菌),通常是人体口腔、消化道、生殖道等部位的正常菌群之一,该菌是一种条件致病菌,可致中毒性休克综合征,亚急性心内膜炎,前列腺炎等,此外,还可致肺炎、心包炎、腹膜炎、唾腺炎、口面部感染、牙源性感染、中耳炎、鼻窦炎等([1]:姚秋菊,王辉,季洪健,等.多耐药缓症链球菌致多发性肺脓肿1例报道[J].临床肺科杂志,2012,17(11):2124-2125.[2]朱白,姜夕南,王华雨,等.缓症链球菌中毒性休克综合征的临床研究[J].江苏医药,199925(12):918-919.[3]李仲兴,张新华.缓症链球菌心内膜炎病例报告[J].中国感染控制杂志,2007,6(3):209-210.[4]庄涛,江丽娅,史兴军.前列腺液中分离到5株缓症链球菌报告[J].实验与检验医学,2010,28(4):428)。据报道在发病猪体内分离到此病原菌,并且导致仔猪发病和死亡严重,说明缓症链球菌对猪也是有致病性。在儿科常用抗生素中,缓症链球菌对氨曲南、头孢曲松、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸钾均有不同程度耐药,耐药率为42.3%~48.1%不等。这些抗生素目前仍然是儿童肺炎的常用药物。细菌耐药是全球问题,但相应的抗生素的开发则进展缓慢,形式非常严峻,因此迫切需要一种新的抗菌药物或抗菌产品来抑制该种细菌。
胆汁酸是胆汁里的一个有效成分,是参与胆汁消化功能的重要成分之一。其含量变化在肝脏病诊断中具有重要的参考价值,此外还具有抑制肿瘤的效果。脱氧胆酸是肠道中最重要的次级胆汁酸之一,但是目前未见脱氧胆酸在制备缓症链球菌产品中应用的报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用,脱氧胆酸具有替代抗生素发挥抗缓症链球菌的作用。
本发明提供了脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用。
优选的,所述产品包括缓症链球菌的抑菌剂和药物。
本发明提供了脱氧胆酸在制备预防和/或治疗由缓症链球菌感染引起的疾病的药物中的应用。
优选的,所述由缓症链球菌感染引起的疾病包括以下疾病中的一种或几种:中毒性休克综合征、亚急性心内膜炎、前列腺炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、唾腺炎、口面部感染、牙源性感染、中耳炎和鼻窦炎。
优选的,所述脱氧胆酸的结构式如式I所示;
优选的,所述缓症链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对缓症链球菌的MIC50为39.12μg/ml。
本发明提供了脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用。本发明首次试验证明,脱氧胆酸具有良好的抑制缓症链球菌活性,通过测定抑制50%受试菌所需最低抑菌浓度,结果表明,空白对照孔(即不含药物)内细菌明显生长,而脱氧胆酸针对缓症链球菌的MIC50为39.12μg/ml。由此可见,本发明提供的应用为临床医生防控缓症链球菌引起的疾病提供参考。
附图说明
图1为脱氧胆酸浓度与缓症链球菌生长抑制率关系图。
图2为脱氧胆酸浓度与咽颊炎链球菌生长抑制率关系图。
具体实施方式
本发明提供了脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用。
在本发明中,所述脱氧胆酸的CAS为83-44-3,分子式:C24H40O4,分子量:392.57,英文名称:deoxycholic acid,熔点:172-178℃。所述脱氧胆酸的结构式优选如式I所示;在本发明实施例中,所述脱氧胆酸购自Sigma公司,产品编号为30960。
在本发明中,所述产品优选包括缓症链球菌的抑菌剂和药物。所述缓症链球菌的抑菌剂优选包括脱氧胆酸和乙醇溶剂。所述缓症链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对缓症链球菌的MIC50为39.12μg/ml。
本发明提供了脱氧胆酸在制备预防和/或治疗由缓症链球菌感染引起的疾病的药物中的应用。
在本发明中,所述由缓症链球菌感染引起的疾病优选包括以下疾病中的一种或几种:中毒性休克综合征、亚急性心内膜炎、前列腺炎、肺炎、心包炎、腹膜炎、唾腺炎、口面部感染、牙源性感染、中耳炎和鼻窦炎。
本发明对所述药物的剂型没有特殊限制,采用本领域所熟知的药物的剂型即可,例如注射剂、粉剂等。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制,采用本领域所熟知的药物的制备方法即可。所述缓症链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对缓症链球菌的MIC50为39.12μg/ml。
下面结合实施例对本发明提供的脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
药品来源说明
1.供试品
名称:脱氧胆酸,市售品。
分子量:392.57g/mol。
产品编号:30960;品牌:Sigma。
供试品临用前用乙醇配制成最大浓度20mg/mL,依次对倍稀释。
2.对照品
名称:氯霉素,市售品。
产品编号:56757;品牌:MACKLIN。
实施例1
测试菌株及其培养方法
1.菌株:缓症链球菌ATCC49456
2.菌种来源:购于北京百欧博伟生物技术有限公司。
3.培养条件:Todd-HewittBroth,37℃孵育24h~48h。
4.菌种开启接种并培养
用75%酒精棉擦拭甘油管外部,不用完全融解,在甘油菌表面蘸取少量涂板,37℃培养24小时后,挑取单个菌落于THB液体培养基中在相同的培养条件下培养增菌。
5.菌液工作液的准备
当OD600值达到0.5左右(约108CFU/ml),经THB肉汤梯度稀释(0、10、100、1 000、10000、100000、10000倍)后,取100μL菌悬液接种于固体培养基上,培养24h后计数活菌数,计算菌悬液浓度,再将此混悬菌液进行稀释,使菌悬液最终浓度约为2×16CFU/ml。菌种操作均在无菌条件下进行,实验完毕,所有耗材经灭菌再做丢弃处理。
实施例2
抑制50%受试菌所需最低抑菌浓度(MIC50)的测定
1.测试方法:采取微量肉汤稀释法,进行MIC50的测定
实验分为阳性对照组(即不含药物的菌悬液)、阴性对照组(含溶媒乙醇的培养基)和实验组(含不同浓度的脱氧胆酸菌悬液)。以上各组均设置3个平行组。将浓度为400μg/ml的脱氧胆酸实验液按对倍稀释溶于液体培养基中,使其终浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、0μg/ml。浓度为2×106CFU·mL-1菌悬液与各组药液按比例1:1各100μL,分别接种于无菌96孔板中,使菌悬液的终浓度为1×106CFU/ml(含105CFU/孔),置于适当的培养条件下培养20h。同时设置对照品氯霉素,使其终浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0μg/ml。培养结束后,在黑色背景下进行肉眼观察,平皿内未见细菌生长的最低药物浓度即为脱氧胆酸的最低抑菌浓度(MIC)。所有菌种的MIC测定实验重复3次。悬浮菌体测OD600值,不同浓度的供试品及对照抑菌率按照公式(1)计算得到,通过曲线拟合得函数计算而得MIC50。
抑菌率(%)=1-(供试品OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100% 公式(1)
2.结果判断
试验结果见表1,抑制率图见图1。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长,试验才有意义。
表1:不同浓度脱氧胆酸对缓症链球菌生长影响的吸光值测定
结果显示,阳性对照孔(即不含药物)内细菌正常生长,阴性对照孔内培养基中无菌生长。对照品氯霉素对缓症链球菌的MIC50值为4μg/ml,符合美国临床实验室标准化委员会(National committee for clinical library standardization,NCCLS)2001年的《抗微生物药物敏感试验的执行标准:第十一版信息增刊》M100-S11中氯霉素对缓症链球菌≤4μg/ml的标准,说明本实验方法是可靠的。
统计结果表明:脱氧胆酸对受试的缓症链球菌的MIC50为39.12μg/ml。综上所述,脱氧胆酸有良好的抑制缓症链球菌活性。上述研究结果以期为临床医生防控缓症链球菌引起的疾病提供参考。
对比例1
一.测试菌株及其培养方法
1.菌株:咽颊炎链球菌ATCC 9895
2.菌种来源:购于购于宁波明舟生物科技有限公司。
3.培养条件:Brain-Heart Infusion(BHI),37℃孵育24h~48h。
4.菌种开启接种并培养
用浸过75%酒精的脱脂棉擦净安瓿管,用火焰加热其顶端,滴少量(2-3滴)无菌水至加热顶端使之破裂,用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍,用无菌吸管吸取0.3ml的无菌水,滴入冻干管中,轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液,接种在培养基上,37℃培养24小时后,挑取单个菌落于液体培养基中在相同的培养条件下培养增菌。
5.菌液工作液的准备
当OD600值达到0.4左右(约108CFU/ml),经BHI肉汤梯度稀释(0、10、100、1000、10000、100000、10000倍)后,取100μL菌悬液接种于固体培养基上,培养24h后计数活菌数,计算菌悬液浓度,再将此混悬菌液进行稀释,使菌悬液最终浓度约为2×106CFU/ml。菌种操作均在无菌条件下进行,实验完毕,所有耗材经灭菌再做丢弃处理。
二.不同浓度的脱氧胆酸对不同受试菌的抑菌率测定
1.测试方法:采取微量肉汤稀释法,进行抑菌率的测定
实验分为阳性对照组(即不含药物的菌悬液)、阴性对照组(含溶媒乙醇的培养基)和实验组(含不同浓度的脱氧胆酸菌悬液)。以上各组均设置3个平行组。将浓度为400μg/ml的脱氧胆酸实验液按对倍稀释溶于液体培养基中,使其终浓度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、0μg/ml。浓度为2×106CFU·mL-1菌悬液与各组药液按比例1:1各100μL,分别接种于无菌96孔板中,使菌悬液的终浓度为1×106CFU/ml(含105CFU/孔),置于适当的培养条件下培养20h。同时设置对照品氯霉素,使其终浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0μg/ml。培养结束后,在黑色背景下进行肉眼观察,平皿内未见细菌生长的最低药物浓度即为脱氧胆酸的最低抑菌浓度(MIC)。所有菌种的抑菌率测定实验重复3次。悬浮菌体测OD600值,不同浓度的供试品及对照抑菌率按照公式I计算得到。
2.结果判断
试验结果见表2,抑制率图见图2。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长,试验才有意义。
表2脱氧胆酸对咽颊炎链球菌生长影响的吸光值测定
结果显示,阳性对照孔(即不含药物)内细菌正常生长,溶媒对照培养基孔无菌生长。对照品氯霉素对缓症链球菌的MIC值为4μg/ml,符合美国临床实验室标准化委员会(National committee for clinical library standardization,NCCLS)2001年的《抗微生物药物敏感试验的执行标准:第十一版信息增刊》M100-S11中氯霉素对缓症链球菌≤4μg/ml的标准,说明本实验方法是可靠的。
统计结果表明:当脱氧胆酸浓度为200μg/ml时,其对受试的咽颊炎链球菌的抑制率为73.60%。
可见,脱氧胆酸对不同种类的菌的抑制活性表现出较大的差异。当脱氧胆酸浓度为200μg/ml时,其对受试的缓症链球菌的抑制率为96.75%,而其对受试的咽颊炎链球菌的抑制率为73.60%。这表明脱氧胆酸对缓症链球菌的抑菌活性优于咽颊炎链球菌。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和修饰,这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.脱氧胆酸在制备抗缓症链球菌的产品中的应用,所述产品为缓症链球菌的抑菌剂;
所述缓症链球菌为缓症链球菌ATCC49456菌株;
所述抑菌剂中脱氧胆酸的浓度不低于200μg/ml。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述脱氧胆酸的结构式如式I所示;
式I。
3.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述缓症链球菌的抑菌剂中脱氧胆酸对缓症链球菌的MIC50为39.12μg/ml。
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口腔連鎖球菌の生育ならびにグルカン生成に及ぼす胆汁酸の影響;石川康子等;《口腔衛生学会雑誌》;第34卷(第2期);第97-103页,第98页右栏末段,表1 * |
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